1989 Chemiluminescence enzyme immunoassay

分析科学，十月1989卷，5
化学发光酶免疫分析法
Akio Tsuji, Masako MAEDA and Hidetoshi ARAKAWA
药学院，昭和大学，日本东京品川
我们的实验室的研发高度敏感的化学发光酶免疫分析法。

氧化酶，过氧化物酶和葡萄糖氧化酶产生的H2O2，可通过异鲁米诺/微过氧化物酶和过氧草酸酯/荧光染料测定。

使用乳糖/葡萄糖氧化酶的酶偶联反应法基础上，β-D-半乳糖苷酶也能通过化学发光反应测定。

通过使用邻硝基苯-β-D-半乳糖苷酶作为底物和NADH化学发光反应在半乳糖脱氢酶酶偶联反应之后，β-D-半乳糖苷酶能被测定。

蔗糖和光泽精通常作为底物，使用化学发光试剂测定蔗糖酶。

6-磷酸葡萄糖是通过以葡萄糖-6-磷酸为底物的化学发光测定NADH来检测的。

碱性磷酸酶是通过使用NADP+，乙醇脱氢酶和NADH化学发光反应来检测的。

这些方法可以成功地应用于化学发光酶免疫测定生物液体中的各种激素和药物。

关键词：化学发光酶免疫分析法，化学发光，酶，鲁米诺，异鲁米诺，光泽精，双（2,4,6-三氯苯基）草酸，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，17α-羟孕酮，甲状腺素，群集筛查，先天性甲状腺功能减退症，先天性肾上腺皮质增生症
1 引言
自从30年以前雅洛和博森的引进，放射免疫法(RIA)使得浓度极低许多激素和药物的测量成为可能，从而开辟了一个新的高灵敏度检测途径。

尽管它成功了，但涉及使用的同位素标记的抗原或抗体可能造成相关的废物处理，半衰期短和标记辐射问题。

为了避免这些缺点，同时保留特异性的酶免疫分析法，各种改进RIA被开发，如酶免疫分析法（EIA），荧光免疫分析法，粒子免疫分析法，自旋免疫分析法，化学发光免疫分析法，生物发光免疫分析法。

在这些方法中，酶免疫分析法方法是最有用的技术，因为它和放射免疫法一样具有很高的灵敏度。

实验室设备要求相对便宜，容易获得，和反应试剂的价格合理，并有很长的保存期限。

近年来，化学发光和生物发光（CL，BL）分析法对药物和临床诊断的生化分析有着一定的影响，CL是观察到的一种现象，这种现象是当一个激发态的产品转变到基态时产生的化学能以光的形式发射。

大量的分子是能够表现出CL，但只有少数几个能强烈表现出CL，最有名的化学发光反应是鲁米诺，光泽精和活泼的草酸盐。

为了增加免疫分析的灵敏度许多研究者探索了CL或BL的使用。

这些CL和BL免疫测定法已被分为四种类型，如下：（1）免疫分析法使用CL
标签（如—异鲁米诺衍生物或吖啶酯），（2）酶免疫分析法（EIA）依靠CL反应监测（例如，鲁米诺/过氧化物酶/过氧化氢），（3）酶免疫分析法（EIA）依靠BL反应监测（例如，荧光素酶和荧光素），和（4）免疫分析法依靠BL反应使用的辅因子作为标签和监控的手段。

在这篇综述中，化学发光免疫分析法在我们的实验室研究发展已经描述过。

2化学发光反应
2.1、鲁米诺和异鲁米诺
鲁米诺一直是研究最多的CL分子（图1），尽管它有非常广泛的研究但是其在水溶液中详细的反应机理仍然是不清楚。

鲁米诺在碱性过氧化氢和催化剂的存在下发光。

各种氧化剂都能引发反应，许多化合物都能催化或影响鲁米诺反应。

这些化合物的范围可以是从简单的过渡金属离子到大分子，如过氧化物酶。

在水溶液中鲁米诺反应是非常依赖pH值，只有在接近中性的PH值范围7到8过氧化物酶催化鲁米诺/过氧化氢体系才能有效的产生光。

各种异鲁米诺衍生物的合成—因为鲁米诺发光强度随着烷基化和酰基化减弱，特别是5-氨基鲁米诺替代物的乙酰化。

鲁米诺的6-氨基异构体，异鲁米诺，实际上提高了效率烷基化与衍生工具的使用。

氨基丁基乙基异鲁米诺（ABEI）和氨基己基乙基异鲁米诺（AHEI）已应用于化学发光免疫分析法。

我们已经开发了CL酶免疫分析法，以辣根过氧化物酶（HRP）作为标签测定皮质醇和脱氢表雄酮。

”
2.2双（2,4,6-三氯苯基）草酸酯（TCPO）/荧光染料
Rauhut报道的过氧草酸酯型化学发光反应是已知的最有效的非酶化学发光反应，具有量子产率高达25%。

这个利用TCPO /过氧化氢/荧光染料的反应机理如图2所示。

过氧化氢和草酸酯（TCPO）反应，生成中间体可多达105千卡/
摩尔的能量转移到荧光受体。

1,2-二氧乙基二酮是这个反应中假设的关键中间体。

荧光受体成为激活态，然后发出它的特性的光。

舍曼等指出二萘嵌苯在各种荧光芳香族化合物中显示出最强的化学发光反应。

我们重新审视各种水溶性荧光染料，因为它应该可以适应在TCPO化学发光方法的酶免疫分析法系统。

通过利用8-苯胺基萘-1-磺酸盐（ANS）已经获得S/N 比例的最高值。

荧光素在这反应同样表现出良好的反应。

利用TCPO /ANS化学发光分析法测定过氧化氢已经被说明，如图3所示。

该方法的检测限0.1 pmol /检测管，对应10-9mol的过氧化氢。

检测限低于所获得的通过使用异鲁米诺-微过氧化物酶的比色法，荧光法和CL分析法，如表1。

2.3光泽精和N-甲基酯
光泽精（N,N二甲基二吖啶硝酸盐）是一种经典的有机CL试剂，其化学发光产生在碱性溶液中添加过氧化氢或者机剂的还原性化合物。

尼曼等人报道的生物学上重要的还原性化合物的化学发光检测，如葡萄糖，葡萄糖醛酸，透明质酸，抗坏血酸和肌酐。

我们还研究了光泽精和各种有机物的CL反应，并发现含有α-羟基羰基基团的化合物会增强化学发光分析。

尼曼等人建议光泽精CL反应与还原糖反应在1,2-烯二醇互变异构体基础上随后的反应步骤通过光泽精氧化形成。

还原性糖，如葡萄糖，半乳糖，果糖，可以产生光，而甲基苷，蔗糖和山梨醇则不发光，因为他们没有α-羟基羰基基团。

与鲁米诺化合物相比，化学发光反应是能较好的建立。

如图4所示，发光物种是N-甲基吖啶酮。

在免疫分析中光泽精不能用化学发光标记，因为它没有耦合基团。

最近，一个CL吖啶酯被合成并广泛的应用于化学发光标记抗体。

2.4NADH
共同因素，NADH和NADPH是重要的生物物质。

几乎每一种物质生物的兴趣可以使用脱氢酶通过共同因素被测量。

许多已发表的论文使用共同因素分析程序。

光谱光度测量方法和荧光光度法的灵敏度分别为10-5和10-8摩尔/升。

虽然生物发光方法具有非常高的灵敏度，但是细菌荧光素酶试剂太贵了，而且在常规检测中使用不稳定。

因此，使用电子媒介和异鲁米诺—微过氧化物酶在CL反应基础上，我们已经开发出高灵敏度方法对NADH和NADPH进行CL分析。

NADH的化学发光反应原理说明如图5。

NADH或NADPH在电子媒介反应液中还原氧分子为超氧阴离子（02-）和过氧化氢（H2O2）。

威廉姆斯和赛慈用亚甲蓝作为一种电子媒介，但它的反应速率和吩嗪甲基硫酸盐相比是缓慢的。

然而，它见光特别不稳定。

一个更稳定的电子媒介，1-甲氧基-5-甲基-吩嗪甲基硫酸盐（1-MPMS）已被用于CL反应。

在微过氧化物酶存在下产生的超氧阴离子（02-）、过氧化氢与异鲁米诺发生反应并发出光。

如图6所示，NADH和NADPH的工作曲线的线性范围从1pmol到10 nmol /检测（20 umol/L）和检测限为2 pmol /检测。

相比于使用细菌生物发光法荧光素酶/FMN氧化还原酶，该方法的灵敏度较低，但它的灵敏度高于紫外和荧光法。

为了提高NADH的CL检测的灵敏度，通常使用NAD+/NADH的酶循环反应。

原理如图7所示，乙醇/酒精脱氢酶和草酰乙酸盐/苹果酸脱氢酶分别作为底物和辅酶。

酶循环反应之后，在反应混和物中生成的苹果酸转化为草酰乙酸盐，加入过量的NAD+和苹果酸脱氢酶NAD+转化为NADH。

这一步是平衡反应。

因此，为了从反应体系中除去草酰乙酸，谷氨酸和谷氨酸草酰乙酸转氨酶常常被使用在这个反应体系。

最后，NADH可通过上述的化学发光法测定。

检测限为0.03pmol/检测，对应0.05µmol/L。

NADH的检测限的获得通过表2总结的各种方法。

这增强的化学发光分析法比上面提到的化学发光法更灵敏，几乎可以与生物发光法媲美。

3酶的化学发光测定
通过产生光的反应测定酶活性具有许多优点：化学发光检测是非常灵敏，迅速的；通常完成测量在1分钟之内。

因此，为了提高酶免疫分析法的灵敏度，常规酶，过氧化物酶（POD），葡萄糖氧化酶（GOD），蔗糖酶（INV），β-D-半乳糖苷酶（BGase），葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）和碱性磷酸酶（ALP），已确定通过上述的化学发光反应分析法。

对酶的化学发光分析法原理见表3。

3.1，过氧化物酶
通过鲁米诺/过氧化氢化学发光分析法过氧化物酶（POD）可以很灵敏的被测量。

在pH值为8.5时鲁米诺和POD的反应最有效。

随着鲁米诺浓度的增加，发光强度增加，在鲁米诺浓度为10-2M时，最大发光强度可以被观察到。

影响CL的H2O2浓度至少为1x10-2 M。

虽然CL强度是几乎相同的在浓度超过1×10-2 M，CL的衰败在较高的浓度比在低浓度更快速。

当采用Aloka发光器，鲁米诺和过氧化氢溶液的最适浓度都为1×10-4M。

标准典型的POD曲线采用Aloka发光器线性范围是从2.5x10-5到5x10-3 U /检测。

检测限是6x10-10 mol /检测。

3.2葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶（GOD）是一种可以在预孵育期可以产生过氧化氢酶，为了提高系统的灵敏度这个时期应适当地选择。

GOD氧化葡萄糖产生过氧化氢可通过TCPO /ANS化学发光反应测量。

检测限6µU /检测，这相当于320 amol /检测。

当通过皮升模型6500光酶标仪，检测限为30 amol /检测。

3.3 β-D-半乳糖苷酶
β-D-半乳糖苷酶（BGase）可以通过三种GL方法测量，如表3所示。

BGas e是一种可以催化水解乳糖为α-D-半乳糖和β-D-半乳糖的酶。

从酶耦合（GOD）反应产生的过氧化氢利用异鲁米诺/微过氧化物酶或过氧草酸酯/荧光染料的化学发光反应测量。

通过异鲁米诺/微过氧化物酶测定的BGase典型标准的曲线范围为6.3×10-3到6.3×10-1U/ml，通过TCPO/ANS测定的BGase典型标准的曲线范围为1.25×10-4到2×10-3U/mL。

检测限分别为5×10-15mol和1.6×10-17mol/测定。

最近，基于上述NADH化学发光反应我们还开发了一个新的BGase CL分析法。

测定原理是耦合分析系统，如表3所示。

邻硝基苯基作β-D-半乳糖苷酶为底物，通过BGase水解产生半乳糖。

在β-D-半乳糖脱氢酶存在下D-半乳糖与NAD +
反应生成半乳糖酮和NADH。

然后用1-MPMS /异鲁米诺/微过氧化物酶系统化学发光分析测定NADH。

典型的标准曲线线性范围从1×10-19到1×10-15mol/检测。

这种方法更比上述方法更灵敏。

通过各种方法得到BGase检测限的列表见表4。

石川等人报道虽然CL的方法相对于利用细菌荧光素酶生物发光法对NADH的测定灵敏度稍低.但CL方法比色法和荧光方法灵敏度更高。

3.4蔗糖酶
CL方法检测蔗糖酶（INV）的原理如表3所示。

INV（蔗糖酶）是催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖的一种酶。

虽然蔗糖不是还原性糖但D-葡萄糖和D-果糖是还原性糖。

因此，通过添加光泽精溶液进入水解蔗糖溶液即可产生强光。

典型的标准曲线范围为1.25×102到1x104µU /检测。

检测限为125µU /检测，对应7.4×10-6 mol。

3.5葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）经常用于各种同性质的EIAs。

它通常通过紫外或者荧光的分析方法测定活性。

化学发光分析的G6PDH的原理如表3所示。

从酶促G6PDH反应生成的NADH是通过 2.4节中提到的NADH CL反应分析方法测定。

化学发光强度与G6PDH之间的线性关系从1×10 -18到1×10 -14mol/检测；检测限是1×10 -18mol，这比利用固定化酶/ FMN氧化还原酶法的生物发光方法测
定值（1.5×10-15 mol）低1000倍。

通过引入一种酶的改进循环法作为一种放大器提高CL检测G6PDH的灵敏度。

在G6PDH酶促反应后，加入过量的碱液使过量的NAD +分解，生成的NADH用第2.4节描述的增强的化学发光法测量。

工作曲线范围从3×10-21到3×10-17mol/检测。

该方法的检测能力比CL法高300倍。

3.6碱性磷酸酶
碱性磷酸酶（ALP）也广泛用于EIAs。

在碱性介质中它催化水解磷酸单酯。

几种底物被提出了用于分光光度法或荧光光度法测定ALP。

基于偶联酶反应CL 检测ALP的发展。

三方法已制定，他们的原理如表3。

方法一：1-磷酸葡萄糖作为底物，GOD作为耦合酶；方法二：1-磷酸半乳糖作为底物和D-半乳糖脱氢酶；方法三：以NADP+为底物，乙醇脱氢酶作为耦合酶。

在方法一中，利用异鲁米诺/微过氧化物酶化学发光法测定产生的过氧化氢。

NADH的CL分析检测方法常常用于方法二和三。

利用CL检测方法和其他方法得到的碱性磷酸酶的检测限对照如表5。

较其他2种方法，使用NADP+的方法三灵敏度更高。

检测限为0.25pg/ml，对应2×10-18 mol /检测。

这个值是比使用对硝基苯磷酸盐的比色法低，而一阶大于使用NADP +/酒精脱氢酶/黄递酶的酶扩增方法。

通过耦合酶循环法可提高CL检测方法的灵敏度。

4化学发光酶免疫分析法
为了提高检测系统的灵敏度，关于CL EIA的许多研究已经开展了。

我们已经开发了各种CL EIAs，总结如表6。

具有代表的系统使用CL EIAs，如图8所示。

在免疫反应后双抗体固相法分离法被用于分离结合和游离部分。

分离后，CL反应测定酶的活性。

这一章讲述了我们的实验室中几种典型的CL EIAs研究。

4.1甲状腺素
先天性甲状腺功能减退症是比较多见的预防引起智力低下的原因。

目前大规模的新生儿筛查试验先天性甲状腺功能减退症，促甲状腺激素（TSH）测定和或甲状腺素（T4）干血斑滤纸卡已经被实施两项或者其中的一项。

最近，在许多
没有放射性同位素实验室筛查中心对非同位素筛查试验的方法有一定的需求。

在日本，我们已经成功地使用BGase的TSH荧光EIA进行了常规筛查，HRP作为标记酶改进了ELISA检测方法。

在同一样品中有必要进行TSH和T4平行检测。

虽然有几个T4-EIAs被报道，因为其灵敏度低它们不能用于大多数筛选试验。

因此，针对可用于筛选先天性甲状腺功能低下症T4测定，我们已经开发出一种高度灵敏的化学发光EIA。

在半抗原的EIAs中，抗体与半抗原标记酶结合对灵敏度有明显的影响：使用相同的或不同的衍生物在“同源”或“杂性”组合。

因此，四种抗血清抗T4和T4-GOD结合物的各种组合进行检查，以获得最高灵敏度。

给定的替代结果如图9所示，共轭戊二醛处理制备T4-GOD偶联物似乎是最有效的标记本研究中制备抗血清。

使用anti-T4 -hemiglutarate-BSA和T4-GOD共轭准备戊二醛的异源桥系统最为敏感，因为它被选中。

通过TCPO /ANS的化学发光反应系统，我们有建立了使用GOD和过氧草酸酯CL EIAs。

程序和典型标准曲线如图10所示。

T4的检测限为0.25µg/dl，相当于5pg（6.43 fmol）/检测。

该方法的精度是足够的，是类似于在干血样本中T4的其他EIA或RIA。

使用此CL EIA和自动填充新生儿T4 RIA试剂盒，测定50例新生儿干血。

两种方法确定的T4值有效的线性相关系数是0.91，斜率0.454，和Y截距0.343。

这个该方法被推荐用于大规模的初步筛查新生儿先天性甲状腺功能低下症。

4.2 17α-羟孕酮
先天性肾上腺皮质增生症（CAH），一个障碍肾上腺甾类产生，是已知的主要引起HLA与21羟化酶连接失效因素，然而21羟化酶是皮质醇合成所必需的原料。

这21羟化酶缺陷导致过度分泌ACTH和皮质醇前体的生产和积累，特别是17α-羟孕酮（17-OHP）。

在新生儿中，经常采用RIA 或者EIA测量17α-羟孕酮，被用于诊断，管理和CAH筛查。

使用HRP标记酶的荧光EIAs和ELISAs 在开发和伴随着双草酸酯-荧光染料系统的过氧草酸酯化学发光反应使用GOD
的CL的EIAs也在开发。

最近，在上述提到的NADH的CL分析法的基础上，使用G6PDH和BGase 的CL的EIAs发展。

如上所述，“同源”和“杂源”系统性研究。

各种anti-l7-OHP抗血清和17-OHP
酶结合物组合进行了试验检查，以获得最高的灵敏度。

从各种组合获得17-OHP 的50%位移值和检测限如表7所示。

当硫醚衍生物（4 CMT和4CET）用于制备免疫原和酶标结合物，桥异源系统（三）使用从17-OHP有一个短桥比用于制备抗体获得的类固醇酶灵敏度更高，而系统使用更长的桥（二）是没有效的。

同源系统的灵敏度（一，四、五）也较低。

这个结果和Hosoda等人得到的结果相似。

这个现象解释抗体和标记酶之间的空间相互作用。

相对于在同源的情况下，桥异源系统可以通过在标记酶使用较短或较长的桥增加灵敏度，由于抗体和标记酶之间的空间位阻降低标记中的抗原决定簇的抗体的亲和力。

异源系统点的灵敏度（六、七、八）均低于桥异源系统（二）。

从这些结果得出结论，该桥的异源系统的使用anti-l7-OHP抗血清抗17-OHP-4CET-BSA和17-OHP-4CMT-enzyme共轭是最对于l7-OHP最灵敏的组合。

从上面的结果，使用G6PDH和BGase作为标记酶的CL EIAs开发与桥异源组合系统在通过l7-OHP-4CET-BSA制备的l7-OHP抗血清和17-OHP-4CMT-enzyme之间共轭。

通过第3.3和3.5 节描述的CL分析法可以测定双抗体固体酶结合物的活性。

使用BGase作为标记酶的l7-OHP的CL EIA过程和典型标准曲线如图11所示。

可测量的范围从0.05到100pg/检测和检测限为0.05pg/测量，对应于0.1amol。

在每个17-OHP水平的相对标准偏差为在1.0%到11.7%的范围内。

利用G6PDH CL EIA得到的标准曲线和利用BGaseCL EIA得到的相似；测量范围从0.1到100pg/测量。

相对标准偏差从6.0%到8.2%。

在滤纸（3 mm）上发现新生儿干血样本的17-OHP值的测定是利用G6PDH CL法和利用HRP酶ELISA法。

通过上述方法获得的17-OHP值之间的相关性是令人满意的；Y（CL EIA）= 0.98x（ELISA）+1.25，r=0.93，n=29。

5结论
使用CL反应可以提高酶测量的灵敏度。

基于鲁米诺，光泽精，TCPO / ANS 和NADH CL反应的酶的各种化学发光分析法全都被开发。

检测中使用的CL试剂价格低廉。

这些方法可以成功地应用于CL EIAs测量各种在生物流体种的激素和药物。

这里描述的CL检测可能适用于各种使用过氧化氢或产生NADH的酶系统EIAs。

此外，利用酶循环的方法有可能改善灵敏度。