一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法[发明专利]

[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101550432A [43]公开日2009年10月7日
[21]申请号200910057210.3[22]申请日2009.05.11
[21]申请号200910057210.3
[71]申请人尚科生物医药（上海）有限公司
地址201319上海市横沔镇怡园创业路369弄38
号
[72]发明人文军 陶军华 姚黔禹 [74]专利代理机构上海浦东良风专利代理有限责任公司代理人张劲风
[51]Int.CI.C12P 17/12 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 6 页
[54]发明名称
一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法
[57]摘要
本发明涉及一种制备烟酸及其衍生物的方法，
尤其涉及一种利用氰基水解酶水解烟腈制备烟酸的
方法。

主要解决现有烟酸合成方法存在的使用强酸
强碱导致设备易腐蚀以及工艺复杂、收率低等技术
问题。

技术方案为：一种用酶催化生产烟酸的方法，
以3－氰基吡啶为原料，用发酵产生的氰基水解酶
水解3－氰基吡啶获得烟酸。

本发明的反应式可表
述为上式。

200910057210.3权 利 要 求 书第1/2页 1、一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法，其特征是以R-氰基吡啶为原料，用发酵产生的氰基水解酶水解R-氰基吡啶获得相应的酸，以反应式表述为：
其中氰基出现在环上的2位到5位的任意一个位置；R则表示一个或多个其他位置的取代基，选自下述基团中的一种：氢原子，或一个到十个碳原子的烷基、环烷基、烯基，或一个到十个碳原子的烷氧基、卤素、酯基、硝基。

2、根据权利要求1所述的一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法，其特征是以3-氰基吡啶为原料，用发酵产生的氰基水解酶水解3-氰基吡啶获得烟酸，以反应式表述为：
3、根据权利要求2所述的一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法，其特征是所述的3-氰基吡啶溶解在水或水溶性有机溶剂或缓冲液中。

4、根据权利要求3所述的一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法，其特征是所述的水溶性有机溶剂为二甲基亚砜或者丙酮或者乙腈。

5、根据权利要求3所述的一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法，其特征是所述的缓冲溶液p H值为5.5-9.0，缓冲液浓度为5-200m m o l/L。

6、根据权利要求5所述的一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法，其特征是所述的缓冲溶液p H值为6.5-8.0，缓冲液浓度为10-100m m o l/L。

7、根据权利要求3所述的一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法，其特征是所述的有机溶剂的体积不超过水溶液体积的20％。

8、根据权利要求7所述的一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法，其特征是所述的有机溶剂的体积不超过水溶液体积的10％。

9、根据权利要求2所述的一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法，其特
200910057210.3权 利 要 求 书 第2/2页征是所述的氰基水解酶以干粉形式加入或者溶解于水或缓冲溶液中加入，然后在10-40℃之间缓慢搅拌反应，经过后处理，重结晶，获得纯品烟酸。

10、根据权利要求9所述的一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法，其特征是所述的后处理为：若反应体系为纯水，则在反应结束后将水减压蒸馏浓缩，浓缩比例：每投入1g原料3-氰基吡啶，对应浓缩后体积为5～20mL，浓缩后的烟酸溶液加热回流半小时，缓慢降温冷却，烟酸晶体结晶析出，过滤，真空烘干，得到烟酸。

11、根据权利要求9所述的一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法，其特征是所述的后处理为：若反应体系为缓冲溶液，则在反应结束后将溶剂水完全蒸干，然后加入乙醇加热回流，乙醇的量为1g蒸干后残留固体加入10～200mL乙醇，使烟酸溶解，然后过滤，无机缓冲盐因为在乙醇中几乎不溶解而被除去，母液蒸干，残留物用水重结晶获得烟酸。

12、根据权利要求2所述的一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法，其特征是所述的氰基水解酶选自NIT101、NIT102、NIT103、NIT104、NIT105、NIT106、NIT107、NIT108、NIT109、NIT110、NIT111、NIT112、NIT113、NIT114、NIT115、NIT116、NIT117、NIT118、NIT119、NIT120、NIT121、NIT122、NIT123、NIT124、NIT125、NIT126、NIT127、NIT128、NIT129、NIT130、NIT131、NIT132、NIT133、NIT134、NIT135、NIT136、NIT137、NIT138、NIT139和NIT140中的一种。

200910057210.3说 明 书第1/6页
一种用酶催化生产烟酸及其衍生物的方法
技术领域
本发明涉及一种制备烟酸及其衍生物的方法，尤其涉及一种利用氰基水解酶水解烟腈制备烟酸的方法。

背景技术
烟酸，化学名为吡啶-3-羧酸，英文名nicotinic acid，又称维生素B5和尼克酸。

烟酸作为一种常用的化工原料主要被用于医药生产，食品和饲料添加剂行业。

传统的烟酸生产主要由吡啶衍生物氧化而得。

一种已知的合成烟酸的方法是由3-甲基吡啶在75～300℃的高温先利用硫酸和硝酸对其在液相下进行氧化而得，该法由于使用到大量的强酸，对设备的要求非常高，同时设备的使用周期很短，并且在此生产过程中会产生大量的废水，同时，在酸碱中和过程中产生大量的无机盐负载，另外，此法在反应过程中会产生较多的共沸物，在反应过程中难维持最佳的反应温度，由此导致收率较低。

另外还有专利报道将3-甲基吡啶连续流过钛钒催化床由空气或氧气将其氧化为烟酸的方法，这样的方法同样要求较为复杂的生产设备，容器效率低，产生了较高的能耗，并且产生较大量的有毒催化剂废渣，处理困难。

日本专利JP07233150采用钴盐，锰盐，溴化物催化，采用氧气等氧化3-甲基吡啶，此法三废排放少，产品纯度高，后处理简单，同时反应液可以循环使用，但是产率低，并需要在高温高压下进行，同时使用了小分子的有机酸作为溶剂，在高温下对于设备的腐蚀也难以忽视。

世界专利WO9305022改进了此法，在催化剂体系中加入氯化氢气体，使得反应温度和压力都降低，产率提高，但是加入氯化氢气体使得设备的耐腐蚀能力进一步减弱，设备要求更高，使用周期更短。

另有一些专利对此法也进行了各种的改进尝试，但是各自带来新的问题和不足。

还有一种利用高锰酸钾等高价金属氧化剂氧化3-甲基吡啶的方法，此法消耗氧化剂多，成本高，废液量大，只能停留在实验室小量合成时使用。

氧化5-甲基-2-乙基吡啶到吡啶二羧酸再脱羧制备烟酸的方法收率高，但工艺复杂，原料难得。

氧化喹啉的方法则收率低，副产物多，并难分离。

目前最常用的方法是将同样由3-甲基吡啶在气相中通过氨氧化法氧化获得的3-氰基吡啶水解而得烟酸，水解3-氰基吡啶的过程通常在强酸或者强碱性条件下进行的，如此一来，这一方法同样对生产设备提出了很高的要求，同时，大量的废液产生也是不可避免的。

EP442430利用微生物氧化3-甲基吡啶为烟酸，在反应16小时后只能获得50％收率。

发明内容
本发明目的在于提供一种全新的生物转化制备烟酸的方法，主要解决现有烟酸常规合成方法存在的使用强酸强碱导致设备易腐蚀以及工艺复杂、收率低等技术问题。

本发明的技术方案为：一种用酶催化生产烟酸的方法，以3-氰基吡啶为原料，用发酵产生的氰基水解酶水解3-氰基吡啶获得烟酸。

本发明以反应式可表述为：
为方便写作及节省篇幅，以下将各种数据单位以通用西文符号代替，其中包括：g(克)，m g(毫克)，m o l(摩尔)，m m o l(毫摩尔)，μL(微升)，m L(毫升)，L(升)，℃(摄氏度)等。

反应体系为纯水或者pH值为5.5-9.0的缓冲溶液，缓冲pH值优选为6.5-8.0。

缓冲液浓度为5-200mmol/L，优选浓度为10-100mmol/L。

底物3-氰基吡啶以固体或者浓度为1-100g/L的溶液加入，溶解底物的溶剂为二甲基亚砜或者丙酮或者乙腈等水溶性有机溶剂，有机溶剂的体积为不超过水溶液体积的20％，优选为不超过水溶液体积的10％。

上述底物混合溶液搅拌均匀后，加入氰基水解酶，氰基水解酶可以干粉形式加入或者溶解于水或缓冲溶液中加入。

然后在10-40℃之间缓慢搅拌反应一定时间，以高效液相色谱(HPLC)或液相-质谱联用(LC-MS)检测转化率。

经过后处理，重结晶等工序，可获得纯品烟酸。

具体的后处理方法为：若反应体系为纯水，则在反应结束后将水减压蒸馏浓缩。

浓缩比例：每投入1g原料3-氰基吡啶，对应浓缩后体积为5～20mL。

浓缩
后的烟酸溶液加热回流半小时，缓慢降温冷却，烟酸晶体结晶析出，过滤，真空烘干，得到烟酸，酶则因其水溶性而被此过程除去。

若反应体系为缓冲溶液，则在反应结束后将溶剂水完全蒸干，然后加入乙醇(乙醇的量：为1g蒸干后残留固体用10～200mL乙醇)加热回流，使烟酸溶解，然后过滤，无机缓冲盐因为在乙醇中几乎不溶解而被除去。

母液蒸干，残留物再按上法用水重结晶可获得烟酸。

经高效液相色谱(H P L C)和液相-质谱联用(L C-M S)检测以本发明方法生产的烟酸纯度达99％以上，氢谱核磁共振(HNMR)检测无杂质氢存在。

另外，2-氰基吡啶，4-氰基吡啶也可以通过同样的方法被氰基水解酶水解为相应的酸。

除了氰基外，在吡啶环上还可以存在其他的一些取代基团，如下面反应式所示：
其中氰基可以出现在环上的2位到5位的任意一个位置。

R则表示一个或多个其他位置的取代基，包括但不仅仅包括氢原子，一个到十个碳原子的烷基、环烷基、烯基，一个到十个碳原子的烷氧基，卤素，酯基，硝基等。

需要指出的是，由于酶催化具有其特殊的选择性，故相同的酶对结构非常类似的底物都具有不同的选择性和转化率，对于每个不同的底物，均需要以许多种不同的酶对其进行筛选从而找到相应的能将其水解，或者说对其具有很强水解能力的酶。

对于以上所描述的系列化合物，均可以从杭州恩然生物技术有限公司的生产的标号为NIT101、NIT102、NIT103、NIT104、NIT105、NIT106、NIT107、NIT108、NIT109、NIT110、NIT111、NIT112、NIT113、NIT114、NIT115、NIT116、NIT117、NIT118、NIT119、NIT120、NIT121、NIT122、NIT123、NIT124、NIT125、NIT126、NIT127、NIT128、NIT129、NIT130、NIT131、NIT132、NIT133、NIT134、NIT135、NIT136、NIT137、NIT138、NIT139和NIT140这些酶中筛选获得。

本发明的有益效果是：该法利用发酵产生的氰基水解酶水解3-氰基吡啶(英文名nicotinonitrile)获得烟酸，作为原料的3-氰基吡啶可以由3-甲基吡啶在气相中通过氨氧化法获得。

此法反应条件温和，对设备要求极低，生产过程无需高温
或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产烟酸无副产物产生，纯化方便。

反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保。

具体实施方式：
以下配合具体实施例对本发明做进一步详述。

实施例1
适合于3-氰基吡啶的氰基水解酶的筛选。

将底物(3-氰基吡啶)配制成10g/L的二甲基亚砜溶液。

氰基水解酶NIT101～NIT140共40种酶分别溶解于磷酸盐缓冲液配制浓度为10g/L的溶液，缓冲液pH值为8.0，缓冲盐浓度为100mmol/L。

取底物溶液40份置于平行反应容器里，每份20μL，并向每份底物溶液中都加入160μL磷酸盐缓冲液，缓冲液pH值为8.0，缓冲盐浓度为100mmol/L。

将平行反应容器置于摇床上振摇均匀，然后分别单独加入NIT101～NIT140酶溶液20μL，并做好标记。

室温下摇床振摇过夜。

然后每份分别取样10μL，并加入10μL乙腈淬灭反应，用HPLC和LC-MS检测反应。

结果如下表：
酶转化率酶转化率酶转化率酶转化率
NIT101-NIT111-NIT12160％NIT131100％
NIT102-NIT112-NIT122-NIT13250％
NIT103100％NIT113-NIT1235％NIT133-
NIT10497％NIT114-NIT124-NIT134-
NIT105-NIT11510％NIT125-NIT1355％
NIT106-NIT116-NIT12695％NIT13650％
NIT107-NIT117-NIT12795％NIT13710％
NIT108-NIT118-NIT12860％NIT138100％
NIT109-NIT119-NIT129100％NIT139100％
NIT110-NIT120-NIT130-NIT140-
实施例2
将10m g 3-氰基吡啶溶解于1m L二甲基亚砜中，加入9m L p H值为5.5，浓度为100m m o l/L的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后加入10m g氰基水解酶
NIT104，室温下缓慢搅拌过夜，通过HPLC和LC-MS检测鉴定3-氰基吡啶的转化率达100％。

减压蒸馏除去水和二甲基亚砜，残留固体加入1mL乙醇，搅拌1小时，过滤除去缓冲盐，滤液蒸干乙醇，用水重结晶，得烟酸8m g。

实施例3
将10m g 3-氰基吡啶溶解于1m L丙酮中，加入8m L p H值为7.0，浓度为10m m o l/L的磷酸盐缓冲液，混合均与。

称取1m g氰基水解酶N I T129溶解与1 m L上述磷酸盐缓冲液中，并将此酶溶液加入上述反应液，35℃下反应16h。

通过H P L C和L C-M S检测鉴定3-氰基吡啶的转化率达100％。

减压蒸除溶剂，残留固体加入1m L乙醇，搅拌1小时，过滤除去无机盐，滤液蒸干乙醇，用水重结晶，得烟酸8mg。

实施例4
将10m g 3-氰基吡啶溶解于1m L乙腈中，加入9m L p H值为6.5，浓度为50 m m o l/L的磷酸盐缓冲溶液。

加入0.5m g氰基水解酶N I T103，25℃下反应32小时，通过H P L C和L C-M S检测鉴定3-氰基吡啶的转化率为72％。

乙醚萃取回收未水解完全的原料，水相减压蒸除溶剂，残留固体加入1m L乙醇，搅拌1小时，过滤除去缓冲盐，滤液蒸干乙醇，用水重结晶，得烟酸5.8m g。

实施例5
将50m g 3-氰基吡啶溶解于10m L纯水，加入1m g氰基水解酶N I T131，室温下搅拌过夜，通过H P L C和L C-M S检测鉴定3-氰基吡啶的转化率达100％。

减压蒸馏至0.2～0.3mL，加热至90℃并保持10分钟，缓慢降温冷却，析出烟酸晶体，过滤，少量水洗涤，干燥，得烟酸52mg。

实施例6
将500mg 3-氰基吡啶溶解于70mL pH值为8.0，浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，加入5m g氰基水解酶N I T131，35℃缓慢搅拌16h，通过H P L C 和LC-MS检测鉴定3-氰基吡啶的转化率达100％。

减压蒸除溶剂，残留固体加入20m L乙醇，搅拌下加热回流半小时，过滤除去无机盐，滤液蒸干乙醇，用水重结晶，得烟酸533mg。

实施例7
取100mg/mL的3-氰基吡啶-二甲基亚砜溶液0.1mL，加入pH为7.5，浓度为100m m o l/L的磷酸盐缓冲溶液0.3m L，混合均匀后加入1m g氰基水解酶N I T126，30℃缓慢搅拌40h，通过H P L C和L C-M S检测鉴定3-氰基吡啶的转化率为31％。

乙醚萃取回收未水解完全的原料，水相减压蒸除溶剂，残留固体加入1m L乙醇，搅拌1小时，过滤除去缓冲盐，滤液蒸干乙醇，用水重结晶，得烟酸2.4mg。

实施例8
取10mg 3-甲基-4氰基吡啶溶于1mL二甲基亚砜中，加入10mL pH为7.0，浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后加入1mg氰基水解酶NIT138，室温缓慢搅拌15小时，H P L C及L C-M S鉴定转化率达100％。

后处理后可得3-甲基吡啶-4-甲酸8.4mg。

实施例9
取10mg 2-氰基-5-溴吡啶溶于1mL二甲基亚砜中，加入10mL pH为7.5，浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后加入1mg氰基水解酶NIT139，室温缓慢搅拌15小时，H P L C及L C-M S鉴定转化率达96％。

后处理后可得5-溴吡啶-2-甲酸7.3mg。

实施例10
取10mg 2-氰基吡啶-4-甲酸乙酯溶于1mL二甲基亚砜中，加入10mL pH为7.5，浓度为100m m ol/L的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后加入1mg氰基水解酶N I T126，室温缓慢搅拌20小时，H P L C及L C-M S鉴定转化率达93％。

后处理后可得2-羧基吡啶-4-甲酸乙酯7.6mg。