无菌室消毒灭菌操作规程

无菌室消毒灭菌操作规程
1、目的：
规范无菌室中检验工作的质量控制，确保检测结果准确可靠。

2、适用范围：
无菌室
3、操作规范：
3.1 无菌室日常消毒灭菌
无菌室无固定程序，但按一般操作应遵循如下规程：
3.1.1 操作间和缓冲室使用打开紫外线灯，照射杀菌。

3.1.2 穿上工作服及无菌工作帽、鞋，然后用消毒液洗手。

3.1.3每次无菌操作前，均用用75％的酒精棉球擦拭操作台及可能污染的死角，每次实验前应开启净化系统使运转至少1h以上，开启净化台，用紫外灯照射30分钟以上。

3.1.4如有菌液洒在桌上或地上，立即用5%石碳酸溶液或3％的来苏尔倾覆在被污染处至少30分钟，再进行高压蒸汽灭菌。

工作衣帽等受到菌液污染时，立即脱去，高压蒸汽灭菌后洗涤。

3.1.5每次工作完毕，生物安全柜或超净台内用75%酒精擦拭台面后，开启紫外线灯照射30min。

对用过的污染物品进行高压灭菌。

然后逐一关闭实验室送风和通风设备。

3.2无菌室定期消毒灭菌
3.2.1每两周用经过0.1%新洁尔灭或84消毒液（1:50）浸泡的纱布擦拭工作台、门、窗、桌、椅及地面等，两种消毒剂相互交替使用，然后用5%石炭酸水溶液喷雾消毒空气，最后用紫外灯杀菌半小时。

3.2.2如果无菌室长期不用，再使用前需用乳酸熏蒸1～2小时消毒，最后紫外灯杀菌半小时。

3.3无菌室的消毒灭菌，可采取以下几种方法：
3. 3.1用甲醛和高锰酸钾混合熏蒸：一般每平方米需40％甲醛10毫升、高锰酸钾8毫升，进行熏蒸。

使用时，先密闭门窗，量甲醛溶液盛入容器中、然后倒入量好的高锰酸钾，人员随之离开无菌室，关紧房门，熏蒸20—30分钟即可。

3. 3.2 乳酸熏蒸：乳酸4～5ml加等量水，使用酒精灯加热蒸发，密闭2～3h。

消毒时最适相对湿度60～80%，低于60%效果下降。

3.3.3 0.1％升汞水消毒：用0.1％升汞水浸过的纱布或海绵进行擦拭，或用喷雾器喷雾灭菌，使箱内的上下左右都沾上升汞水，手也可用升汞水消毒，并把袖子卷起来。

喷雾后 20～30分钟，箱内的杂菌和雾滴一起落到箱底被杀死，内部的空气就变得很清洁。

3.3.4 紫外线照射灭菌：在无菌箱中装一支200伏、3O瓦的紫外线灯管，每次开20～30分钟，就能达到空间杀菌的目的。

照射结束后，罩黑布半小时，以增强杀菌效果。

3.3.5 石炭酸喷雾：在每次接种之前，用5％石炭酸溶液喷雾，可促使空气中的微粒和杂菌沉降，防止桌面微尘飞扬，并有杀菌作用。

3.3.6 石灰揩擦：经常用药物熏蒸，易造成酸性环境，特别用甲醛和高锰酸钾熏蒸长久，污染往往越来越严重，预防办法可把各种药品交替使用，过一段时间（约五周）用石灰擦洗一遍。

实践证明，这样做效果很好。

3.4 常用消毒剂
现将常用的消毒药品及其配制、使用方法，介绍如下：
3.4.1 35％甲醛水溶液（HCHO）：又名福尔马林，使蛋白质变性。

用于无菌室的灭菌。

3.4.2 0.1％的升汞水（HgCL
3
）：能使蛋白质变性，抑制酶类。

0.1％升汞配制方法是称取升汞0.1克，用少许酒精溶解，再加水至100毫升即成。

用于无菌室、培养箱、培养皿四周表面以及手指的灭菌。

3. 4.3 石炭酸（C
6H
5
OH）：5％浓度喷雾后，能使蛋白变性沉淀。

石炭酸（苯
酚）50毫升，加水950毫升配成。

用于工作服、实验桌的灭菌，杀菌效果同升汞。

3.4.4 高锰酸钾（KMnO
4
）：氧化剂。

0.1％浓度能使蛋白质与氨基酸氧化，失去酶的活性，用于消毒，能抑制或杀死杂菌。

3 4.5乙醇（CH
3CH
2
OH）：又称酒精。

消毒以75％浓度的效果最好，它能使
蛋白质脱水变性，高浓度酒精会使蛋白质很快脱水凝固，消毒作用反而减弱。

3.4.6 新洁尔灭：0.1％新洁尔灭用于培养箱、无菌室的灭菌。

3.4.7漂白粉水：取漂白粉10克，加水140毫升配成。

通常在使用前临时配制，静置1～2小时，取上清液喷射，进行室内消毒，每平方米用1升。

也可用84消毒液按说明书配制。

3.4.8药皂：煤酚皂、硼酸皂等各种药皂的水溶液，均可用于器具、橡皮塞及手指的消毒。

3.4.9 2％硫酸铜溶液：用硫酸铜（胆矾）2克，加水至 100毫升加热溶解配成。

用于床架、木架等各种菌种架的消毒，还可用5％硫酸铜溶液。

3.4.10 0.5％波尔多液：先用硫酸铜1斤，溶于100斤水，再用石灰1斤，加水100斤。

然后等量混合起来即成。

用于菌种架、段木的消毒。

3.4.11多菌灵：用于杀灭真菌、半知茵。

1：800倍拌料或 1：500倍喷洒均可。

3.5无菌室空气灭菌效果验证方法（沉降法）
定期检验无菌室空气污染情况，对改进灭菌措施，提高空气质量是非常必要的。

常用方法步骤如下：
3.5.1在消毒处理后与开展检验工作之前期间采样。

3.5.2取样点的选择应基于人员流量情况和做实验的频率。

一般情况下，无菌室面积≤30m2时，从所设定的一条对角线上选取3点，即中心1点，两端各距离1m处取1点；无菌室面积≥30m2时，选取东、南、西、北、中5点，其中东点、南点、西点、北点距墙1m。

3.5.3在所选位点，将平板计数琼脂平板（90mm）或水化3M Petrifilm TM菌落总数测试片置于距地面80cm处，开盖暴露15min,然后，置于36℃±1℃恒温培养箱培养48h±1h。

如果侦查某目标细菌，则可用选择琼脂性平板（如PDA平板）或微生物测试片（如3M Petrifilm TM环境李斯特氏菌测试片）。

3.5.4确认平板上的菌落数，如大于所设定的风险值，应分析原因，并采取适当措施，记录《洁净室监测计划及监控记录》、《生物安全柜及超净台监测计划及监控记录》。

如霉菌较多时；可先用5％石炭酸全面喷射后，再用甲醛熏蒸。

如细菌较多时，可采取用乳酸和甲醛交替熏蒸的办法加以杀灭。

4、依据：
4.1《病原微生物实验室生物安全管理条例》
4.2《实验室生物安全通用要求》（GB 19489-2004）
4.3 卫生部《人间传染的病原微生物名录》
4.4《实验室质量控制规范食品微生物检测》（GB/T 27405-2008）
5、相关记录：
5.1《洁净室监测计划及监控记录》
5.2《生物安全柜及超净台监测计划及监控记录》。