土壤磷酸酶测定中不同缓冲溶液对显色液吸收波长的影响

土壤磷酸酶测定中不同缓冲溶液对显色液吸收波长的影响
摘要:确定了土壤磷酸酶测定时最大吸收波长以及显色时应加入的最佳pH缓冲溶液｡研究结果表明,加入pH为8.0~10.0的缓冲液时显色时间快,在可见光区的最大吸收峰在604 nm处,其中以pH 9.0的吸光度最高,摩尔吸光系数为1.717×104 L/(mol·cm),灵敏度较高｡因此确定加入的最佳缓冲溶液pH为9.0,同时选择604 nm 作为最大吸收波长｡
关键词:土壤磷酸酶;缓冲溶液;吸收波长;pH;测定
Effects of Different Buffer Solution on Absorption Wavelength in Determination of Soil Phosphatase
Abstract: The maximum absorption wavelength and the optimal pH buffer solution in determination of soil phosphatase had been determined. The results showed that the buffer pH in the range of 8.0~10.0 colored fast, and the maximum absorption peak was 604 nm. The absorbance of the solution added the buffer (pH=9.0) was the maximum, and the molar absorptivity was 1.717 × 104 L/(mol·cm). The suggestion was that the optimal pH buffer solution was 9.0, and 604 nm was chosen in determination of soil phosphatase.
Key words: soil phosphatase; buffer solution; absorption wavelength; pH; determination
土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶,其活性高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性,可作为反映土壤磷素水平的一项生物指标[1]｡目前常用的测定方法为有机基团含量法[2],但测定时波长的选择上却不一致,分别有578 nm[3,4]､600 nm[5]､660 nm[2,6]｡同时在吸取土壤滤液进行显色时,加入一定体积的缓冲溶液的pH值也不统一,有9.0[4]､9.4[2]､9.6[3]｡根据这些情况,本研究对土壤磷酸酶测定时不同缓冲溶液对显色液吸收波长的影响进行了研究,并在波长与缓冲溶液的选择中得到最优结果｡
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器U-3010紫外-可见分光光度计(日本日立);1 cm石英比色皿;50 mL 容量瓶｡
1.1.2 试剂酚工作液:1 g重蒸酚溶于蒸馏水中,稀释至1 L,贮于棕色瓶中,取
10 mL 酚溶液稀释至1 L(每毫升含0.01 mg苯酚)即为酚工作液;氯代二溴对苯醌亚胺试剂:0.2 g氯代二溴对苯醌亚胺溶于100 mL无水乙醇中;系列缓冲溶液的配制:pH 5.0~5.8采用乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制,pH 6.0~7.8采用磷酸盐-柠檬酸盐缓冲溶液配制｡pH 8.0~9.0采用硼酸-硼酸盐缓冲溶液配制,pH 9.2~10.0采用硼砂-氢氧化钠缓冲溶液配制｡配制方法见文献[2]｡
1.2 实验方法
吸取10 mL酚工作液(0.01 mg/mL)于50 mL容量瓶中,分别加入5 mL上述配制的不同缓冲液,摇匀后加入6滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂,显色后稀释至刻度,30 min后用1 cm 石英比色皿,以试剂空白作参比,在U-3010紫外-可见分光光度计上进行波长扫描,并绘制吸光度随波长变化曲线｡确定最大吸收波长后,在该波长下进行显色液吸光度随时间变化的试验｡
2 结果与分析
2.1 不同缓冲溶液下显色时间
不同缓冲溶液下显色液开始显色时间见表1｡从表1可以看出,加入pH低于8.0(pH 5.0~7.8)的缓冲溶液的显色液显色时间缓慢,甚至不显色,而pH高于8.0的则显色较快｡同时在试验过程中观察发现,显色缓慢的显色液的颜色很浅｡
2.2 不同缓冲溶液下显色液波长扫描与最大吸收波长
对显色较慢的未进行波长扫描,pH 8.0~10.0的不同缓冲溶液下显色液波长扫描曲线见图1,最大吸收波长值见表2｡通过图1､表2可以看出,显色液在紫外区与可见光区均有最大吸收峰｡不同缓冲溶液下显色液在紫外区的最大吸收波长不一致,在268~310 nm之间出现波动变化,而在可见光区最大吸收波长则较一致,除pH 8.6与9.6 为605 nm外,其余缓冲体系下最大吸收波长均为604 nm｡
2.3 不同缓冲溶液下显色液吸光度随时间的变化
通过图2可以看出,不同缓冲溶液下吸光度随显色时间的延长表现出不同变化,pH 8.0､8.2､8.4､8.6缓冲溶液下显色液吸光度随时间的延长出现持续上升的趋势,其他pH条件下则表现为30 min后溶液吸光度呈现稳定的状态｡就实验的结果来看,2 h内在pH 9.0~10.0下的显色液中形成的配合物稳定｡在显色30 min后稳定的显色液中,从图中可以看出,pH 9.0的吸光度最高,在0.365附近,其摩尔吸收系数为1.717×104 L/(mol·cm),灵敏度较高｡其次为pH 9.4和9.2,二者摩尔吸收系数分别为1.299×104 L/(mol·cm)､1.233×104 L/(mol·cm)｡缓冲液pH 9.8的吸光度最低,其次为pH 10.0｡
3 小结与讨论
通过本试验研究表明,不同缓冲溶液对土壤磷酸酶测定时显色液吸收波长有一
定的影响｡pH值低于8.0的缓冲液不利于溶液的显色,显色时间缓慢,pH 8.0~10.0的显色时间快,在紫外区与可见光区分别有最大吸收峰,但紫外区的吸收波长彼此不一致,可见光区的则在604 nm处｡。