实验38植物体内游离脯氨酸含量的测定

实验38植物体内游离脯氨酸含量的测定
植物体内游离脯氨酸含量的测定
植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。

因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。

【原理】
采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。

在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。

脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。

【仪器与用具】
分光光度计；水浴锅；漏斗；20ml大试管数支；20ml具塞刻度试管9支；5～10ml注射器或滴管。

【试剂】
3%磺基水杨酸水溶液；甲苯；
2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3日有效；
脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml。

再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标准液。

【方法】
1．标准曲线制作
表38-1 各试管中试剂加入量
（1）取7支具塞刻度试管按表38-1加入各试剂。

混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。

（2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。

静置待分层后吸取甲苯层以“0”管为对照在波长520nm下比色。

（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。

2．样品测定
（1）脯氨酸提取取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2～0.5g（干样根据水分含量酌减），分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。

（2）取出试管待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min，下一步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色。

（3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。

脯氨酸（μg/g FW或DW）=
式中 C—提取液中脯氨酸浓度（μg），由标准曲线求得；
V—提取液总体积（ml）；
a—测定时所吸取的体积（ml）；
W—样品重（g）。

【思考题】
1.植物体内游离脯氨酸测定有何意义？
2.当改变萃取剂时，比色应做哪些改变？如何选择最适波长？如何选择最佳萃取剂？。