一种雌酚类半抗原、完全抗原及其制备方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711063768.3
(22)申请日 2017.11.02
(71)申请人 山东师范大学
地址 250014 山东省济南市文化东路88号
(72)发明人 贾敏　
(74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限
公司 37221
代理人 王志坤
(51)Int.Cl.
C07C 51/367(2006.01)
C07C 59/70(2006.01)
C07K 14/765(2006.01)
C07K 14/77(2006.01)
C07K 14/795(2006.01)
G01N 33/74(2006.01)
G01N 33/535(2006.01)
(54)发明名称一种雌酚类半抗原、完全抗原及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种雌酚类半抗原、完全抗原及其制备方法。

所述方法包括：将雌酚类和一氯乙酸盐在常温、催化剂存在的条件下，于有机溶剂中进行反应，冰水终止反应，有机萃取剂未反应的雌酚类，水相用酸酸化，生成白色沉淀，即得雌酚类半抗原。

该方法通过对合成中催化剂和反应时间等的优化，提供一种无需加热和控制pH的简便方法，短时间内即可获得半抗原；利用产物和底物溶解特性不同，利用萃取方法除去未反应的雌酚类物质，同时所得雌酚类物质通过回收，可继续使用，节约反应底物；最后通过盐酸酸化的方法结晶的方法，即可获得高纯度的雌酚类半抗原；利用雌酚类半抗原与载体蛋白连接获得完
全抗原。

权利要求书1页 说明书5页CN 107698441 A 2018.02.16
C N 107698441
A
1.一种雌酚类半抗原的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将雌酚类和一氯乙酸盐在常温、催化剂存在的条件下，于有机溶剂中进行反应，冰水终止反应，有机萃取剂萃取未反应的雌酚类，水相用酸酸化，生成白色沉淀，即得雌酚类半抗原；所述催化剂为氢氧化钾或氢氧化钠。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，雌酚类为己烯雌酚(DES)、己烷雌酚(HEX)或双烯雌酚(DIS)中的一种；
优选的，一氯乙酸盐优选为一氯乙酸钠。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，雌酚类与一氯乙酸盐物质的量之比为1:1，或雌酚类稍过量。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，有机溶剂为二甲基亚砜、二氧六环、四氢呋喃或丙酮中的任意一种或两种以上混合物；优选的，有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，酸化所用酸为盐酸，硫酸和硝酸中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，有机萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙醚中的一种或几种混合；优选的，有机萃取剂为乙酸乙酯。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，雌酚类、一氯乙酸钠和催化剂的物质的量之比为1:0.5-1:15-25；优选的，雌酚类在有机溶剂中的浓度为0.183-0.275mol/L；更优选的，雌酚类和一氯乙酸钠的反应温度为10-30℃，反应时间为10-35min；所述酸的浓度优选1.5-2.5mol/L。

8.雌酚类完全抗原的制备方法，其特征在于，包括权利要求1-7任一项雌酚类半抗原的制备方法步骤，以及利用制备的半抗原进一步制备雌酚类完全抗原的步骤。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述利用制备的半抗原进一步制备雌酚类完全抗原的步骤为利用碳二亚胺法将雌酚类半抗原与载体蛋白偶联，制备雌酚类完全抗原。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述利用制备的半抗原进一步制备雌酚类完全抗原的步骤为：雌酚类半抗原与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(NHS)和N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)在二甲基亚砜中搅拌；将该溶液缓慢滴入含有载体蛋白的碳酸盐缓冲液中，搅拌，透析，冷冻干燥后制成雌酚类完全抗原；
优选的，雌酚类半抗原、NHS、EDC和载体蛋白的质量比为1:0.4-0.6:0.7-0.9:0.6-10；优选的，载体蛋白包括但不仅限于牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白及多聚赖氨酸中的一种；
优选的，雌酚类半抗原、NHS和EDC加入二甲基亚砜后室温下搅拌2小时，碳酸盐缓冲液的pH为7.0，活化后的半抗原滴入后，室温搅拌2小时。

权　利　要　求　书1/1页CN 107698441 A
一种雌酚类半抗原、完全抗原及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及免疫化学和检测技术领域，尤其涉及一种雌酚类半抗原、完全抗原及其制备方法，尤其是涉及己烯雌酚(DES)、己烷雌酚(HEX)和双烯雌酚(DIS)半抗原的制备方法。

背景技术
[0002]环境雌激素指具有雌激素效应，能够模拟天然雌激素，干扰内分泌功能的一类化合物。

己烯雌酚(DES)、己烷雌酚(HEX)和双烯雌酚(DIS)，是非甾体同化激素，可促进动物体内氮停留增加，具有增加蛋白质沉积和减少脂肪沉积的作用，因其结构简单、易于合成、成本低等特点，而被应用于促进畜禽生长、增加瘦肉率等。

由于DES、HEX、DIS等均属于环境雌激素，可通过干扰或阻断雌激素受体与内源性雌激素的相互作用，影响天然激素的合成、分泌、运输、反应和代谢等，从而导致生殖、神经和免疫系统等的异常。

当其在体内蓄积到一定程度，会破坏机体的正常生理平衡，因此国家陆续出台一系列禁令，禁止限制这些环境雌激素的使用。

2002年农业部公布的《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》中，禁止DES作为兽药使用。

国家制定了严格的标准，以保障食品安全，消除潜在的食品安全隐患。

[0003]目前常用的DES、HEX、DIS残留检测方法主要有紫外分光光度法、荧光法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法及酶联免疫法等。

其中紫外分光光度法检测灵敏度相对较低，色谱法和荧光法灵敏度较高，色谱法和荧光法的检出限可达到μg/L以下，但是色谱法不能鉴定出分析物的结构，往往还需要与质谱联用的手段确认结构，该方法的样品前处理繁琐，消耗大量溶剂，且依赖于大型仪器和专业技术检测人员。

酶联免疫检测方法检测限可达到0.1μg/L以下，具有简单、快速、特异性好、分析容量大、成本低的优点，可以大大简化甚至省去前处理过程，不需要大型仪器，对使用人员的专门技术要求不高，容易普及和推广。

建立酶联免疫法，首先必须制备出效价高特异性强的抗体。

由于许多目标物为小分子，无法引起免疫活性，需要制备半抗原合成完全抗原，同时由于目标物所具有的官能团不同，因此半抗原的设计和合成是完全抗原的关键步骤，决定最终得到抗体表面的抗原决定簇的特性。

[0004]DES、HEX、DIS等均为小分子化合物质，本身不具有导免疫系统产生抗体的能力，因此需要进行半抗原的制备。

在构建半抗原时可考虑在不同的位点引进活性功能团：1、在两个酚羟基中间的烃基部位接上一个连接臂；2、酚羟基接上一个连接臂。

对于在烃基部位引入活性基团而言，DES和DIS的烃基部位有特异性的双键结构，在烃基部位制备半抗原，可能会使其双键结构被破坏，从而导致制得的抗体特异性不高。

对于HEX而言，烃基部位不易被活化，在烃基部位接上连接臂相对困难。

而对于在酚羟基上引进活性功能团，在其酚羟基一端接上一个带有氨基或羧基的连接臂相对较易，同时所制备的半抗原可以保留其中特异性的烃基结构，制备得到的抗体特异性较好。

[0005]现有技术对于酚羟基上引进活性功能团，一般有两种方式，一种是与酚羟基形成酯键，一种是与酚羟基形成醚键。

由于动物体内存在酯酶，酯键连接方式在动物体内不稳定，其免疫原性大大降低，因此采用醚键连接方式可使形成的完全抗原在动物体内不易降
解，因此醚键连接的半抗原的应具有更广泛的应用。

[0006]DES、HEX、DIS采用醚键连接的半抗原合成方法，现阶段多采用碳酸钾，碳酸钠或三乙胺等作为催化剂，与氯代或溴代酸或者氯代或溴代酯反应，进行半抗原的制备。

以DES为例，王蓓等利用碳酸钠作为催化剂，与氯乙酸钠在70℃下反应9h，旋转蒸发，氯仿除去不溶物，加入石油醚沉淀得到DES半抗原。

沈美芳等采用乙醇钠与氯乙酸乙酯反应，70-100℃回流0.5h，KOH水解1h。

乙醚和乙酸乙酯抽提，盐酸酸化水相，乙酸乙酯萃取蒸干后得到DES半抗原。

现阶段由于DES、HEX、DIS含有两个酚羟基，在进行活化反应时，可能产生两个酚羟基均被活化的现象，因此目前采用的DES、HEX、DIS等雌酚类半抗原合成方法一般采用活性较弱的催化剂，如碳酸钾，碳酸钠或三乙胺等，但其反应时常需要加热，并且反应时间较长；而使用强催化剂又存在(两个酚羟基均被活化)产物纯度不高、反应不可控等问题。

发明内容
[0007]针对现有技术的不足，本发明提供一种针对DES、HEX、DIS等雌酚类物质的半抗原及完全抗原的合成方法。

本发明所述方案具有合成时间短，操作步骤简单，无需加热和控制pH等特点，利用本发明方法合成的DES、HEX、DIS等雌酚类物质的半抗原和完全抗原可广泛用于DES、HEX、DIS等雌酚类物质的免疫分析研究中。

[0008]具体的，本发明涉及以下技术方案：
[0009]本发明的目的之一是提供一种雌酚类半抗原的制备方法。

[0010]所述制备方法的原理为：本发明利用活性较强的催化剂，选用电负性较弱的氯代酸盐作为反应物进行反应，反应过程无需加热，反应时间短，通过萃取的方法即可除去未反应的雌酚类物质，反应过程可控，通过控制反应时间防止副反应的产生，通过沉淀方法获得高纯度半抗原。

[0011]本发明的目的之二在于提供雌酚类完全抗原的制备方法。

在上述方法制备得到高纯度半抗原的基础上，利用雌酚类半抗原与载体蛋白连接获得完全抗原。

[0012]此外，本发明还包括利用制备的完全抗原进行雌酚类酶联免疫法检测的方法。

[0013]本发明的有益效果至少包括：
[0014]本发明提供了一种DES、HEX、DIS等雌酚类物质的半抗原及完全抗原制备的方法，该方法具有操作简单，极大缩短反应时间，无需加热处理，节约生产成本等特点；最大限度保留了雌酚类物质的化学结构，提高了半抗原的特异性，引入活性基团-COOH，为完全抗原的制备提供连接点，制备得到的半抗原和完全抗原可用于DES、HEX、DIS等雌酚类物质的免疫分析方法研究。

[0015]本发明针对雌酚类的共有结构提供一系列半抗原及完全抗原制备的新方法。

该方法通过对合成中催化剂和反应时间等的优化，提供一种无需加热和控制pH的简便方法，短时间内即可获得半抗原且反应过程可控；利用产物和底物溶解特性不同，利用萃取方法除去未反应的雌酚类物质，同时所得雌酚类物质通过回收，可继续使用，节约反应底物；最后通过盐酸酸化的方法结晶的方法，即可获得高纯度的雌酚类半抗原；利用雌酚类半抗原与载体蛋白连接获得完全抗原。

本方法具有操作简单，降低能耗，节约成本，产品纯度高等的特点，可广泛用于雌酚类免疫分析研究中，应用前景广阔。

具体实施方式
[0016]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。

除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0017]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。

[0018]所述雌酚类半抗原，为雌酚类衍生物，所述半抗原为在雌酚的酚羟基一侧引入羧基，形成雌酚-单羧基甲基醚类化合物。

[0019]具体的，本发明实施例中制备的雌酚类半抗原结构式如式I、式II、式III所示：[0020]
[0021]诚如背景技术所述，现有雌酚类半抗原合成存在诸多不足，本发明针对半抗原合成过程进行再设计和优化，最终得到了高纯度雌酚类半抗原的高效合成方法。

[0022]具体的实施方案中，本发明公开了一种雌酚类半抗原的制备方法，所述方法包括：将雌酚类和一氯乙酸盐在常温、催化剂存在的条件下，于有机溶剂中进行反应，冰水终止反应，有机萃取剂萃取未反应的雌酚类，水相用酸酸化，生成白色沉淀，即得雌酚类半抗原；所述催化剂为氢氧化钾或氢氧化钠。

[0023]本发明雌酚类半抗原的制备过程中，采用活性较强的催化剂(氢氧化钾/氢氧化钠)，结合电负性较弱的氯代酸盐作为反应物进行反应，可以有效的控制雌酚类酚羟基活化程度(可以有效避免雌酚类物质的两个酚羟基都活化成羧基)以及避免雌酚类中双键结构的破坏，并且整个反应过程无需控温或加热，反应时间短，为雌酚类抗原的工业化制备提供了有效的途径。

[0024]优选的实施例中，雌酚类为己烯雌酚(DES)、己烷雌酚(HEX)或双烯雌酚(DIS)中的一种。

一氯乙酸盐优选为一氯乙酸钠。

[0025]优选的实施方案中，为进一步避免过多副反应的发生(雌酚类物质的两个酚羟基都活化成羧基以及双键结构的活化)，通过控制雌酚类物质稍过量，优选的，雌酚类、一氯乙酸盐物质的量之比为1:0.5-1，不仅可以提升得率，而且有效控制雌酚类半抗原产物的纯
度。

[0026]优选的实施例中，所述有机溶剂为二甲基亚砜、二氧六环、四氢呋喃或丙酮中的任意一种或两种以上混合物。

更为优选的，有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。

选用DMSO不仅有利于半抗原合成体系的稳定，而且利于后续半抗原纯化和完全抗原合成步骤。

[0027]所述常温意指温度10-30℃范围内的温度条件。

[0028]优选的实施例中，本发明所述酸化所用酸为盐酸，硫酸和硝酸等。

更为优选的，酸化所用酸为盐酸。

[0029]优选的实施例中，有机萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙醚中的一种或几种混合。

更为优选的，有机萃取剂为乙酸乙酯。

[0030]具体的实施例中，本发明所述雌酚类，一氯乙酸钠和催化剂的物质的量之比为1: 0.5-1:15-25。

雌酚类在有机溶剂中的浓度为0.183-0.275mol/L。

雌酚类和一氯乙酸钠的反应温度为10-30℃，反应时间为10-35min。

所述酸的浓度优选1.5-2.5mol/L。

[0031]具体的实施方案中，本发明还公开了雌酚类完全抗原的制备方法，包括雌酚类半抗原的制备方法步骤以及利用制备的半抗原进一步制备雌酚类完全抗原的步骤。

[0032]所述利用制备的半抗原进一步制备雌酚类完全抗原的步骤为利用碳二亚胺法将雌酚类半抗原与载体蛋白偶联，制备雌酚类完全抗原。

[0033]具体的，本发明所述利用制备的半抗原进一步制备雌酚类完全抗原的步骤为：采用上述制备的雌酚类半抗原与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(NHS)和N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)在二甲基亚砜中搅拌；将该溶液缓慢滴入含有载体蛋白的碳酸盐缓冲液中，搅拌，透析，冷冻干燥后制成雌酚类完全抗原。

[0034]进一步优选的，所述雌酚类完全抗原的制备方法，雌酚类半抗原，NHS，EDC和载体蛋白的质量比为1:0.4-0.6:0.7-0.9:0.6-10。

具体的实施例中，载体蛋白包括但不仅限于牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白及多聚赖氨酸等。

雌酚类半抗原，NHS和EDC加入二甲基亚砜后室温下搅拌2小时，碳酸盐缓冲液的pH为7.0，活化后的半抗原滴入后，室温搅拌2小时。

[0035]为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。

[0036]实施例1：己烯雌酚半抗原制备方法
[0037]称取295mg己烯雌酚置于6mL干燥的二甲基亚砜中，将1.540g氢氧化钾加入溶液中，搅拌5min。

加入64mg一氯乙酸钠。

室温10℃下，磁力搅拌35min后，加入50mL冰水终止反应。

加入乙酸乙脂24mL萃取三次，除去未反应的己烯雌酚。

搅拌状态下用100mL 1.5mol/L盐酸酸化水相，出现白色沉淀。

漏斗过滤，用蒸馏水将沉淀物洗至中性，放入烘箱干燥，得到己烯雌酚半抗原，产率约为28％，纯度约为98％。

[0038]实施例2：双烯雌酚半抗原制备方法
[0039]称取293mg双烯雌酚置于4mL干燥的二氧六环中，将0.924g氢氧化钾加入溶液中，搅拌5min。

加入128mg一氯乙酸钠。

室温10℃下，磁力搅拌35min后，加入50mL冰水终止反应。

加入乙酸乙脂24mL萃取两次，除去未反应的双烯雌酚。

搅拌状态下用100mL 2.5mol/L硝酸酸化水相，出现白色沉淀。

漏斗过滤,用蒸馏水将沉淀物洗至中性，放入烘箱干燥，得到双烯雌酚半抗原，产率约为29％，纯度约为97％。

[0040]实施例3：己烷雌酚半抗原制备方法
[0041]称取297mg己烷雌酚置于4mL干燥的四氢呋喃中，将1.0g氢氧化钾加入溶液中，搅拌5min。

加入128mg一氯乙酸钠。

室温30℃下，磁力搅拌10min后，加入50mL冰水终止反应。

加入乙酸乙脂16mL萃取三次，除去未反应的己烷雌酚。

搅拌状态下用100mL 2mol/L硫酸酸化水相，出现白色沉淀。

漏斗过滤，用蒸馏水将沉淀物洗至中性，放入烘箱干燥，得到己烷雌酚半抗原，产率约为28％，纯度约为98％。

[0042]实施例4：己烯雌酚完全抗原的合成
[0043]取6.6mg己烯雌酚半抗原，2.64mg的NHS，4.62mg的EDC，混合加入1mL的二甲基亚砜中搅拌2小时。

将3.96mg的卵清蛋白溶解到5mLNaHCO3(0.13mol/L，pH>7)。

将上述1mL溶液缓慢滴入该蛋白溶液中，轻轻搅拌2h，维持pH＝7.0左右。

将反应后的反应液装入透析袋中，在4℃层析柜中用0.01mol/L的PBS缓冲液在磁力搅拌器上透析三天，每4小时换一次液，即得到己烯雌酚的完全抗原。

[0044]实施例5：双烯雌酚完全抗原的合成
[0045]取6.6mg双烯雌酚半抗原，3.96mg的NHS，5.94mg的EDC，混合加入1mL的二甲基亚砜中搅拌2小时。

将66mg的牛血清白蛋白溶解到5mLNaHCO3(0.13mol/L，pH>7)。

将上述1mL溶液缓慢滴入该蛋白溶液中，轻轻搅拌2h，维持pH＝7.0左右。

将反应后的反应液装入透析袋中，在4℃层析柜中用0.01mol/L的PBS缓冲液在磁力搅拌器上透析三天，每4小时换一次液，即得到双烯雌酚的完全抗原。

[0046]实施例6：己烷雌酚完全抗原的合成
[0047]取6.6mg己烷雌酚半抗原，2.9mg的NHS，5.2mg的EDC，混合加入1mL的二甲基亚砜中搅拌2小时。

将29mg的血蓝蛋白溶解到5mLNaHCO3(0.13mol/L，pH>7)。

将上述1mL溶液缓慢滴入该蛋白溶液中，轻轻搅拌2h，维持pH＝7.0左右。

将反应后的反应液装入透析袋中，在4℃层析柜中用0.01mol/L的PBS缓冲液在磁力搅拌器上透析三天，每4小时换一次液，即得到己烷雌酚的完全抗原。

[0048]虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。