Cajal间质细胞在胆囊结石形成中的作用分析

Cajal间质细胞在胆囊结石形成中的作用分析
彭雅亚;谭宇彦
【摘要】目的观察Cajal间质细胞(interstitial cell of Cajal,ICC)和c-kit蛋白在正常胆囊和结石胆囊中的分布和表达情况,探讨ICC与胆囊结石发病的关系.方法对手术切除的25例结石胆囊和15例非结石胆囊石蜡包埋组织标本和新鲜组织,通过c-kit免疫组化染色和Western blot,对两组胆囊标本ICC和c-kit蛋白进行检测.结果所有胆囊标本中均发现c-kit阳性的ICC分布于胆囊平滑肌层,结石胆囊ICC 数目和c-kit蛋白表达明显少于非结石胆囊.结论胆囊结石发病过程中胆囊动力学的减弱有可能与ICC的减少有一定关联.
【期刊名称】《标记免疫分析与临床》
【年(卷),期】2016(023)007
【总页数】3页(P817-819)
【关键词】胆囊结石;Cajal间质细胞;c-kit
【作者】彭雅亚;谭宇彦
【作者单位】湘潭市第二人民医病理科,湖南湘潭411100;东南大学附属中大医院,江苏南京210009
【正文语种】中文
胆囊结石是一种严重危害人类健康的常见病，我国的发病率约为4.42%～11%［1］。

胆囊结石的成因复杂，胆囊收缩功能障碍在胆石的形成中起着关键的作用［2］。

Cajal间质细胞（interstitial cell of Cajal，ICC）是消化道慢波电位的起
搏细胞和信号传导细胞，特异性表达c-kit，主要参与基本电节律的产生和调控，
对维持消化道正常运动功能起着决定性的作用。

许多研究表明，ICC的异常与多种消化道动力紊乱性疾病关系密切。

本实验通过免疫组化和Western-blot方法对结石胆囊和正常胆囊ICC数量和c-kit蛋白表达进行检测，探讨其与胆囊结石的关系。

1 一般资料
40例于2010年1月至2015年10月在东南大学附属中大医院普外科和湘潭市二医院普外科接受胆囊切除的患者。

其中，实验组胆囊结石患者25例（男性13例，女性12例，平均年龄52.9±10.7岁）均接受腹腔镜胆囊切除术，急性胆囊炎和胆总管结石排外；对照组为早期胰头癌胆囊无结石患者15例（男性10例，女性5例，平均年龄62.0±9.8岁），接受Whipple或者Traverso-Longmire手术，本组患者胆囊均未收到肿瘤侵犯，而且血清胆红素水平均在正常范围，梗阻性黄疸除外。

2 组织标本制备
手术切除的新鲜胆囊从颈部至底部纵向剪成2.0cm宽长条，冰PBS冲洗3次，剥除胆囊黏膜后剪成小块，放入EP管内液氮保存备用。

余胆囊用4%中性甲醛固定，制成石蜡包埋切片备用。

3 实验试剂
兔抗人c-kit多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），羊抗兔IgG二抗（美国Santa Cruz公司），WB TRIzol（美国Invitrogen公司），BCA蛋白定量试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所），ECL试剂盒（美国Thermo公司）。

4 试验方法
4.1 免疫组化胆囊石蜡包埋标本制成4μm厚的切片，经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，封闭内源性过氧化物酶及加热抗原修复后，正常山羊血清封闭背景，加入PBS稀释的c-kit一抗（1∶50）置于湿盒内4℃冰箱过夜；PBS漂洗后加入羊抗
兔IgG二抗（1∶100），室温下孵育2h，PBS漂洗后DAB显色，苏木精复染，
中性树脂封片。

每张切片取10个200倍视野，Pro Plus 6.0软件计数阳性细胞数。

4.2 c-kit蛋白Western Blot检测取液氮冻存的胆囊组织约20mg，加入1mL的RIPA蛋白裂解液，超声粉碎10s，连续3次后，4℃离心30min（12000r/min），取上清以loading buffer稀释，蛋白定量按BCA试剂盒操作说明进行。

根据蛋白定量的结果，加样时调整不同样品体积，使其蛋白含量相同。

用10%的SDS PAGE凝胶电泳，并转印至硝酸纤维膜上。

5%脱脂奶粉室温下封闭1h，TBST漂
洗3次，每次10min。

加入c-kit一抗（1∶1000），4℃孵育过夜。

之后用TBST 在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min。

将羊抗兔IgG二抗用TBST按照
1∶2000稀释，室温下孵育1h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次
5min，采用ECL进行化学发光反应，于凝胶成像仪下拍照，获取图片。

5 统计方法
实验数据以均数±标准差（±s）表示，定量资料采用t检验，SPSS13.0软件进行
统计学分析。

P＜0.05为差异有统计学意义。

1 c-kit免疫组化染色
免疫组化结果显示，在粘膜下层可见极少量c-kit阳性的圆形肥大细胞c-kit阳性
的ICC主要位于胆囊平滑肌层，这些细胞呈梭形、多角，胞浆内可见棕色颗粒样
物质，核大呈圆形或椭圆形。

实验组ICC数目明显少于对照组（24.24±4.29
vs.56.29± 3.43，P＜0.05）。

见图1。

2 c-kit蛋白表达结果
Western blot结果显示，对照组胆囊组织c-kit蛋白与β-actin的比值为
0.93±0.12，实验组为0.45± 0.08，两组比较差异有显著性（P＜0.05）。

见图2。

胆囊结石是一种常见的消化系统疾病，成因复杂，胆囊运动功能异常被认为是一个关键的因素。

目前认为，胆囊运动功能障碍导致结石形成可能的机理是：①胆汁在
胆囊内淤滞，使胆盐不能及时进入肠道进行肠肝循环，胆汁中胆盐浓度下降，胆汁酸池缩小，影响微胶粒的形成；②胆囊的风箱运动减弱，使混合微胶粒上富含胆固醇的小泡和小泡聚集物分层，有利于胆固醇的析出、成核；③尤为重要的是，胆固醇结晶的形成、聚集、析出、成核及结石的生长，需要足够的时间，而胆囊排空功能下降，胆汁在胆囊内淤滞恰好提供了良好的时、空条件［3］。

ICC是西班牙神经解剖学家Ramón Santiago y Cajal通过甲基蓝及嗜银染色法在胃肠道奥尔巴赫神经丛、深肌层、环行肌层内观察到的一类特殊的间质细胞，ICC 主要的功能是：①慢波电位的起搏细胞。

ICC能产生自发电节律，即慢波电位，它被认为是消化道运动的基础，决定着平滑肌收缩节律，调控着胃肠运动发生的时间、地点、频率和方向。

②慢波电位的传导细胞。

慢波电位通过ICC网络传播给与之
相连的平滑肌细胞，刺激并调节平滑肌收缩活动。

③介导神经信号传递［4］。

消化道平滑肌电活动的特点是膜电位节律性震荡，收缩活动是在慢波电位的基础上进行的，慢波活动对平滑肌细胞的收缩功能起着制约限制活动，从而控制了整个器官的运动。

ICC的超微结构研究发现，ICC之间以及与神经元、平滑肌细胞之间存在广泛的缝隙链接，起源于ICC的起搏电位通过ICC网络与之相连的平滑肌细胞间
传播，当局部电位达到阈电位水平时引起动作电位［5］，这种结构特点适应ICC
作为调控消化道平滑肌运动的起搏和中介功能。

现已发现，ICC的减少或缺失与多种消化道动力障碍性疾病，如贲门失弛缓症、糖尿病性胃轻瘫、先天性幽门肥厚、慢性假性小肠梗阻、慢传输型便秘、先天性巨结肠、先天性肠闭锁等密切相关
［6-9］。

ICC特异性的表达III型酪氨酸激酶生长因子受体c-kit，通过c-kit抗体免疫组化染色可以很好的鉴定ICC，目前公认c-kit（CD117）是ICC特异性标志物［10］。

消化道肥大细胞亦表达c-kit，肥大细胞主要位于黏膜层和黏膜下层，胞体呈圆形，较小，无突触，数量也很少，而ICC分布在消化道脏器的平滑肌层内，通过细胞形态和分布特点，可以很好的鉴别ICC和肥大细胞［11］。

为此，
在对胆囊组织c-kit蛋白表达检测中，我们将胆囊黏膜层和黏膜下层予以剥除，减少肥大细胞的干扰。

Lavoie［12］等首次在豚鼠胆囊内发现ICC，从形态学和生理学证明了ICC在胆
囊上的存在，并证实该细胞与平滑肌活动的机-电耦合关系密切。

Balemba等［13］发现ICC有自发的细胞内钙震荡，具有起搏胆囊平滑肌收缩活动的功能，参与平
滑肌电生理活动。

2012年，Pasternak［14］等在患者切除的无瘤胆囊上确定了
人类胆囊ICC的存在，并认为胆囊能产生和传播自发性节律与其密不可分。

我们的研究应用免疫组化染色对ICC进行观察发现，结石胆囊平滑肌层内ICC数
目较正常胆囊明显减少，ICC网络结构遭到破坏。

这种ICC的异常，使ICC与胆
囊平滑肌细胞间机电偶联的完整性受损，阻止慢波电位的发生和传导，使胆囊平滑肌收缩活动发生障碍。

而且Western-blot结果亦显示，结石胆囊c-kit蛋白表达
较正常胆囊显著降低，而在消化道中表达c-kit的主要是ICC，这也进一步证实了
在胆囊结石形成过程中ICC量发生了异常。

目前，对于胆囊结石形成过程中ICC减少的原因尚未有合理的结论。

我们推测，
成石胆汁中胆固醇饱和指数升高与之可能存在一定的关联。

Hu等［15］的研究结果证实，用高胆固醇饮食喂养豚鼠，胆囊组织c-kit蛋白及mRNA表达水平比对
照组明显下降，而在胆囊壁肌层表达c-kit蛋白的绝大部分就是ICC，这提示了高
胆固醇饱和指数与该类细胞的变化密切相关。

综上所述，胆囊结石发病过程中ICC数目减少，影响了胆囊基本电节律的发生，
妨碍了胆囊平滑肌运动的机-电耦合过程，使结石胆囊收缩功能减弱。

然而，胆囊
结石发病过程中ICC减少的原因和机制是什么，有待我们更深入的研究探讨。

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