猪血多肽对草鱼离体培养免疫细胞活性的影响

猪血多肽对草鱼离体培养免疫细胞活性的影响
贾睿;杜金梁;曹丽萍;徐跑;王佳豪;刘英娟;殷国俊;蒋火金;柏爱旭
【摘要】[目的]评估猪血多肽对草鱼的免疫增强作用,为进一步推广猪血多肽在水
产养殖中的应用提供参考依据.[方法]采用密度梯度离心技术分离纯化草鱼头肾细胞、巨噬细胞和外周血白细胞,分别体外暴露在不同质量浓度的猪血多肽(0、10、20、40、80 μg/mL)中作用24 h,然后测定草鱼外周血白细胞增殖、巨噬细胞呼吸爆发活性和头肾细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性,以探讨猪血多肽对草鱼体外培养免疫
细胞活性的影响.[结果]猪血多肽体外作用24 h后,有效促进了草鱼体外培养免疫细胞的免疫活性,且以80 μg/mL猪血多肽的增效作用最明显,能极显著促进外周血白细胞增殖和增强巨噬细胞氧呼吸爆发活性(P＜0.01),显著提高巨噬细胞氦呼吸爆发活性和头肾细胞SOD活性(P＜0.05).[结论]猪血多肽对草鱼非特异性免疫具有促进作用,且作用效果呈剂量依赖性.实际生产中,可将猪血多肽开发成一种免疫添加剂,以增强水产动物对疾病的抵抗能力,提高水产养殖效益.
【期刊名称】《南方农业学报》
【年(卷),期】2014(045)006
【总页数】5页(P1084-1088)
【关键词】猪血多肽;草鱼;外周血白细胞;巨噬细胞;头肾细胞;细胞增殖;呼吸爆发活性;SOD活性
【作者】贾睿;杜金梁;曹丽萍;徐跑;王佳豪;刘英娟;殷国俊;蒋火金;柏爱旭
【作者单位】南京农业大学无锡渔业学院,江苏无锡214081;中国水产科学研究院
淡水渔业研究中心/农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室/鱼类免疫药理学国
际联合实验室,江苏无锡214081;中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室/鱼类免疫药理学国际联合实验室,江苏无锡214081;中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业部淡水渔业和种质资源利用
重点实验室/鱼类免疫药理学国际联合实验室,江苏无锡214081;南京农业大学无锡渔业学院,江苏无锡214081;中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室/鱼类免疫药理学国际联合实验室,江苏无锡214081;南京农业大学无锡渔业学院,江苏无锡214081;南京农业大学无锡渔业学院,江苏无
锡214081;南京农业大学无锡渔业学院,江苏无锡214081;中国水产科学研究院淡
水渔业研究中心/农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室/鱼类免疫药理学国际联合实验室,江苏无锡214081;北京渔经生物技术有限责任公司,北京101100;淮安
出入境检验检疫局,江苏淮安223001
【正文语种】中文
【中图分类】S965.112
0 引言
【研究意义】活性肽是对机体生命活动有益或具有特定生理作用的肽物质，目前在水产动物养殖中被广泛应用，常作为饲料添加剂用于增强水产动物的免疫能力、抗氧化能力、抗菌能力及促进动物繁育、生长等（程远芳和宋代军，2003；李清等，2004，2005）。

猪血是我国最大的蛋白原之一，其营养价值很高，但血浆和血细胞中蛋白质分子量大、难消化，且适口性差（方俊，2006）。

以猪血为蛋白源，
通过现代生物技术将猪血中的球蛋白转化为小分子肽而获得的生物活性肽，在机体内溶解性好、黏度低、易消化吸收（Xin et al.，1996），且具有提高抗氧化能力、促进生长、提高免疫力等作用（Gauthier and Poulio，2003）。

因此，若能将猪
血提取物应用到水产养殖中，对推动我国水产动物的健康养殖、提高水产养殖业经济效益具有重要意义。

【前人研究进展】近年来，有关猪血深加工研究已有不少报道，主要是将大分子的蛋白质通过微生物发酵、酶降解等方法分解成小分子的活性肽（李豪等，2011）。

郭先锋（1999）采用YA9103曲霉发酵猪血，其发酵产物具有可替代鱼粉的作用。

猪血多肽（Peptides from swine blood，PSB）是将猪血发酵、微滤、超滤、喷雾干燥获得的活性肽混合物。

方俊等（2006）研究表明，猪血多肽对小鼠机体抗氧化能力有显著的增强作用。

江波（2006）研究发现猪血
多肽能提高小鼠特异性免疫和非特异性免疫能力。

此外，还有研究发现猪血多肽具有化解疲劳等作用（胡滨和陈一资，2011）。

在欧洲的一些发达国家和地区，猪
血作为蛋白源已被开发成肽类试剂、肽类药物、功能食品及食品添加剂（Maclean et al.，2010），如酸性多肽饮料、多肽强化奶粉等（In et al.，2002），其利用率在50%以上；而我国在猪血深加工、活性肽提取及应用方面的研究还相对滞后。

【本研究切入点】猪血多肽在小鼠等哺乳动物中的研究和应用已有较多报道，但在水产动物养殖中的应用研究鲜见报道。

【拟解决的关键问题】探讨猪血多肽对草鱼离体培养免疫细胞活性的影响，旨在评估猪血多肽对草鱼免疫能力的增效作用，为进一步推广猪血多肽在水产养殖中的应用提供参考依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料
试验用草鱼来自中国水产科学院淡水渔业研究中心渔场，体质健康无伤，6月龄，体重100±10 g，共100尾。

猪血多肽为分子质量＜1 ku的小肽混合物，购自北
京渔经生物技术有限公司。

L-15培养基、脂多糖（LPS）、D-PBS溶液、硅石-聚乙烯吡咯烷酮、佛波豆寇乙酸脂（PMA）、硝基蓝四氮唑（NBT）、链霉素/青霉素、肝素均购自美国Sigma公司；新生小牛血清（FCS）和细胞培养板购自美国Gibco公司；水溶性四唑盐（WST-1）够自碧云天生物技术研究所。

1.2 免疫细胞分离
1.2.1 草鱼头肾细胞分离随机取健康草鱼，以M-222麻醉后采血。

在无菌条件下，剖取草鱼头肾，研磨，研磨液以70μm细胞过滤器过滤，然后1000 r/min离心5 min，冷D-PBS洗涤两次，调整细胞浓度为107个/mL，加入24孔细胞板中，
每孔1.0 mL，置于27 ℃、5%CO2培养箱中培养备用。

1.2.2 草鱼头肾巨噬细胞和外周血白细胞分离参照Bayne（1986）和曹丽萍等（2008）的方法分离草鱼头肾巨噬细胞和外周血白细胞。

将分离的细胞浓度调整
为107个/mL，然后接种于96孔细胞板，每孔100μL，27℃培养2 h后洗去未
贴壁细胞，加入100μL的L-15培养基（含1%链霉素/青霉素+5%FCS），置于27℃、5%CO2培养箱中培养备用。

1.3 免疫指标检测
1.3.1 外周血白细胞增殖测定前期预试验结果显示，猪血多肽处理草鱼外周血白细胞24 h的效果最佳。

故将分离获得的外周血白细胞加入96孔细胞培养板中培养24 h后，加入含不同质量浓度的猪血多肽（10、20、40、80 μg/mL）培养基，
同时设空白对照（普通培养基）和阳性对照（500μg/mL LPS），作用24 h后检
测白细胞增值情况。

细胞活力通过WST-1试剂盒进行检测，即向经猪血多肽处理的96孔细胞培养板的每孔加10μL WST-1孵育2 h，混合均匀，在酶联免疫检测仪上（450 nm波长处）测定各孔光吸收值，4次重复，记录结果。

1.3.2 巨噬细胞爆发活性测定采用同样方法处理分离获得的巨噬细胞，其氧呼吸爆发活性和氮呼吸爆发活性均根据Yin等（2006）的方法进行检测，结果用吸光值
表示，4次重复。

1.3.3 头肾细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性检测将分离获得的头肾细胞加入24
孔细胞培养板中培养24 h后，加入含不同质量浓度的猪血多肽（10、20、40、
80 μg/mL）培养基，同时设空白对照（普通培养基）和阳性对照（500μg/mL
LPS），作用24 h后收集细胞上清液并检测超氧化物歧化酶（SOD）活性。

SOD 活性采用黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）进行测定，以每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U/mL）。

1.4 统计分析
试验数据采用SPSS 16.0软件包中的单因素方差分析（one-way-ANOVA）进行
处理，并进行样本间的多重比较分析。

2 结果与分析
2.1 猪血多肽对草鱼外周血白细胞增殖的影响
以不同质量浓度的猪血多肽作用24 h后，草鱼外周血白细胞的增殖情况见图1。

由图1可以看出，阳性对照组（LPS）能极显著诱导外周血白细胞增殖发活性
（P<0.01，下同），说明离体培养的细胞状态正常。

与空白对照组（CK）相比，猪血多肽能有效诱导草鱼外周血白细胞增殖，且随猪血多肽质量浓度的增加而逐渐升高，当猪血多肽质量浓度为80μg/mL时，极显著地促进了外周血白细胞的增殖。

图1 猪血多肽对草鱼外周血白细胞增殖的影响Fig.1 Effects of PSB on proliferation of peripheral blood leucocytesin grass carp不同小、大写英文
字母分别表示与空白对照组相比存在显著差异（P<0.05）或极显著差异
（P<0.01）。

下同Different lowcase and capital alphalets represented significant difference at 0.05 and 0.01 levels，respectively.Thesamewas applied in thesubsequent figures
2.2 猪血多肽对草鱼巨噬细胞呼吸爆发活性的影响
以检测巨噬细胞中的氧自由基和NO来评估细胞的氮呼吸爆发活性和氧呼吸爆发
活性。

由图2可以看出，与空白对照组（CK）相比，40和80μg/mL的猪血多肽能显著提高草鱼巨噬细胞的氮呼吸爆发活性（P<0.05，下同），而10和
20μg/mL两处理的作用效果不显著（P>0.05，下同）。

由图3可以看出，草鱼
巨噬细胞氧呼吸爆发活性在40μg/mL猪血多肽处理组中显著升高，在80μg/mL 处理组中极显著升高。

图2 猪血多肽对草鱼巨噬细胞氮呼吸爆发活性的影响Fig.2 Effects of PSB on nitrogen respiratory burst activity of grass carp head kidney macrophages 图3 猪血多肽对草鱼巨噬细胞氧呼吸爆发活性的影响Fig.3 Effects of PSB on oxygen respiratory burst activity of grasscarp head kidney macrophages 2.3 猪血多肽对草鱼头肾细胞SOD活性的影响
由图4可以看出，与空白对照组（CK）相比，阳性对照组（LPS）对草鱼头肾细胞SOD活性没有影响，表明LPS对头肾细胞中的SOD无诱导作用。

在猪血多肽处理组中，头肾细胞SOD活性随着多肽质量浓度的增加而升高，其中在
80μg/mL的多肽处理组中出现显著差异。

图4 猪血多肽对草鱼头肾细胞SOD活性的影响Fig.4 Effects of PSB on SOD activity of grass carp head kidney cells
3 讨论
白细胞是鱼类血液中重要的免疫细胞，具有吞噬病原菌、抵御病原体入侵的作用。

在水产动物非特异性免疫研究中，白细胞增殖能力常作为标志性指标，用以评价免疫增强剂的作用效果（吴旋等，2011）。

Cao等（2008）将离体培养的鲤鱼白细胞用香菇多糖处理24 h，发现白细胞增殖能力显著加快，表明香菇多糖对鲤鱼免疫能力有积极的促进作用。

白东清等（2011）以枸杞多糖为饵料添加剂饲喂黄颡鱼，连续投喂8周后发现黄颡鱼白细胞数量明显增多。

本研究以猪血多肽处理离体培养的草鱼白细胞，结果显示，20、40和80 μg/mL的猪血多肽有效提高了白细胞的增殖能力，即提高了机体对自由基等有害物质的吞噬和清除能力，从而增强了草鱼的非特异性免疫能力。

巨噬细胞也是鱼类重要的免疫细胞，其活性和功能是评价鱼类免疫水平的重要指标
（Cheng et al.，2008）。

呼吸爆发是巨噬细胞杀菌的主要途径之一，在免疫过
程中起重要作用（Belo et al.，2005）。

超氧阴离子（）是氧呼吸爆发的最早产物，因此水平代表了氧呼吸爆发的强弱（Weeks and warinner，1984）。

NO是近年来新发现的信使分子和免疫调节因子，也是巨噬细胞氮呼吸爆发的产物之一（Mayer and Hemmens，1997）。

有研究表明，NO可抑制杀伤病毒、细菌、
真菌及寄生虫感染，在免疫中起重要作用；同时也有研究表明NO具有生理毒素，过量时会对机体产生毒害作用（Frstermann，2010；simo et al.，2010）。

本
研究结果显示，草鱼巨噬细胞的氧呼吸爆发活性和氮呼吸爆发活性在40和
80μg/mL猪血多肽处理组中显著升高，表明猪血多肽有效提高了巨噬细胞的免疫活性。

这与Tavares等（2011）的结果一致，即活性肽可增强机体巨噬细胞的吞
噬能力，提高机体对外界病原的抵抗能力。

SOD是机体抗氧化酶系统主要成分之一，能消除自由基，保护细胞免受损伤，即SOD活性越高，其机体抗氧化应激能力越强（Ozden et al.，2009）。

方俊等（2006）的研究结果表明，猪血多肽能提高小鼠血清中SOD活性。

本研究结果也表明，猪血多肽能显著提高头肾细胞的SOD活性，提高草鱼的抗氧化能力，进而有效清除氧自由基，防止活性氧对机体造成损伤，同时增强机体的非特异性免疫能力和疾病抵抗能力。

4 结论
本研究结果表明，猪血多肽对草鱼非特异性免疫具有促进作用，且作用效果呈剂量依赖性，以80 μg/mL的猪血多肽作用效果最佳。

实际生产中，可将猪血多肽开
发成一种免疫添加剂，以增强水产动物对疾病的抵抗能力，提高水产养殖效益。

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