木聚糖酶抑制蛋白的研究进展

木聚糖酶抑制蛋白的研究进展
鄢高翔
【摘要】简要介绍了三类木聚糖酶抑制蛋白的分子结构、抑制特性及其在谷物中的抗病防御作用.%The molecule structure, inhibition characteristics and disease-resistant and defense response of three kinds of xylanase inhibiting protein were briefly introduced, which were TAXI, XIP and TLXI.【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2011(039)011
【总页数】4页(P6322-6325)
【关键词】木聚糖酶抑制蛋白;TAXI;XIP;TLXI;防御作用
【作者】鄢高翔
【作者单位】安徽农业大学,安徽合肥230036
【正文语种】中文
【中图分类】S188
木聚糖是植物细胞壁多糖中半纤维素的主要成分，主链由D-吡喃型木糖残基通过β-1，4-糖苷键连接而成，主链上一般还带有少量的乙酰基、葡萄糖醛酸基、阿拉伯糖基等侧链取代基［1-3］。

内切-β-1，4-木聚糖酶(EC3.2.1.8，简称木聚糖酶)是专一性水解木聚糖主链的酶，将大分子木聚糖降解成低聚木糖、木二糖及少量的木糖，木聚糖酶主要由微生物产生，但一些藻类、原生动物、甲壳类动物和植物等
也能产生木聚糖酶［4］。

根据催化结构域氨基酸的同源性和疏水簇分析法，木聚糖酶可分为GH10和GH11 2个家族。

已知的禾谷类所产的木聚糖酶都属于
GH10家族，而微生物产生的木聚糖酶则属于F10或G11 2个家族［2］。

许多
有益微生物产生的木聚糖酶已经广泛应用于饲料、面包焙制、淀粉加工、纸浆生物漂白等领域，而植物病原菌的木聚糖酶有2方面作用:一方面，能分解植物细胞壁
而可能促进病原菌的侵染，另一方面，还可能作为诱发子诱发植物的抗病防御系统。

因此植物病原菌的木聚糖酶在植物与病原菌互作机制研究和植物抗病防御领域中备受关注。

植物体为保护其自身免受病原菌木聚糖酶的侵害，也进化出用以对抗病原菌所分泌木聚糖酶的抑制蛋白。

这些抑制蛋白可能通过2种方式抵抗病原菌的侵害，一种是降低病原菌细胞壁降解酶的活性，另一种是确保植物产生具有防御激发子活性的多糖片段，以防这些多糖片段在无抑制蛋白存在的情况下被降解［1］。

目前发现在不同谷物中共有3种类型的木聚糖酶抑制蛋白，根据其结构的不同，
分为TAXI型(triticum aestivum xylanase inhibitor)、XIP型(xylanase inhibitor protein)和 TLXI型(thaumatin-like xylanase inhibitor)。

笔者就3类木聚糖酶抑制蛋白的分子结构、抑制特性及其在谷物中的抗病防御作用等作简要概述。

1 木聚糖酶抑制蛋白的发现及分类
Debyser等［5］最早发现小麦粗蛋白提取物中有能抑制木聚糖酶活性的蛋白组分存在，并从小麦粉中纯化出第1种木聚糖酶抑制蛋白，命名为小麦木聚糖酶抑制
剂(Triticum aestivum xylanase inhibitor，TAXI)。

1999 年 McLauchlan 等［6］在小麦粉中发现第2种木聚糖酶抑制蛋白，其结构特征和抑制特异性都与TAXI型不同，命名为木聚糖酶抑制蛋白(xylanase inhibitor protein，XIP)。

后来这2种
类型的木聚糖酶抑制蛋白先后在黑麦、大麦、燕麦、玉米、水稻等谷物中发现，推测它们可能广泛存在于植物界［7-12］。

2007 年 Fierens等［8］又在小麦中纯
化一种结构上属于甜蛋白家族的木聚糖酶抑制蛋白，命名为甜蛋白样木聚糖酶抑制
剂(thaumatin-like xylanase inhibitor，TLXI)。

TAXI和XIP型抑制蛋白都属于大的多态家族，其中包括许多结构和抑制特性相似或相异的亚型。

2 木聚糖酶抑制蛋白的分子结构和抑制特性
2.1 TAXI型木聚糖酶抑制蛋白
2.1.1 TAXI型分子结构。

Gebruers等［14］从小麦中纯化出TAXI-I和TAXI-Ⅱ2个亚型。

2个亚型具有相似的结构，均由A和B 2部分组成，分子质量都是40 kDa，无糖基化位点。

结构A由一条多肽链组成，分子内至少有一个二硫键，分
子量为40 kDa，结构B由2条分别为29和11 kDa的多肽链组成，多肽链间二
硫键连接。

来自结构B的29 kDa多肽链和来自结构A的40 kDa多肽链的N末
端氨基酸序列相同，从逻辑上推测结构A可能是结构B的前体物，抑制剂需要经
过蛋白水解的修饰作用才具有更高活性。

现已证明结构A具有木聚糖酶抑制剂活
性［5-29］。

Furniss［30］从小麦 Norin61 中克隆出2个新的TAXI型基因——TAXI-Ⅲ和TAXI-Ⅳ，重组TAXI-Ⅲ基因在大肠杆菌中的表达较弱，目前尚未直
接从小麦中纯化TAXI-Ⅲ/Ⅳ蛋白，因此TAXI-Ⅲ和TAXI-Ⅳ抑制蛋白的分子结构
尚不明确［31-50］。

2.1.2 TAXI型抑制特性。

Gebruers等研究表明，TAXI-I和TAXI-Ⅱ2个亚型等电点(point isoelectric，pI)不同，分别在pI8.8左右和pI9.3左右，其抑制特性也有所差异。

按照等电点的高低可将木聚糖酶分为高等电点(pI≥6.0)和低等电点
(pl≤6.0)2种。

等电点较低(pI≤6.0)的4种木聚糖酶中，3种木聚糖酶不会被
TAXI-Ⅱ抑制或抑制能力极低，但却能被TAXI-I强烈抑制［22］。

只有绳状青霉(pI3.7)被2个亚型同时抑制;而对于等电点较高(pI≥6.0)的几种木聚糖酶，其活性
均可被2个亚型强烈抑制［30］(表1)。

其他谷物中的TAXI型抑制蛋白，等电点
都在8.0以上，其中硬质小麦、大麦和黑麦中的TAXI型蛋白等电点都在9.0以上。

Gocsaert等［17-19］发现，大麦和黑麦中的相应抑制蛋白基因的表达产物和小
麦TAXI基因表达产物具有相似性。

Debyser等［5］分析发现TAXI型只抑制GH11家族木聚糖酶，对GH10无作用。

许多学者［51-56］进一步研究表明TAXI-Ⅱ只抑制细菌GH11家族木聚糖酶。

表1 TAXI-I和TAXI-Ⅱ对GH11家族木聚糖酶的抑制情况Table 1 TAXI-I and TAXI-Ⅱactivities towards different family 11 endoxylanases注:an.i为无抑制;b+++为强抑制;+++为中等抑制;+为弱抑制。

Note:an.i stands for zero inhibition;b+++stands for strong inhibition;+++stands for intermediate inhibition;and+stands for weak inhibition.项目Items登录号Accession number TAXI-I TAXI-Ⅱ黑曲霉 P55329 b+++ a n.i Aspergillu niger(pI3.5)绳状青霉 AJ278385.1 +++ +++Penicillium funiculosum(pI3.7)紫变青霉
Z500050.1 +++ +P.purpurogenum(pI5.9)长枝木霉 p36217 +++
+++Trichoderma longibrachiatum(pI9.0)长枝木霉 P36218 +++
+T.longibrachiatum(pI5.5)绿色木霉 AJ012718 +++ +++T.viride(pI8.4)
2.1.3 TAXI型克隆和表达。

Fierens等［21］从小麦嫩叶中提取基因组DNA，通过PCR法扩增到TAXI-I基因的开放阅读框(ORF)，得到1 143 bp的成熟编码序列(GENEBANK中AJ438880)，以pQE16-SSPelB为表达质粒在E.coli WK6细胞中表达，然后通过一系列发酵试验，获得了表达量为1.6 mg/L的培养液。

研究表明重组抑制蛋白的分子量和等电点与天然抑制蛋白均一致，蛋白的稳定性和抑制活性与天然抑制蛋白无差异。

TAXI-I基因在pHOS31、pMALp2x和pBADgⅢ中也均获得表达，且表达水平基本一致。

Fierens等［21］克隆 TAXI-Ⅰ基因，对其进行分子鉴定，发现与胡萝卜表面糖蛋白和水稻、拟南芥中的多拷贝序列相似，但功能不同。

Raedschelders等［56］在大麦、黑麦中也发现木聚糖酶抑制蛋白 HVXI和 SCXI，与 TAXI-Ⅰ序列相似。

Igawa等［50］已克隆 TAXI-Ⅲ、TAXI-Ⅳ的 mRNA 序列，在核酸序列水平上
TAXI-Ⅲ与 TAXI-Ⅰ有 91.7% 的同源性，TAXI-Ⅳ与 TAXI-Ⅰ有92.0%的同源性，TAXI-Ⅲ与TAXI-Ⅳ有96.8%的同源性。

TAXI-Ⅲ和TAXI-Ⅳ基因的表达依赖于病
原体及被侵染的组织。

在根和老叶中TAXI-Ⅲ与TAXI-Ⅳ明显表达，TAXI-Ⅰ的表
达不明显，当用禾谷廉孢菌Fusarium graminearum(小麦赤霉病)和白粉病菌Erysiphe graminis(小麦白粉病)侵染时，TAXI-Ⅲ与TAXI-Ⅳ的转录水平显著增加，而TAXI-Ⅰ的表达非常有限。

在损伤叶片中，TAXI-Ⅰ、TAXI-Ⅲ与 TAXI-Ⅳ都强
烈表达。

TAXI-Ⅲ基因的上游区有一个W盒和GCC盒，这些序列是病理和损伤诱导抑制剂的启动子。

重组TAXI-Ⅲ蛋白能抑制黑曲霉和木霉属木聚糖酶，也能抑制侵染二粒小麦的赤霉病菌的木聚糖酶。

2.2 XIP型木聚糖酶抑制剂 McLauchlan等［6］在小麦中分离纯化出XIP-Ⅰ抑制蛋白，分析表明XIP-Ⅰ为单体糖基化蛋白pI为8.7～8.9，分子量为29.0 kDa，
与伴刀豆球蛋白B和几丁质酶Ⅲ完全同源，但无几丁质酶活性。

XIP-Ⅰ竞争性的抑制属于糖苷水解酶GH10、GH11家族的真菌木聚糖酶。

竞争性的抑制GH11家族黑曲霉和绿色木霉分泌的木聚糖酶。

XIP-Ⅰ与GH10黑曲霉作
用形成一个“手”复合体，与GH11青霉菌形成另一“手”形，表明XIP-Ⅰ有2
个独立的酶结合位点。

XIP-Ⅰ基因的表达受病原体诱导。

Elliott等［22］根据多肽序列数据库设计简并
引物通过Nested-PCR扩增XIP-Ⅰ全长cDNA(GENEBANK:AJ422119)。

然后研
究了XIP-Ⅰ的时空表达，不同的木聚糖酶抑制蛋白有不同的调节控制系统。

XIP-
Ⅰ基因的表达产物主要存在于麦粒组织中，出现在籽粒萌发后期，且在萌发后继续保持，在种子生长和萌发后期仍检测到木聚糖酶抑制活性。

有研究表明纯XIP-Ⅰ
及包含TAXI的粗提物对木聚糖酶无抑制作用。

尽管XIP-Ⅰ在接种赤霉菌的花穗中不表达，但其在白粉病侵染的叶片中的转录显著增强。

XIP-Ⅰ在损伤叶片中也表达，有茉莉酸甲酯存在时显著升高。

XIP-Ⅰ和XIP-Ⅲ分别在核酸和蛋白质序列水平上
有92.2%和87.2%的相似性，50%以上的核苷酸替换导致氨基酸序列的变化。

XIP 的表达与病原体的种类和侵染部位有关。

许多单子叶植物如大麦、黑麦、玉米、水稻中也发现有XIP-Ⅰ，但在高粱中未发现。

后来有学者在六倍体小麦中又发现了一些XIP型基因XIP-R，其中XIP-R1是主要成员，被小麦白粉病菌诱导表达，表明六倍体小麦XIP型基因是一个大家族，仅一些基因在特异的组织中表达参与植物防御。

2.3 TLXI木聚糖酶抑制蛋白 Fierens［21］等在小麦面粉中发现第3种木聚糖酶抑制剂TLXI，其结构与XIP、TAXI型完全不同，和类奇异果甜蛋白有60%以上的相似性，属于一组小的TLPs家族，这类TLPs分子内均含有10个半胱氨酸，形成稳定的二硫键，具有抗真菌活性位点。

TLXI蛋白的pI大于9.3，分子量约18 kDa，多数有O-糖基化位点且位置可变。

TLXI有独特的抑制专一性，非竞争性抑制一些GH11家族木聚糖酶，属于慢性紧密结合抑制剂。

基于TLXI对木聚糖酶的专一性及其与TLPs的同源性，推测TLXI 抑制蛋白在植物防御中起作用。

Fierens等［21］通过PCR扩增到TLXI基因序列的开放阅读框，获得726 bp的编码序列(GENEBANK:AJ786602)，编码26个信号序列，151个成熟蛋白氨基酸序列。

TLXI基因在P.pastoris中表达，SDS/PAGE显示重组蛋白分子量为21 kDa，与分离纯化的TLXI蛋白有差别，获得4 mg/L纯培养液，有
T.longibrachiatum xylanase(XynI)抑制活性。

3 木聚糖酶抑制蛋白在植物防御反应中的作用
谷物中木聚糖酶抑制蛋白含量较大，一般TAXI和XIP型抑制蛋白的含量分别达50～100和200～300 mg/kg。

许多研究结果显示木聚糖酶抑制蛋白通过阻止病原微生物木聚糖酶的水解作用而参与植物的防御反应。

目前已知的TAXI和XIP抑制蛋白只专一性地作用于外源木聚糖酶，而对谷物自身
的内源性木聚糖酶没有抑制活性。

TAXI、XIP和TLXI抑制蛋白在结构上与已知的能抵抗入侵病原菌和参与植物防御作用的蛋白质有序列相似性。

TAXI型抑制蛋白
与胡萝卜细胞外周糖蛋白(extracellular dermalglycoprotein，EDGP)具有很高的相似性。

EDGP存在于植物的表皮和皮层组织中，受创伤诱导大量表达，因此认为EDGP在植物防卫反应中起作用。

与EDGP在植物中的存在位置相似，TAXI蛋白也大量存在于小麦籽粒的皮层(即麸皮)中。

另外，TAXI抑制蛋白与专一性作用于
木葡聚糖的内切葡聚糖酶抑制蛋白(xyloglucan-specificendoglucanase inhibitor protein，XEGIP)也具有序列相似性，XEGIP能够抑制病原微生物来源
的糖基水解酶家族GH12的葡聚糖酶而在植物防御反应中起作用。

XIP型抑制蛋白与植物几丁质酶III在序列和结构上有很高的相似性。

几丁质酶是高等植物普遍存
在的一种病程相关蛋白，受病原菌诱导表达。

几丁质酶一方面通过降解病原真菌细胞壁的几丁质以直接抵抗病原菌;另一方面，通过作用于真菌细胞壁释放的几丁寡
糖激发子而间接引发防御反应。

Durand等［44］推测，XIP抑制蛋白极有可能是从几丁质酶进化而来，而几丁质酶则是由于真菌的侵入而先诱发合成，由几丁质酶进化来的新类型的蛋白质不再作用于几丁质，而是作用于植物木聚糖，具有抑制木聚糖酶的功能，成为木聚糖酶抑制蛋白。

这种方式的进化很有可能使XIP型抑制
蛋白也保留有几丁质酶的信号识别和表达调控途径。

TLXI型抑制蛋白在结构上与
类奇异果蛋白相似，而类奇异果蛋白也是一种病程相关蛋白，受植物病毒诱导表达，因而推测TLXI型抑制蛋白在植物防御中具有一定作用。

3种抑制蛋白对来自特定微生物的不同木聚糖酶都有复杂的识别特异性，这种识别特异性可能是植物为抵抗来自病原菌的多种木聚糖酶而不断进化的结果。

Belien
等［38］研究显示，来自禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的2种GH11家
族的木聚糖酶能被TAXI-I抑制，但不能被XIP-I抑制，Brutus等［39］证实来自灰霉菌的GH11木聚糖酶XynBc1既能被TAXI-I抑制，又能被XIP-I抑制，但不
被TAXI-II抑制。

进一步将XynBc1与灰霉菌的另一型木聚糖酶Xyn11A进行序列比对发现，在4个不同的氨基酸残基中，有2个(Ala48和Val145)都位于酶的
XIP-I作用位点处。

根据上述结果认为，植物的抑制蛋白和植物病原菌的木聚糖酶之间存在一种协同进化机制，在这个过程中，植物体不断进化出不同类型或亚型的抑制蛋白以抵制病原菌分泌的各种木聚糖酶的作用，同时，病原菌则不断进化出对抑制蛋白具有不同敏感性或不敏感的多型木聚糖酶，双方在进化过程中相互选择，互相适应。

TAXI和XIP抑制蛋白的另一个特征是，都受植物创伤和病原菌入侵的诱导而产生。

Igawa等［50］研究表明，在受创伤损害的小麦叶子中，Taxi-I、Taxi-III和Taxi-IV基因强烈表达，小麦在受真菌病原体禾谷镰刀菌和禾白粉菌(Erysiphe graminis)侵染时，Taxi-III和Taxi-IV基因的转录显著增加，但Taxi-I基因转录的增加相当
有限，因此认为Taxi-I是一种组成型表达的防御基因，而Taxi-III和Taxi-IV则进化为病原诱导型的Taxi家族成员。

Xip-I基因的诱导不同于Taxi，小麦在接种禾
谷镰刀菌后并未发现Xip-I基因的转录，但在受到白粉病菌侵染或是受到损伤后，小麦叶子中的Xip-I基因强烈表达。

由此可见，Xip-I基因与Taxi-I基因不同，
Xip-I基因受病原菌诱导表达，但又不同于Taxi-III/IV基因，Xip-I基因的表达不
仅受病原菌诱导，而且还决定于病原菌的种类或受感染部位。

Taxi和Xip基因除
了有不同的诱导模式外，其转录水平还随着植物生长发育条件和发育时期的不同而变化。

综上所述，植物TAXI、XIP和TLXI抑制蛋白不同的分子结构、不同的表达模式和不同的抑制特异性，实际上是不同植物、植物的不同部位以及不同发育阶段在抵御不同种类病原菌所分泌的不同木聚糖酶时所发生的各种防御作用的体现。

4 小结
TAXI、XIP、TLXI 3种类型的木聚糖酶抑制蛋白具有不同的分子结构和抑制特异性。

TAXI型的分子结构与胡萝卜细胞表面糖蛋白相似，只抑制GH11家族木聚糖酶，对GH10无作用。

XIP与伴刀豆球蛋白B和几丁质酶Ⅲ完全同源，但无几丁质酶
活性，竞争性抑制GH10、GH11家族的真菌木聚糖酶。

TLXI在结构上与类奇异
果蛋白同源，有独特的抑制专一性，非竞争性抑制一些GH11家族木聚糖酶，属
于慢性紧密结合抑制剂。

基因组、转录组、蛋白质组水平上研究显示TAXI和XIP
型是2个大的多态家族，其中包括许多亚型，在结构、表达模式、作用特异性等
方面均有差异。

3类木聚糖酶抑制蛋白与木聚糖酶之间存在复杂而精巧的识别方式，推测其可能与病原菌木聚糖酶存在协同进化关系。

研究已经证实这些木聚糖酶抑制蛋白具有参与植物的抗病防御作用，但具体的作用机制尚不清楚，还有待于进一步深入研究。

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