食品添加剂乳铁蛋白的质量规格要求、生产使用工艺和检验方法,食品中该添加剂的检验

资料四
乳铁蛋白
食品添加剂的质量规格要求、生产使用工艺和检验方法，食品中该添加剂的检验方法或相关情况说明
内蒙古伊利实业集团股份有限公司
一、乳铁蛋白质量规格要求
（一）感官指标
（二）理化指标
（三）微生物、污染物及真菌毒素指标
二、检验方法
（一）用反相高效液相层析法测定乳铁蛋白的纯度
1. 样品准备
对粉状乳铁蛋白，称出20 mg乳铁蛋白样品，用MilliQ水配成20 mL，1
mg/mL的乳铁蛋白溶液，再通过0.2 μm的乙酸纤维素膜进行过滤。

2. 材料和试剂
（1）MilliQ水（超纯水18 megohm resistivity）
（2）95%的乙腈(氰化甲烷)（HPLC 级）
（3）1%的三氟乙酸（TFA）
2.1 缓冲液准备
（1）缓冲液A：100% MilliQ水
把1 L MilliQ水装在1 L 的SCHOTT瓶中。

（2）缓冲液B：95%的乙腈
分别量取50 mL MilliQ水和950ml乙腈。

把二者混合，通过0.45 μm的滤膜进行过滤。

储存在1 L的SCHOTT瓶中。

（3）缓冲液C：1%的三氟乙酸
用移液管量取25 mL三氟乙酸放入200 mL MilliQ水中，用MilliQ水补至250 mL。

转移到250 mL的SCHOTT瓶中储存。

3. 仪器设备
（1）水基线体系控制和获得数据的设备（Empower）
（2）水2695分离组件和2487双λ吸收检测器
（3）反相高效液相层析柱---Alltech prosphere C4 300A 150mm × 4.6mm,
with Alltech All-guard Guard 7.5 × 4.6mm.
4. 高效液相层析的测量方法
4.1 注射体积
50 μL已过滤的乳铁蛋白样品或空白液注入柱中供分析。

4.2 梯度表
4.3 温度
柱子温度=35°C
样品温度=10°C
4.4 检测
在波长280 nm处检测乳铁蛋白，乳铁蛋白的洗脱时间大约9.7分钟。

5. 过程与计算
5.1 用Empower软件，用样品的层析谱减去空白溶液。

5.2 结合整个样品的层析谱，算出全部蛋白的含量。

然后结合乳铁蛋白的高峰区算出乳铁蛋白的百含量（以蛋白质为基数）。

5.3 用下面的计算公式计算乳铁蛋白的百分含量（干重）：
乳铁蛋白的百分含量(干重)=[蛋白含量/(100 - 水分)]×乳铁蛋白的百分含量其中：蛋白含量是用凯氏定氮法测定的蛋白含量
乳铁蛋白的百分含量是用高效液相层析法测定的乳铁蛋白含量（二）乳铁蛋白铁饱和度的测定
1. 原理
通过向乳铁蛋白水溶液中逐渐加入等分量的三价铁离子溶液直至乳铁蛋白铁饱和。

该过程中乳铁蛋白铁饱和度的变化在465 nm分光光度计下进行检测，当吸光值不再变化的时候说明乳铁蛋白已经完全饱和。

2. 试剂
2.1 FeCl
3.6H2O
2.2 NTA (氨三乙酸)
2.3 NaH2PO4.H2O
2.4 Na2HPO4.12H2O
2.5 NaHCO3
2.6 NaOH
2.7 NaCl
3.溶液的配置
3.1 配置含有10 mM氯化铁和0.1 M HCl的溶液：
（1）在100 mL容量瓶中分别加入：
- 0.83 mL 37%的HCl
- 0.270 g的FeCl3.6H2O (准确称量)
（2）加蒸馏水至100 mL刻度处
3.2 配置40 mM Na-NTA溶液：
在100 mL容量瓶中分别加入:
- 0.764 g的NTA
- 加入大约20 mL去离子水
- 缓慢加入1 M的NaOH溶液来溶解NTA粉末(以形成可溶的NTA钠盐)
- 将1M的NaOH逐滴加入，每加入一滴并充分混合直至NTA完全溶解3.3 配置含有5mM FeCl3.6H2O和20 mM NaNTA的溶液
- 将等量（各20 mL）的3.1和3.2溶液混合
- 用10 M的NaOH溶液将溶液的pH值调至4-6之间（例如：4.5），但要注意尽可能少的将溶液稀释）
3.4 0.1M NaHCO3的配置
将8.401 g的NaHCO3加入1升蒸馏水中。

3.5 2%乳铁蛋白水溶液的配置
- 将0.8 g乳铁蛋白粉末溶解于40 mL蒸馏水中
- 搅动直至完全溶解
4.铁饱和度的测量
可以用所配置溶液来测定pH值和在600 nm时的透光率，溶液必须经过0.45 μm millipore过滤器过滤
- 将1mL乳铁蛋白溶液注入比色皿
- 加入1.5 mL 0.15M NaCl和200 μL的0.1 M的NaHCO3溶液
- 在465 nm下测量溶液的吸光值
- 加入10 μL等量的溶液3.3。

每加一次，充分混合并在465 nm下测量吸光值，直到吸光值变为恒定，也就是说乳铁蛋白趋于饱和。

5.结果的表达
以纵坐标为吸光值，横坐标为等量三价铁离子浓度作图。

直线(1)为当乳铁蛋白趋于饱和时的吸光值。

直线(2)为以初始乳铁蛋白吸光值为原点到铁饱和时吸光值的连线。

将直线(2)反向延长使其与横坐标交汇。

乳铁蛋白初始铁饱和度可以通过以下两种方法计算得出：
（1）通过465 nm 下最初的吸光值(b1)与饱和时溶液的吸光值(b2)的比值计算得出：
1
%1002
b b =
⨯乳铁蛋白铁饱和度（） （2）通过初始乳铁蛋白中三价铁离子的微摩尔数(a1)和饱和乳铁蛋白中三价铁离子的微摩尔数(a)的比值得出：
a %=
100⨯1
乳铁蛋白铁饱和度（）a
备注：一等份也就是每10 μL 的三价铁离子溶液=0.05 μm ol Fe 3+ 6. 乳铁蛋白浓度测定
考虑到1 mol 的乳铁蛋白可以结合2摩尔的三价铁离子，因此溶液中乳铁蛋白的摩尔数应该是铁离子摩尔数的二分之一。

μmol 乳铁蛋白= 0.5×μmol Fe 3+ 乳铁蛋白分子量= 77,000
因此，77,000×μmol 乳铁蛋白×10-6= 检测溶液中乳铁蛋白的质量（g ）。

（三）乳制品中乳铁蛋白含量的检测
第一部分 高效毛细管电泳测定乳制品中乳铁蛋白含量
A.1 适用范围
本方法适用于乳粉和乳铁蛋白原料中乳铁蛋白的定性和定量分析。

A.2 原理
试样经处理后进入毛细管中，在毛细管中充入缓冲溶液，两端加高电压，毛细管中形成电场。

样品中带电粒子在电场中以不同速度运动，流经检测器被检测，得到分离谱图，根据峰面积和浓度成正比的关系，计算不同成分的含量。

A.3 试剂
A.3.1 实验配制所用水均为超纯水。

A.3.2 乳铁蛋白标准品（Fluka ）。

A.3.3 氢氧化钠：1 moL/L 溶液。

A.3.4 硼酸（sigma）。

A.3.5 CsOH（50 %水溶液，北京百灵威化学技术有限公司）。

A.3.6 冰乙酸（优级纯）。

A.3.7 十二烷基硫酸钠(SDS，Sigma-Aldrieh，货号:L3771)。

A.3.8 羟乙基纤维素(HEC，Sigma-Aldrieh，货号:54290)。

A.3.9 HEC储备液的配制：HEC是一种淡黄色粉末状固体，首先准确量取100 mL超纯水置于试剂瓶中，将其放置在60 ℃水浴中加热，将准确称量的4 g HEC 逐步加入，涡旋混匀，待其完全溶解即配制成40 g/L的HEC储备液，放入4 ℃冰箱备用。

A.3.10 运行缓冲液：0.3 moL/L硼酸，其中含20 mmoL/L SDS和8 g/L HEC。

首先分别准确称取1.855g硼酸和0.577 g SDS放入100 mL容量瓶中，加入70 mL的超纯水，超声使其溶解，然后再加入20 mL质量浓度为40 g/LHEC储备液，涡旋混匀后用1 moL/L的CSOH调节pH值到8.80，最后用超纯水定容到刻度线，室温放置备用。

A.3.11 样品缓冲液：0. 05 moL /L HAC。

准确移取 1.437 mL冰醋酸置于500 mL 容量瓶中，用超纯水定容到刻度，放入4 ℃冰箱备用。

A.4 仪器
A.4.1 毛细管电泳仪（带有紫外检测器）。

A.4.2 电子天平。

A.4.3 pH计。

A.4.4 超声振荡器。

A.4.5 高速离心机
A.5 操作步骤
A.5.1 样品的前处理
分别称取一定质量的的样品于10 mL容量瓶中，加入适量样品缓冲液，涡旋混匀后，再用样品介质稀释定容到刻度，于9000 r/min离心10 min，取上清液分析。

A.5.2 测定
A.5.2.1 标准曲线的绘制
准确称取10 mg乳铁蛋白标准品于l mL样品管中，加入1.5 mL样品介质涡旋混匀后，制得10000 mg/L的乳铁蛋白标准储备液，放入4 ℃冰箱备用。

工作液由储备液经0. 05 mol/L HAc 稀释后制得。

准确移取10、20、40、80、160 mg/L质量浓度为5000 mg/L的Lf标准储备液于l mL样品管中，再分别加入990、980、960、920、840 mg/L样品缓冲液，混匀后即得50、100、200、400、800mg/L的工作液。

峰面积(A)与质量浓度(C，mg/L)在50~800 mg/L范围内具有良好线性关系，检出限(LOD)为15 mg/L。

A.5.2.2 试样测定
测定条件毛细管(50 um×57 cm，有效长度:50 cm，河北永年锐沣色谱配件有限公司)；分离电压:20kV；检测波长:214 nm；操作温度:25 ℃；进样压力：0.5 psi；进样时间:20 s。

每次实验完毕后，用运行缓冲溶液洗3 min，用1 moL/L氢氧化钠洗10-30 min，水洗3 min，抬高盖板使冷凝液回流后，关机。

使用新换的毛细管柱需要用水洗10 min，用1 moL/L氢氧化钠清洗30 min，水洗10 min，进行柱子的活化。

然后可以进行样品的测定。

(清洗压力均为20 psi) A.6 分析结果的计算
计算公式: X = C * N/m
式中：X——样品中乳铁蛋白的含量mg/kg；
C——从标曲中查得相应乳铁蛋白的含量mg/L；
M——称取试样的质量g；
N——稀释倍数×定容体积。

第二部分酶联免疫法
A.7 原理
本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。

将标准品、待测样本加入到预先包被牛乳铁蛋白（LF）单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。

依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中牛乳铁蛋白（LF）浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中牛乳铁蛋白（LF）含量。

A.8 试剂盒组成及试剂配制
A.8.1 酶联板：一块（96孔）
A.8.2 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1 mL，盖好后静置10 min以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100 ng/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成100 ng/mL,50 ng/mL,25 ng/mL,12.5 ng/mL,6.25 ng/mL,3.12 ng/mL,1.56 ng/mL其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0
ng/mL，临用前15 min内配制。

如配制15 ng/mL标准品：取0.5 mL 100 ng/mL的上述标准品加入含有0.5 mL样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推.
A.8.3 样品稀释液:1×20 mL/瓶。

A.8.4 检测稀释液A：1×10 mL/瓶。

A.8.5 检测稀释液B：1×10 mL/瓶。

A.8.6 检测溶液A：1×120 µL/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100 µL），实际配制时应多配制0.1～0.2 mL。

如1 µL检测溶液A 加99 µL检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

A.8.7 检测溶液B：1×120 µL/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释方法同检测溶液A。

A.8.8 底物溶液: 1×10 mL/瓶.
A.8.9 浓洗涤液:1×30 mL/瓶。

使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

A.8.10 终止液：1×10 mL/瓶（1 moL/L H2SO4）。

A.9 仪器和设备
A.9.1 37 ℃恒温箱。

A.9.2 酶标仪。

A.9.3 精密移液器及一次性吸头。

A.9.4 蒸馏水。

A.9.5 一次性试管。

A.9.6 吸水纸。

A.9.7 pH计。

A.9.8 离心机。

A.9.9 冰箱。

A.10 分析步骤
A.10.1 试样处理
称取10 g乳粉与三角瓶中，先用40 ℃左右温水30 mL溶剂样品后调pH4.6后转入50 mL容量瓶中定容。

将容量瓶放入4 ℃冰箱中1 h，取出于4000 r/min 离心
10 min，取上清液备用。

A.10.2 试剂盒操作步骤
A.10.2.1 准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30 min。

A.10.2.2 配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。

A.10.2.3 加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50 μL；待测样本孔中先加入待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。

A.10.2.4 温育：37 ℃水浴锅或恒温箱温育30 min。

A.10.2.5 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。

A.10.2.6 加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50 μL，空白对照孔不加。

A.10.2.7 温育：37 ℃水浴锅或恒温箱温育30 min。

A.10.2.8 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。

A.10.2.9 显色：每孔先加入显色剂A 液50 μL，再加入显色剂B液50 μL，平板混匀器混匀30 s（或用手轻轻震荡混匀30 s），37 ℃避光显色15 min。

A.10.2.10 测定：以空白孔调零，在终止后15 min内，用450 nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。

A.11 计算：
根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。

最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。

A.12 试剂盒注意事项
A.12.1 实验严格按照说明书的操作进行，实验结果判定必须以酶标仪读数为准。

A.12.2 酶标包被板开封后如未用完，应立即装入密封袋中加干燥剂保存。

A.12.3 建议所有的标准品、样本和空白对照都做双份检测，取平均值，以减小实验误差。

A.12.4 牢记样本已经稀释5倍，计算结果乘以5才是样本实际浓度。

A.12.5 本试剂盒定量范围为5-160 μg/L，超过此范围，为标准曲线延伸计算所得，不做为准确定量结果，请用特殊稀释液稀释后测定准确结果（5-160 μg/L范围内），乘以总稀释倍数即为样本最终浓度。

A.12.6 若显色过浅，可适当延长底物温育时间。

A.12.7 为避免交叉污染，标准品、样本和空白对照每加一个就要更换一次吸头；酶标工作液、样本稀释液和底物等公共组分，要悬臂加样，不得碰到微孔；不得重复使用封板膜。

A.12.8 试剂盒保质期内使用，不同批号的试剂不得混用。

A.12.9 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

三、乳铁蛋白生产工艺
全脂牛奶
离心分离，巴氏杀菌
脱脂牛奶<10℃
离子交换吸收<10℃
洗提
浓缩
乳铁蛋白
过滤
冷冻干燥
磨粉
包装
四、调制乳粉产品工艺流程图。