种子摇瓶制备操作规程

种子摇瓶制备操作规程
种子摇瓶制备操作规程
目的：制备酶液用于酶解生产糖液，熟悉摇瓶种子制备工艺
范围：种子斜面、培养皿制备，一级、二级摇瓶种子制备
职责：根据工艺制备合格的摇瓶种子，制得酶液，考察无菌操作。

内容：
1 一级种子斜面、培养皿制备
1.1 制备前准备
1.1.1 需用器具与设备与用途
1.1.2 配制培养基清单（按200ml计算）
1.2.3 称量过程中需填写《斜面种子配制与灭菌记录》。

1.2.4 物料批号与厂家根据实际情况调整后做好记录。

1.2 培养基配制
1.2.1 量取50ml纯化水倒入500ml烧杯中，放入水浴锅中加热到50℃。

1.2.2 加热少许酶粉，搅拌均匀，加入按配料清单称量好的魔芋粉，在50℃搅拌5分钟后
将烧杯拿出水浴锅。

1.2.3 将需称量物料按百分比放大10倍称量。

称取0.3g磷酸二氢钾，定容配置为100ml
溶液，充分溶解后用10ml移液管量取20ml溶液加入500ml烧杯中。

1.2.4 除琼脂粉外，按配料单将称量好的原料倒入烧杯溶解。

称量时一人称量一人复核，
认真核实产品名称、数量和厂家。

1.2.5 溶解过程应当缓慢倒入，充分溶解，特别注意酵母浸粉和蛋白胨的溶解，粉末较细，尽量不要结团成球。

溶解完毕后测量PH并记录。

1.2.6 溶解完毕后打开电炉，将配置好的培养基溶液放在电炉上加热至沸腾，缓慢倒入琼
脂粉，并均匀搅拌，确保充分溶解，防止结团成球。

1.2.7 量筒量取130ml水加入烧杯中，用试纸测大概PH，迅速量取6或8ml，分别装入12
支试管中，盖上试管塞，等待灭菌。

1.2.8 将剩余料倒入锥形瓶中，盖上瓶塞等待灭菌。

1.3 培养基灭菌
1.3.1 将装有琼脂液锥形瓶、12支装琼脂试管、6个包裹好的空白培养皿放入灭菌锅内。

1.3.2 检查锅内液位，盖上灭菌锅盖，插上电源开始升温。

1.3.3 升温到灭菌锅内冷空气排尽，开始有热蒸汽冒出后关闭灭菌锅上两排气阀。

1.3.4 当压力上升到0.11MPa，温度121℃时开始计时，保温20分钟。

1.3.5 保温完毕后用镊子缓慢打开灭菌锅两排气阀，自然排气降温。

1.3.6 冷却后取出锅内物品，放入传递窗，打开紫外灯照射5min 后关闭紫外灯，准备传入洁净间进行接种。

1.3.7 填写《斜面种子配制与灭菌记录》。

1.4 接种前准备
1.4.1 打开微生物检查洁净间空调，打开超净工作台电源，调节风量风净工作台。

1.4.2 检查超净台上必备的酒精灯、打火机、接种针、酒精棉、镊子、试管架、斜面架。

1.4.3 从细胞库冷冻冰箱取出一支甘油冷冻管，填写相关记录。

冷冻管需冰冻保存。

进入
洁净区域前将冷冻管管放入传递窗待用。

1.4.4 按洁净区域更衣程序进入洁净区域，穿戴好洁净服，带口罩，带一次性手套。

1.4.5 用酒精棉擦拭超净台，点燃酒精灯，观察火焰情况，调整风量。

1.4.6 将传递窗内的物品拿到超净台内，用酒精棉擦拭接口处。

1.4.7 将试管斜铺放置子斜面架上，保证斜坡末端在试管2/3处。

1.4.8 火焰保护下将锥形瓶中的培养基倒入培养皿中，液体盖住培养皿表面即可。

操作时1.4.9 等待培养基冷却固化，取6支用于后续无菌考察。

1.5 接种
1.5.1 用酒精灯外焰灼烧接种针，铁丝部分需烧红，后面手持部分灭到高于进试管区域。

1.5.2 在火焰保护作用下打开冷冻管，放于距离火焰5-10厘米处。

1.5.3 在火焰保护下用夹子打开斜面，用灭菌后的接种针取约一滴种子液接入斜面。

1.5.4 接入时采用划线方式，S型在斜面上划线。

1.5.5 划线完毕后将试管塞在火焰保护下盖上，同时用火焰灼烧接种针灭菌。

1.5.6 按以上操作重复将6支斜面接种，按顺序编号并写上日期和
批号接种人
1.5.7 按相同操作火焰保护下打开培养皿上盖，开度约30°角。

用沾有种子的接种针在培养皿上划线，划线方式为以1/4圆面为基准，选一面划4条后顺时针在邻近的1/4圆面将原有的条线上划开4条线将菌分散，然后再瞬时针在邻近的1/4圆面上划4条线。

1.5.8 划线完毕后盖上培养皿，将培养皿倒扣。

重复上述操作接种4个培养皿。

按顺序编号并写上日期和批号接种人，划线时不能划破培养基。

1.5.9 熄灭酒精灯，清理桌面。

将接种后的斜面和培养皿放入传递窗。

1.5.10 接种完毕后填写《种子接种培养记录》。

1.6 一级种子斜面（培养皿）培养
1.6.1 将接种和空白培养皿、斜面放置在恒温培养箱内。

1.6.2 设置培养箱温度32℃。

培养时间根据菌落情况确定
1.6.3 菌落选择单独的，没连成一片，便于观察的，单菌落直径在1.5-2mm，边缘光滑呈乳白色的。

1.6.4 菌龄达到22h,菌落成形，无杂菌正常后准备转接种或移种。

1.6.5 培养过程中需填写《种子接种培养记录》，记录过程温度和转种时间，无菌情况，培养周期。

2 一级种子摇瓶制备
2.1 制备前准备
2.1.1 需用器具与设备与用途
2.2.3 称量过程中需填写《一级种子配制与灭菌记录》。

2.2.4 物料批号与厂家根据实际情况调整后做好记录。

2.2 培养基配制
2.2.1 操作参见1.2.1-1.2.5节，除麸皮粉外将所有物料溶解。

2.2.2 单独称量麸皮粉，平均分为3等份后分别倒入100ml锥形瓶中。

2.2.3 用量筒分别量取30ml培养基溶液倒入锥形瓶中，摇匀，盖好瓶塞。

2.2.4 用纱布包住锥形瓶口，准备灭菌
2.3培养基灭菌、接种前准备
2.3.1灭菌方式、接种前准备可参见一级斜面（培养皿）操作过程。

2.3.2 进超净台物品包括空白培养皿2个，100ml锥形瓶3个，一级种子斜面培养皿，其
它接种必备物品。

2.3.3 灭菌完成后填写《一级种子配制与灭菌记录》，记录灭菌温度时间。

2.4 一级种子摇瓶接种
2.4.1 在超净台下选择合适的单菌落用于接种。

将接种的培养皿或斜面放置距火焰5cm。

2.4.2 火焰接种保护下打开锥形瓶瓶塞，将需要接种的单菌落接入锥形瓶的液体培养基中，注意接入前将接种针在空白面上冷却。

2.4.3 接入后搅拌接种针，同时注意不要碰到瓶口，抽出接种针后
盖上瓶塞。

2.4.4 将接种针接入空白培养斜面上，用做无菌对照参考。

2.4.5 接种针在火焰上灼烧灭菌。

2.4.6 重复上述操作将2个空白培养皿接种。

2.4.7 培养皿的接种和无杂菌控制培养可参考一级种子斜面培养皿接种操作。

2.4.8 熄灭酒精灯，清理超净台，将接种后的锥形瓶和斜面、培养皿拿入传递窗。

2.4.9接种完毕后填写《种子接种培养记录》
2.5 一级种子摇瓶培养
2.5.1 培养前应将培养间清洁，并用75%酒精对空间消毒。

2.5.2将无杂菌判断用的斜面和转接种培养皿放置在32℃培养箱内。

2.5.3 将3个锥形瓶放入摇床培养。

2.5.4 培养温度32℃，振幅200rpm，培养时间根据酶活情况定
2.5.5 22h左右取样5ml左右测酶活，酶活在200u/ml左右时准备转种。

2.5.6 培养过程中需填写《种子接种培养记录》，记录过程温度和转种时间，无菌情况，培养周期。

2.6 无菌取样操作
2.6.1 将需要取样的摇瓶用酒精浸润过的纱布搭在瓶口，通过超净台传入洁净区。

2.6.2 取三只空白斜面一同放入超净台用做无菌考察，三个离心管、吸液管用于取样。

2.6.3 在火焰保护下打开摇瓶，用吸液管吸取5ml左右料液，盖上摇瓶瓶塞。

如果是大摇瓶取样吸取数量10ml左右。

2.6.4 将5ml料液分别滴入空白斜面和离心管内，离心管内料液不低于3ml/6ml。

2.6.5 重复上述操作，将取样后的空白斜面放32℃恒温箱培养，离心管送QC检验酶活。

2.6.6 对考察酶活样品可直接无菌控制操作后将酶液倒入烧杯，用
显微镜观察菌丝形态或是无杂菌情况。

2.7注意事项
2.7.1 培养基量与摇瓶量均按实际生产而定。

2.7.2 移液管应选取吸嘴断开的，防止因麸皮粉堵塞吸嘴的情况无法吸液。

2.7.3 接种完后的斜面和培养皿高温灭菌。

3 二级种子摇瓶制备
3.1 制备前准备
3.1.1 需用器具与设备与用途
3.1.2 配制培养基清单（按2000ml计算）
3.2.3 称量过程中需填写《二级种子配制与灭菌记录》。

3.2.4 物料批号与厂家根据实际情况调整后做好记录。

3.2培养基配制、灭菌
3.2.1 配制、灭菌操作参见一级摇瓶种子培养基配制。

3.2.2 最后分别称量麸皮粉和碳酸钙，依次倒入锥形瓶中，用量筒分别量取200ml培养基倒入摇瓶中，摇匀。

3.2.3 6-水氯化钴配制方式参考磷酸二氢钾配制。

3.2.4 灭菌时根据摇瓶数量确定灭菌锅数量，移液管用报纸包住灭菌，选择粗口移液管。

3.2.5 灭菌完毕后填写《二级种子配制与灭菌记录》，记录灭菌温度与时间。

3.3 接种
3.3.1 前期无菌准备操作见一级种子摇瓶接种。

3.3.2 在火焰保护下打开一级种子摇瓶瓶塞，打开二级种子摇瓶瓶塞，将移液管取出后在
火焰上烧一下。

3.3.3 将移液管伸入一级种子摇瓶内，用洗耳球吸取2-5ml种子液，移入二级种子摇瓶中。

盖上二级种子摇瓶瓶塞，盖上一级种子摇瓶瓶塞。

3.3.4 移液过程中不要碰到瓶口，一根移液管对应一个种子摇瓶。

接种完毕后将移液管在
空白培养基上划线，用于无菌观察。

3.3.5 重复上述操作将一级种子液移入二级种子摇瓶中，摇瓶上用记号笔记录接种人与对
应摇瓶号便于追溯。

3.3.6 熄灭酒精酒精灯，将摇瓶放入传递窗，清理超净台。

3.3.7 接种完毕后填写《种子接种培养记录》，记录接种量，接种批号。

3.3.8接种完后的剩余的一级种子液高温灭菌。

3.4 二级种子摇瓶培养
3.4.1培养前应将培养间清洁，并用75%酒精对空间消毒。

3.4.2培养温度32℃，转速200rpm.
3.4.3 培养22h后无菌取样测酶活，将剩余酶液镜检观察无菌情况。

3.4.4 根据酶活情况和无菌情况，将摇瓶接入发酵罐或是离心提取酶液。

3.4.5 酶活700u/ml属于正常，低于此标准需要分析原因。

3.4.6 摇瓶培养过程中填写《种子接种培养记录》，记录培养温度，摇床振幅，培养周期，无菌情况。

3.4.7 培养完后种子液根据实际情况选择上罐或是离心收集酶液。

4. 引用记录与规程
4.1 《斜面种子配制与灭菌记录》
4.2《一级种子配制与灭菌记录》
4.3《二级种子配制与灭菌记录》
4.4《种子接种培养记录》
4.5《镜检与无菌检查操作规程》
4.6《超净台操作使用记录》
4.7《设备使用维护保养记录》。