改良Hodge试验用于筛查产KPC肺炎克雷伯菌的临床评价

改良Hodge试验用于筛查产KPC肺炎克雷伯菌的临床评价王暖;陈晋;孙立山;陈慧萍;罗柳林
【摘要】Objective To evaluate the application value of modified Hodge test ( MHT) in detecting Klebsiella pneumonia isolates producing KPC. Methods MHT was used to initially screen KPC from 170 strains of ESBLs pro-ducing Klebsiella pneumonia, then KPC were amplified to sequence by PCR. Results Of the 170 Klebsiella pneu-monia strains, there were 10 strains showing low sensitivity to carbapenems. 8 strains of them were positive by modi-fied Hodge test, and KPC-2 gene were detected in these 8 strains by PCR. Conclusion MHT can accurately detect the clinical isolates of pneumonia klebsiella producing KPC and provide reliable reference for clinical treatment.%目的：初步评价改良Hodge试验在产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌检测中的临床价值。

方法用改良Hodge试验对170株超广谱β-内酰胺酶阳性肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶进行初步筛查,PCR扩增其基因并测序。

结果在170株肺炎克雷伯菌中,10株对碳青霉烯类抗生素的敏感性降低,8株改良Hodge试验筛查阳性,经PCR证实8株均携带碳青霉烯酶-2型基因。

结论改良Hodge试验能准确的筛查出临床分离株中存在的产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌,可以为临床治疗提供可靠的参考。

【期刊名称】《临床肺科杂志》
【年(卷),期】2014(000)009
【总页数】3页(P1563-1565)
【关键词】肺炎克雷伯菌;改良Hodge 试验;KPC
【作者】王暖;陈晋;孙立山;陈慧萍;罗柳林
【作者单位】200433 上海，同济大学医学院附属上海市肺科医院检验科;200433 上海，同济大学医学院附属上海市肺科医院检验科;200120 上海，同济大学医学院附属东方医院检验科;200433 上海，同济大学医学院附属上海市肺科医院检验科;200433 上海，同济大学医学院附属上海市肺科医院检验科
【正文语种】中文
肺炎克雷伯菌(K．pneumoniae，KPN)是常见的临床感染肠杆菌，近年来抗生素的大量使用，使得产超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectr um β Lactamases,ESBLs)菌的报道越来越多，严重者可引起医院感染的流行和爆发。

碳青霉烯类抗生素是目前最有效的治疗产ESBLs肠杆菌科细菌感染的抗生素，属广谱β-内酰胺类抗生素，在临床上经常被用于多重耐药菌株引起的严重感染，近年来，耐碳青酶烯类抗生素的肺炎克雷伯菌屡有报道[1-3]，给临床抗感染治疗造成极大困扰。

肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要是产碳青霉烯水解酶(Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase,KPC)[4]。

为验证MHT(改良Hodge 试验)在检测产KPC肺炎克雷伯菌中的临床意义，本研究对我院近两年分离出的ESBLs阳性KPN进行了MHT初筛，并通过基因扩增和测序实验加以确证，可以为临床合理用药和医院感染的监测提供实验室依据。

一、细菌来源 2012年1月至2013年12月上海市肺科医院临床分离出的肺炎克雷伯菌，用纸片扩散法确证试验检测是否产ESBLs，排除同一病人的重复菌株，共收集ESBLs阳性菌株170株。

质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603，均来自上海市临检中心。

二、细菌鉴定与药敏试验用法国BioMerieux生产的VITEK-2 微生物全自动分析仪进行菌株鉴定并检测常用抗生素的药物敏感性，采用Kirby-Bauer法测定肺炎克雷伯菌对亚胺培南、厄他培南、美洛培南的体外敏感性，按照CLSI2013版执行[5]。

药敏纸片来自英国OXOID 公司，血平板、麦康凯平板、M-H平板等培养基购自上海科玛嘉微生物技术公司。

三、改良Hodge试验(MHT) 将过夜培养的大肠埃希菌(ATCC25922)配制成0.5 麦氏单位浊度菌液，用生理盐水稀释10倍后用棉签蘸取菌液，并在管壁轻轻挤压以去除多余菌液，涂满整个M-H平板表面。

放置于室温15 min后，将一个含有10 μg厄他培南的药敏纸片贴在培养基中心。

以厄他培南纸片为起点，用接种环取肺炎克雷伯菌，从中间向周边划线。

为保证实验效果，每个平板检测数不超过六株为宜。

将平板放置于35 ℃孵箱过夜培养，阳性菌株可见抑菌圈内出现矢状生长，以肺炎克雷伯菌ATCC700603为阴性对照。

四、PCR 鉴定产KPC 的肺炎克雷伯菌用试剂盒提取肺炎克雷伯菌的质粒DNA 为模板，根据文献[6]设计引物进行KPC基因扩增，目的片段长度约为340 bp，用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析。

由上海生工对阳性产物进行测序，测序结果在GenBank数据库中通过Blast比对以确定基因型。

DNA质粒提取试剂盒为Promega公司产品，PCR反应体系和Taq酶购自TaKaRa(大连)公司，其余均为国产分析纯生化试剂。

一、药敏结果对170株肺炎克雷伯菌进行常用的抗生素的药敏检测，结果为阿米卡星、氨苄西林、头孢吡肟、头孢替坦和哌拉西林/他唑巴坦耐药率均大于80%，耐药率低于10%的只有头孢唑林和复方新诺明，见表1。

二、MHT 结果 170株ESBLs阳性肺炎克雷伯菌中有10株对碳青霉烯类抗生素的敏感性降低，见表2。

其中8株MHT实验结果为阳性(见图1)，其余为阴性。

三、PCR 鉴定结果 10 株对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌采用KPC引物扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳观察，发现有8 株细菌为KPC 基因阳性(见图2)。

PCR阳性产物
经测序后，在GenBank 数据库中比对，确定携带的基因型是KPC-2型。

肺炎克雷伯菌属于条件致病菌，也是常见的医院内获得性肺炎的病原菌。

近些年第3 代头孢菌素广泛应用于临床，使肺炎克雷伯菌产ESBLs 菌株的大量产生，给临
床治疗带来极大的困难[7]。

碳青霉烯类抗生素(如厄他培南、美罗培南和亚胺培南等)具有杀菌作用快速，抗菌活性强，抗菌谱广等优点，在临床治疗革兰阴性杆菌
多重耐药株时常被优先选用。

然而随着临床上碳青霉烯类抗生素使用的增多，越来越多的报道出现了对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株[8-10]。

其中产KPC是肺炎克
雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的重要原因。

目前许多微生物实验室使用自动化仪器对临床分离株的药物敏感性进行检测，但因底物的选择和浓度的设置、检测菌种的多样性、对CLSI 新规定的调整不甚了解等，导致一些产KPC 酶菌株不能及时准确地检出或漏检[11]。

早期检测、早期隔离对
控制这类产KPC 酶菌的传播意义重大。

改良Hodge试验(MHT)是美国临床实验
室标准化协会(CLSI)推荐的用来检测肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶的方法。

由于其操作简便，不需要大型仪器，在一般检验科的临床微生物室都可以开展，将检测结果尽早告知临床医生，可以极大的避免耐药菌株进一步播散，也有利于病人早日康复。

本研究对我院近两年临床分离出的ESBLs阳性肺炎克雷伯菌进行了筛查，在170
株ESBLs阳性菌株中，共测得10株对碳青霉烯类抗生素敏感性降低，其中8株MHT阳性，经PCR和测序证实均携带KPC-2基因。

剩余碳青霉烯类敏感的160
株均为MHT阴性。

在本实验中，MHT 实验结果与KPC基因检测结果完全符合，没有发现假阳性和假阴性，表明MHT在检测 KPC型碳青霉烯酶时的特异度和敏感度均较高。

KPC-2基因由质粒介导，具有在不同种属细菌之间转移和传播的特
性[12]，临床应严格管理医务人员的洗手制度、治疗器械的消毒，防止院内交叉感染的产生。

2株碳青霉烯类抗生素敏感性下降但未检测到KPC的菌株可能与产B-内酰胺酶及外膜蛋白的缺失等其他耐药机制有关，有待进一步的研究。

因此，在临床工作中，对碳青霉烯类抗生素敏感性下降的菌株进行MHT筛查是必要的，宜早期进行检测，及时隔离，有助于临床及时使用敏感的抗菌药物，以防止延误治疗。

2.200120 上海，同济大学医学院附属东方医院检验科
【相关文献】
[1] 赵燕,袁轶群,叶琴,等. 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因检测[J]. 中华医院感染学杂志,2013,17:4081-4083.
[2] Mariagrazia Perilli, Carlo Bottoni, Alessandro Grimaldi,et al. Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae harbouring blaKPC-3 and blaVIM-2 from central Italy[J]. Diagn Microbiol Infect Dis? 75 (2013) 218-221.
[3] 罗芸,金大智,叶菊莲,等. KPC型碳青霉烯酶基因荧光定量PCR快速鉴定[J]. 中国公共卫
生,2013,01:138-141.
[4] 陈寅,陈友华. 产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的检测及耐药性分析[J]. 江苏医
药,2013,21:2612-2613.
[5] CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Third Informational Supplement. CLSI document M100-S23. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2013.
[6] 赵书平,姜梅杰,宗桂珍. 检测产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌常用药物敏感试验方法的比较[J]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版),2012,02:93-96.
[7] 范天琼,刘君君. 医院内肺炎克雷伯菌肺炎的危险因素及耐药性分析[J]. 临床肺科杂
志,2013,01:139-140.
[8] 李岷,魏源华,史恒芳,等. 碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的表型和基因型分析[J]. 临床检验杂
志,2012,08:623-624.
[9] 庞峰,李艳华,贾秀芹,赵岐刚. 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的耐药性分析及基因型研究[J]. 临床检验杂志,2013,04:307-309.
[10]董方,宋文琪,徐樨巍,等. 对碳青霉烯类抗生素不敏感肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶基因型研究[J]. 中国感染与化疗杂志,2013,04:270-274.
[11]纪明宇,耿大影,裴凤艳,等. KPC型碳青霉烯酶研究概况及进展[J]. 临床检验杂志,2013,04:282-28.
[12]耿荣华,王晓杰,高华英,等. 肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗菌药物的基因型研究[J]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版),2013,04:56-59.。