反相高效液相色谱法测定环境有害物质—酚酞含量的研究

１ 实验 部分
１ １ 仪 器 、 剂 与标准 品 ． 试 美 国安捷 伦公 司 Ａ ｉｎ ２０Ｉｆ ｉ Ｐ Ｃ， ｇｅｔ ６ ｎｉｔ Ｈ Ｌ 配 ｌ １ ｎｙ Ｄ Ｄ光 电二 极管 阵列 检测 器 。 Ａ
Ｋ ５０ Ｄ Ｑ ２ ０ Ｂ型超声 波仪 （ 山市 超 声 仪 器 有 限 昆
添加 了 １ ％磷 酸 （ Ｏ ） 冲盐 ， 的添 加 了 ０ ５ Ｈ Ｐ 缓 有 ． ％
公 司制造 ，０ ＨＺ 功率 ：ｏ ｗ） ４Ｋ ， ２ｏ 。
甲醇（ Ｐ Ｃ色谱纯）德国默克公司 Ｍ ｒ 制造。 ＨＬ ， ｅｋ ｃ
酚 酞标 准 品 ， 国 Ｄ ． ｈｅ ｓ ｒ ｒ 司制 造 ， 德 ｒ Ｅ ｒｎｔ ｆ 公 ｏｅ 纯
方 法开 发 的 中间步骤 可 以多设 几步 流 动相 组分
依次改变的细化条件来 实现逐步优化 ， 现在 的方 向 是 ： 次调 高 甲醇组 分 ， 依 比较得 出最佳 色谱 峰形 。甲 醇 ： ＝ ０ ：０ ， 出的色 谱 图如 图 ５ 水 ９ ％ １％ 得 ：
图 ３ 文 献 中 酚酞 的标 准 紫 外 吸 收 光 谱 图
关键词 ： 反相高效液相色谱法 ； 等度洗脱 ； 酚酞 ； 超声萃取
中图 分 类 号 ： ６ ７ ７ ０ ５ ． 文献标识码 ： Ａ
０ 引 言
酚酞 被 欧盟化 学 品管理 局 （ Ｃ Ａ） 为 高度 关 ＥＨ 列 注物 质 （ Ｖ Ｓ ＨＣ） 一 ， 往 欧盟 的化 学 品 或 物 品 亡 之 销 Ｆ Ｌ 的 ＳＨ Ｖ Ｃ含 量 超 过 ０ １ 的 ， 会 被 通 报 或 召 回。 ．％ 将
一
３ 一
４％ ， ０ 流动 相流 速 ：ｍＬ ｍ ｎ 紫外 检 测 波长 Ａ未知 ， １ ／ ｉ，
量 不够 导致 Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ色谱 峰形 助 推 动 力 不 足 ， 而 不 从 够“ 尖锐 ” ！这 样 无助 于 降低 信 号 检 出 限 、 方法 检 出
只能 在 紫 外 区 间 任 意 设 置 一 个 。得 出 的 第 一 张 ＨＰ Ｃ谱 图如 图 １ Ｌ ：
４ ０ ｎ 步进 值 ： ｎ ０ ｍ， １ ｍ。
２ 结 果 与 讨 论
２ １ 流动 相及 色谱分 离条 件 的优 化 选择 ． 据查 文献 ， 多数 文献 报导 推荐使 用 甲醇／ 流动 水 相体 系 ， 比例有 的 ６ ％ ：０ ， 的 ７ ％ ：０ ， 的 ０ ４％ 有 ０ ３％ 有
限， 调高水相 比例如何 ？甲醇 ： ＝ ０ ： ％ ， 水 ５％ ５ ０ 进样 调 试 ， 出的 Ｈ Ｌ 得 Ｐ Ｃ谱 图如 图 ４：
图 １ 酚酞标样的色谱图 （ 甲醇 ： ＝ Ｏ ：０ 水 ６ ％ ４ ％）
１
２
３
４
５
６
７
０
图 ４ 干扰 物的色谱 图（ 甲醇 ： ＝ ０ ：０ ） 水 ５％ ５％
能满 足 “ 三度 ” 则再 配 制缓 冲盐 进行 优 化调 试 。另 ， 外可 通过 Ｄ Ｄ紫 外光 谱扫 描功 能 ， 定酚酞 的最 佳 Ａ 确
吸 收波长 Ａ。
ｍＬ系列 标 准 曲线 使用 溶液 。本文 采用 １ １ ／ ０ｘ ｍＬ浓 ｇ
度 点进 行 方法 开发 的源头 。
方 法开 发第 一 针 的摸 索 条 件 ： 甲醇 ： ＝ ０ ： 水 ６％
加“ 尖锐 点 ” 从 而 更 好 地 降 低 信 号 检 出 限 、 法 检 ， 方 出限 。从 第 一张 Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ色 谱 图来 看 ， 目标 化 合 物 峰
形出现前伸峰 ， １ｐ ｍ信号也不是很 高。经验告 且 ０ｐ
诉 我们 ： 明显 就是 甲醇／ 流动 相系 统某 一组 分含 很 水
过 滤至 ２ ｍＬ样 品瓶 中 ， Ｈ Ｌ 上 Ｐ Ｃ测试 。
本文作者使用反相高效液相色谱一光电二极管阵列 检测 器 （ Ｐ Ｈ Ｌ Ｄ Ｄ） Ｒ － Ｐ Ｃ－ Ａ 来测 定 酚酞 含 量 ， 化 色 优 谱分 离条 件后 ， 法检 出限 ＭＤ 方 Ｌ低 ， 且该 方法 简 单 、 灵 敏 、 确 、 速 ， 我 国产 品检 测 及 质 量控 制提 供 准 快 为
度 ：８０ ， ９ ． ％ 带标准物质证书。 １２ 标 准储 备溶 液 的准备 ．
根 据标 物证 书 纯 度 标 示 ， 确 称 取 ０ １２ ｇ酚 准 ．０ １ 酞标 准 品于 干净烧 杯 中 ， 入 １ｍ 加 ０ Ｌ色 谱 纯 甲醇 ， 超 声 助溶 ， 移 至 １０ Ｌ容 量 瓶 中 ， 转 ０ｍ 甲醇 润 洗 烧 杯 几 次 转 移 至 １０ 容 量 瓶 中 ， 容 至 刻 度 ， 成 ０ ｍＬ 定 即 １０ ｔ ／ ０ ｘ ｍＬ标准储 备液 ， 次 稀 释 成 １ ｇｍ ２ ／ ｇ 依 ／ Ｌ、 ｇ ｔ ｘ
１３ 样 品前处理 ． 取 代表性 的样 品 ， 碎 至 ２ ｍＸ ｍ 混匀 。称 剪 ｍ ２ ｍ， 取 样 品 １０ （ ． ｇ 精确 至 ０ ０ １ ） 品 ， 于 ５ ｍ ．０ ｇ 样 置 ０ Ｌ具塞
试管中， 加入 １ｍＬ甲醇 溶 液 ， 封 好 塞 子 ， 超 声 ０ 密 在
清洗器 中室 温提 取 ６ ｍ ｎ ０ ｉ。然 后 过 ０ ４ １ 过 滤头 ．５ ｍ ｘ
通过 查 阅酚酞 标 准紫 外 吸收 光谱 图 （ 图 ３ ， 见 ）
确定该色谱峰为 目标化合物色谱峰 ， 光谱图完全匹
配 。从 光谱 图 确 定 ２９ ｍ 为 第 一 特 征 灵 敏 度 吸 收 ２ｎ
峰 ，７ ｎ ２６ ｍ为第二特征灵敏度吸收峰。查看两条谱
线的 Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ色 谱 图 比较 得 出 ， 然 Ａ ２ ９ｍ 灵 敏 虽 ＝ ２ ｎ 度 是 Ａ ＝２６ ｍ 灵 敏 度 的 将 近 ６倍 ， Ａ ＝２９ ｍ ２ ７ｎ 但 ２ｎ ＨＰ Ｃ色 谱 图明显 杂质 峰较 多 ， ７ ｎ Ｐ Ｃ色 Ｌ Ａ ：２６ ｍ Ｈ Ｌ
— —
０５
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１５
２
２， ５
３
３５
砌’
图 ６ 酚酞标样 的色谱 图（ 甲醇 ： ＝１０ ：％） 水 ０％ ０
Ｌ ——
流 动相 系统 甲 醇 比例 已经 是 １０ 了 ， ０％ 峰形 尖
校 正曲线 Ｐ ｅｏ ｈ ａｉ预期 ｈｎｌ ／ ｌｏ ｐｈｅ 保 留时问 ：２ ５ ．６ ４
（０ ％ ） ０ 为单一流动相等度洗脱测定 。紫外 检测 波长 ＝ ７ ｎ 定 量波长 ） ２９ ｍ（ １ ２ ６ ｍ（ ／ ２ ｎ 辅助定性波 长） Ｔ Ｃ柱 温箱温度设置 为 ，Ｃ ３￣ ０Ｃ。标准 曲线线性范 围 １ ｇｍＬ～１０ｚ／ Ｌ 线性 方程 Ａ＝２ ．５ ３ Ｃ １９ ５ ８￥１ — ， Ｉ／ ￣ ０１ ｍ ， ｇ ７ ３ ０ ９ 一 ． ６０ ０ ２ 相关 系数 ０ ９ ９ ， ．９ ９ 最低检 出限 ０ ． ３ ｔ ／ Ｌ 平 均回收率 １ １ １ ， ７ａ ｍ ， ， ｇ ０ ． ％ 相对标准偏 差 Ｒ Ｄ为 ０ ０ ％ （ ＝１ ） Ｓ ．６ ｎ ０ 。
了一个 实用便 捷 的分 析检测 方法 。
１４ 高效 液相色 谱 条件 ．
色谱分 离柱 ： ｇ ｅｔ ｏｂｘＥ ｌ ｓ ｌｓＣ Ａ ｉ ｎ ｒａ ｃｉ ｅＰｕ ｌ Ｚ ｐ １ ８分 析柱 （ ． ｍ ２ ０ ４ ６ ｍｘ ５ ｍｍｘ ｔ ； 动相 ： ５ ｍ） 流 ｘ 甲醇 （ ０ ％ ） １０
为单一流动相等度洗脱 ， 流动相流速 ： ｍ ／ ｉ； １ Ｌ ｍｎ 紫 外检测 波 长 ：２ ６ ｍ（ 量 波 长 ） ２ ９ ｍ（ 助定 ７ｎ 定 ／２ ｎ 辅 性波 长 ） 带 宽 ：ｎ 狭 缝 ：ｎ Ｔ Ｃ柱 温 箱 温 度 ： ， ４ ｍ， ２ ｍ； Ｃ ３ ￣ 进样量 ： ｌ ；Ａ ０Ｃ； ２ ｘ Ｄ Ｄ光谱扫描波长 入 １０ ｍ～ ０Ｌ ： ｎ ９
甲醇 ＝（％等度 洗脱 ） ｌ ， 】 Ｄ
谱图杂质峰较少 ， 干扰较少 ， 故选择 Ａ ＝ ７ ｎ ２６ ｍ谱线 作为定量波长 ， 选择 Ａ ＝ ２ ｎ ， ２９ ｍ谱线作为辅 助定性
波长 。从 而 确定 最佳 吸 收波 长 。
’
接下来就是优化 Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ色谱峰形 ， 让色谱峰更
一
点 ” 甚 至直 接 来 个 １０ ， 而 将 色谱 峰形 推 动 ， ０％ 从
图 ２ 酚酞标样色谱 图（ １ 的紫外光吸收谱 图 图 ）
得更加“ 尖锐” 信号更高 ， ， 无扁头峰 、 前伸 峰、 拖尾 峰 ， 号检 出限 、 信 方法 检 出 限 自然 能降得 更 低 。但 一 个 要注 意 的前提 是 ： 能 将 目标 峰助 推 到 和 杂 质 峰 不 重 合在 一起 。
图 ５ 酚酞标样 的色谱 图（ 甲醇 ： ＝ ０ ：０ 水 ９ ％ １ ％）
色谱峰形变得 比较尖锐了， 信号也提高了 ， 但 仍 出现前 伸 峰 。改 为 甲醇 ： ＝１０ ：％ ， 出 的 水 ０％ Ｏ 得
色谱 图为 图 ６ ：
酚 酞 标 样 ｌＩ ｌ 谱 图 Ｏｔ 【 ． Ｊ 色
ＤＡＤｌＡ，Ｓｇ ２ ６ ｅ＝ ６ ，０ ｉ＝ ７ ， Ｒ ｆ３０ｌｏ ４
锐， 峰宽狭窄 ， 呈现出较 为对称 的高斯峰形 ， 同时信 号已经提高到最高 ， 再通 过点击峰顶点查看 ３ Ｄ光 谱图 ， 确定该 Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ色谱峰为酚酞 ， 无杂质干扰。从
而确 定 最 优 化 流 动 相 比例 为 ： 甲醇 ：１０ ， 度 洗 ０％ 等 脱 ，ｒｎ内完成 色 谱 分 离 ， 时 通 过 ３ 光 谱 图 来 ４ｉ ａ 同 Ｄ－ 进一 步辅 助 定性 判断 样 品是 阳性抑 还是 阴性 。 通 过最 优化 的 ＨＰ Ｃ色 谱 图 ， 步 判 断 最低 浓 Ｌ 初 度 点能 做 到 １ ｇｍＬ 下 面 将 作 标 准 曲线 线 性 范 围 Ｉ／ ， ￣
２ １ 牛 弟 ３别 ０ ２，
文章编号 ：０ ５ ３８ （０ ２ ０ — ０ ３ ０ １０ — ３ ７ ２ １ ）３ ００ — ５
反相高效液 相色谱法测 定环境有害物质一酚酞含量的研究
谭丙文 罗 志焕 盂庆保 邹振宇
（． １ 立创 （ 中山 ） 检测 技 术服务 有 限公 司 ， 中山 ５ ８ １ ； ． ２ ４ ５ ２ 周大福 珠 宝金行 （ 深圳 ） 限公 司 ， 有 深圳
ｍ 、 ｇ ｍ 、０￣／ Ｌ ２ １ ／ 、 ０ ｇ ｍＬ １０ ｇ Ｌ ５ ／ Ｌ １ １ ｍ 、０￣ ｍＬ ５ １ ／ 、０ ￣ ／ ｇ ｇ ｘ
冰醋酸（ Ａ ） 如此等等。本文作者方法开发思路 Ｈ ｃ， 为： 在力 求 保证 分 离 度 、 敏度 、 析 速度 的 “ 谱 灵 分 色 分离 三度 ” 大前 提 下 ， 量 简 化 流 动 相 的配 比组 的 尽 分， 因此项 目 组分较为单一简单 ， 先不采用缓 冲盐 ， 而采用甲醇／ 水流动相体系进行分离 ， 若调试后仍不
初步确定该图示的色谱峰为酚酞 ， 打上标记 ， 查 阅该色谱峰顶的紫外吸收光谱图为图 ２ ：
信号 降低 了， 通过查阅该 图的峰顶点 ３ Ｄ光谱
图并 比较上 图 ， 出该 色谱 峰并 不是 酚 酞 ， 外通 过 得 另 Ｏ —ｉ ｌ 在 线谱 图 窗 口观 察 ： ｎ ｌｅＰｏ ｎ ｔ 在设定 的分析 时 间 内， 目标 化合 物 Ｐ ｅｏｐｔａ ｉ ｈｎｌｈｈｌ ｎ没有 出峰 ， 是在 大 ｅ 而 约 １．０ ｎ出峰 。通 过 第 二 针 的谱 图我 们 可 以得 ２ ３ｍｉ 出 以下 结论 ： 动 相 体 系 甲醇 组 分 含 量 需 要 “ 猛 流 更
摘
５ ８８ ） １０ １
要： 本文研究并建立采用反相 高效液相 色谱法 （ Ｐ Ｈ Ｌ Ｄ Ｄ） Ｒ — Ｐ Ｃ— Ａ 测定环境 有害物 质—— 酚酞含量 的方法 。酚酞采
用色谱纯 甲醇 常温超声萃取 ， 谱分 离柱 为 Ａ ｉ ｎ ｏｂｘＥ ｌ ｓ Ｐｕ １ 析柱 （ ． ｒｍｘ ５ ｍ ５ａ ） 以色 谱纯 甲醇 色 ｇｅｔ ｒａ ｃｐｅ ｌｓＣ ８分 ｌ Ｚ ｉ ４６ ａ ２ ０ ｍｘ ｐｎ ，