免疫分析方法20070321

免疫学反应原理

单扩散

琼脂糖凝胶平板→打孔→点加样本→孵育(过夜) →观察沉淀线

可以定性，也可以定量应用：检测抗原抗体。如免疫球蛋白测定

双扩散

琼脂糖凝胶平板→打孔(两两对应)→点加样本及对应抗原或抗体→孵育(过夜) →观察沉淀线

一般用于定性，也可观察抗原抗体有无交叉反应。如抗原抗体的鉴定

免疫沉淀

在试管中加入抗原及抗体，混匀后孵育，观察沉淀的出现

环状沉淀：毛细管内进行。如链球菌的血清学分型

对流电泳

操作类似于双扩散。但在两侧施加电场，以加快免疫反应的速度。

适用于抗原抗体检测。如乙肝表面抗原的检测

火箭电泳

类似于单扩散，但外加了电场，孔内所加抗原向一特定方向迁移，且迁移沉淀线的长度与抗原的浓度成正比，故可以定量。如甲胎蛋白的检测。

血球凝集试验

将抗体或抗原结合在动物红血球（羊、牛、兔等）上（致敏），当致敏的红血球与相应抗原或抗体相遇时，发生肉眼可见的凝集。也可制备反向血凝或血凝抑制试验。

血球在致敏前需要进行处理（鞣化），使之不易破坏，也更容易致敏。

如乙肝表面抗原的检测：成本低廉，检测灵敏度也高。

乳胶凝集

原理同血球凝集试验，但致敏的是乳胶颗粒，且试剂更易保存。如细菌抗原的快速检测试剂。

补体结合试验

在抗原抗体反应的体系中加入新鲜制备的补体（豚鼠）以及指示系统（红细胞），当有相应的抗原抗体存在并发生反应时，激活补体，红细胞溶解。若加入与人体的被测抗体相竞争的抗体时，被测抗体消耗掉大量抗原，而无能与指示系统中的抗体反应的抗原剩余，补体不被激活，红血球不被溶解：补体结合抑制试验。

如抗链O检测

金标记试验

以胶体金致敏抗原，当遇相应抗体时，与之结合并吸附在支持介质上，浓集后形成可见的红色。一般用于快速试验，卡片式的反应体系方便易用。但敏感性和特异性不足。

也有用胶体硒的。如表面抗原、抗HIV等

免疫斑点试验

原理与金标记法类似，但标记的是酶，在抗原抗体结合后，标记在上面的酶可催化随后加入的显色系统，以出现黑色斑点为阳性。

免疫印迹

先将微生物抗原电泳分离，再通过免疫转印技术将琼脂上的抗原转染到硝酸纤维膜上并固定（可裁成小条供多个检测用）。测定时加入人血清，血中抗体与膜上的抗原结合，再加入标记的抗体或生物素系统，最后是显色。与相应特异抗原结合的位置上的显色即代表了有对应该相应抗原的抗体。特异性较高。

如：抗HIV检测

免疫比浊

原理是在一定的反应体系中，抗原抗体的反应速度与其浓度相关。测定体系中抗原抗体反应所引起的浊度变化速率即可间接测定体系中抗原或抗体的浓度。一般用于全自动的免疫分析仪。如免疫球蛋白的检测。放射免疫

一般为竞争法：以放射性元素标记抗原，与待测抗原共同竞争与同时加入的抗体的结合，待测抗原越多，与抗体结合的标记抗原越少，存留的放射性就越低。

抗原的标记：琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羟胺法

放射性元素的选择：碘125、碘131、氢3等。检测放射性：γ计数仪

酶免试验

方法可有三明治夹心法、竞争抑制法、间接法、捕获法。

首先用抗体或抗原包被酶标板，加入待测标本，再加入用酶标记的抗原或抗体，也可以同时加入竞争的抗原或抗体，经过孵育、洗板的过程，最后显色，显色的程度与标本中抗原或抗体的浓度成正比或反比（竞争法）。

板、抗原、抗体、酶、酶的标记、洗涤、显色

化学发光：在反应体系中的物质通过化学反应生成一种激发态的中间产物，该产物在回到基态时可放出一个光子。检测该光子即可间接测定反应体系中的物质浓度。一般是将可发生发光反应的物质标记在抗体上。

常用的发光物质有：鲁米诺类、咪唑类、吖啶酯类、苯酚类及芳香草酸酯类。

电化学发光：发光试剂标记物是三联吡啶钌N羟基琥珀酰胺酯（NHS），另一个试剂是三丙胺（TPA）。在阳极表面，上述两种试剂可同时失去电子发生氧化反应，二价的NHS标记物被氧化成三价，TPA被氧化成TPA+，TPA+极易转为强还原剂的自由基，将一个电子转给三价NHS标记物质，使其变为激发态，激发态标记物可发射一个光子后回到基态。二者然后再参与下一轮反应。

应用：NHS可与蛋白、半抗原激素、核酸等各种化合物结合，故应用广泛。

免疫荧光：荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光的能量后，分子呈极不稳定的激发态，在回到基态时，可以发出比激发光波长的荧光。

荧光素：异硫氰酸荧光素FITC，四乙基罗丹明RB200，四甲基异硫氰酸罗丹明TRITC

一般用在固相的方法上，如组织染色、荧光抗体法玻片检测微生物抗原。

流式细胞仪：是将流体喷射技术、激光技术、空气技术、γ-射线能谱技术及电子计算机技术与显微荧光光度结合的一种大型精密仪器。它能过测量在一定波长的激光激发快速流动的粒子（细胞或微粒）发出的荧光和散射光来获得粒子的一些成分及其变化情况，并可对特定的细胞群体进行筛选。

抗原的制备

天然抗原：蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、细菌毒素、酶及补体等

对天然抗原需进行分离（组织匀浆、酶消化等）纯化纯化的方法有：盐析、层析等。

人工抗原：多糖、多肽、甾体类激素等，需与载体结合才具有免疫原性。

连接的方法有戊二醛法、碳二亚胺法、琥珀酰亚胺吡啶二硫酚丙酸法等。

基因工程：特定抗原片段的表达、根据核苷酸序列推导合成相应编码的多肽抗原。

抗体的制备

沉淀：盐（或无水乙醇、辛酸等）沉淀→离心→透析去盐→分装保存

层析：分子筛层析、离子交换层析、亲和层析

单克隆抗体：每个B淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特异性抗原决定簇的抗体，但淋巴细胞不能在体外无限期地分裂传代。正常细胞的DNA合成有两条途径，一条主要途径，一条旁路。杂交瘤细胞培养液中加入了（次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷）HA T三种药物，A可拮抗叶酸（主途径），而骨髓瘤细胞是筛选过的缺乏旁路必需的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），它只有和淋巴细胞结合以后才能通过旁路合成DNA生存下去。单独的淋巴细胞也只能存活数代。这样，杂交以后经过数代体外培养，培养孔内生能生存下来的细胞克隆就是二者杂交的克隆。检测这些克隆的培养上清中有无抗体即可探知杂交是否成功。

基因工程：将能编码产生抗体的基因片段植入大肠杆菌或其它载体中，经大量培养，提取所需抗体。

标记物

ABC系统：avidin-biotin-peroxidase complex （链亲和素-生物素-过氧化酶-复合物）：生物素分子量较少，很容易将抗体生物素化。亲和素分子量较大，一个亲和素可以结合数个生物素，二者的亲和力高且特异性好，可形成一个网状的结合。主要用来增加抗原抗体的结合及放大反应。亲和素一般用卵白亲和素、链亲和素孵黄亲和素以及类亲和素。

SPA：葡萄球菌A蛋白，是葡萄球菌菌壁上的一种不含糖的蛋白质，能与多种哺乳动物IgG的Fc段结合，常作为第二抗体的代用品。与SPA的亲和力顺序为猪、狗、人、猴、豚鼠、小鼠、牛。

乳胶血球酶放射性元素

抗原抗体反应体系与未反应成份的分离：

板吸附→洗涤纤维素膜→渗透洗涤磁珠结合

均相反应：已反应的抗原抗体分子的空间结构发生改变→影响活性或结合能力