第八章 哺乳动物细胞克隆

8.1 动物克隆技术发展简史与意义 8.1.1 简史 由“胚胎分割”开始。1978年，建立了 卵裂球分离和桑葚胚分离技术。之后对胚胎 分割程序简化和提高胚胎分割效率研究；现 已发展到不依赖于显微操作，而在实体显微 镜下操作的胚胎分割。 在胚胎分割基础上，开始“细胞核移植” 研究。“细胞核移植”才是技术含量最高的 动物克隆。
17、克隆雪貂 2004年，就职于美国 依阿华大学的李子义教授成功培育 出了世界首批“克隆雪貂”，
18、克隆水牛 印度克隆出的 世界上的首头水牛已经死于肺 部感染。
19、克隆狗 2005年，韩国汉城国 立大学兽医学院的科学家率先在世 界上首次成功进行了狗的克隆。
20、克隆狼 首尔大学教授李柄 千和申南植领导的研究小组于 2005年10月18日和26日先后获得 了两头体重分别为430克和530克 的雌性克隆狼。 两只克隆狼的名字分别为 Snuwolf和Snuwolfy。被克隆的 灰狼是韩国环境部指定的1级野 生保护动物。
(1)原理
胚胎细胞核移植到成熟卵母细胞中，可 因其特殊因子的作用，使植入的核基因 表达被重新编排或调整，将“发育钟” 拨回到受精状态，即恢复全能性。 胚胎干细胞具有全能性及调整能力。 胎儿成纤维细胞和成年体细胞等分化细 胞在经过“去分化”培养后，可以恢复 其全能性。
(2)细胞核移植技术
①受体胞质的准备 第一,有三种做核受体的胞质：卵母细胞 （MⅡ期）胞质、原核期受精卵胞质、2C胚 胎的胞质。 研究表明，以MⅡ期卵母细胞胞质为核移植 的受体细胞最好,目前应用也最普遍。 卵母细胞来源有两种：超排（数量少）、屠 宰场收集卵丘--卵母细胞复合体（COC）在体 外培养成熟后作为受体（数量大）。
5、克隆山羊 世界上第一批三只克 隆山羊已由美国一家生物公司于 1998 年“制造”出来。克隆山羊 Mira和她的姐妹们都来自美国的实验 室，它们生产含有人类抗凝血酶-3 （antithrombin lll ）的羊奶。
6、首个克隆猪 英国产生克隆绵羊 “多莉”的公司，在美国的分部成功 地产生了5头克隆猪。
（2）克隆动物研究意义
基础研究
遗传育种
转基因动物乳腺生物反应器
濒 危 动 物
器官移植
克 隆
动物模型
治 疗 性 克 隆
8.2 产生遗传相同个体(克隆）的原理与方法


胚胎分割 细胞核移植（包括连续细胞核移植或 继代核移植或重复克隆）。 以奶牛为例，产生相同遗传个体的方 法有五种：①胚胎分割；②胚胎细胞； ③胚胎干细胞；④胎儿成纤维细胞； ⑤体细胞克隆等。




在分子层次上，---“分子克隆”。将DNA片段 插到一个载体中，在宿主细胞中自我复制。 在细胞层次上，---单克隆抗体。指由一个单一 的共同祖先细胞所形成的一个细胞“群体”。 在个体层次上，克隆是指基因型完全相同的2 个或更多个体组成一个“群体” 。 1997年，世界卫生组织（WHO）解释克隆： 克隆为遗传上同一的机体或细胞系（株）的无 性繁殖。


研究表明，哺乳动物从早期分裂阶段到 原肠胚胚胎都能够复制。此后，胚胎的 发育能力会随着胚胎所达到的发育阶段 而改变。 如：分割胚的胚细胞只负责构成胚盘， 胚盘的正常发育需要滋养层细胞。所以, 在分割胚时应包括应滋养层细胞，否则 不足以引起妊娠产仔。
（1）卵裂球分离培养法


用吸管固定胚胎，用玻璃针自上而下切开透明 带使其形成一个切口，用微吸管自切口处伸入 透明带吸住半数卵裂球，等分胚胎为两部分。 将分得的半胚装入空透明带中，置于血清中使 其中充满血清。 琼脂包埋后，移入受体输卵管。 培养3～5d,发育到桑葚胚或囊胚时回收琼脂筒； 去掉琼脂，选择发育好的胚胎进行移植，产仔。
12、克隆老鼠“拉尔夫” 大 老鼠难以复制，2002年复制的 名为“拉尔夫（Ralph）”的老 鼠是第一只。
13、克隆骡子 2003年5月5日，一头 名为“Idaho Gem”的骡子在母驴子 宫中经过346天的正常妊娠期后降生。
克隆骡子：“爱达荷宝石”



2003年5月29日,美国科学家宣布克隆了一头骡子，为 世界范围内第一次克隆出马科动物，也是克隆杂种动 物的首次成功尝试。 方法：从骡子胚胎细胞核内提取DNA（脱氧核糖核酸）， 将其与去核的马卵母细胞细胞结合.形成杂种胚胎。 该成果意义:首先,有助于克隆其他自身繁殖有困难的 濒危动物;其次,对研究癌症等疾病有重要的参考价值。 一些癌症患者细胞内Ca2+含量异常高。而马科动物细胞 内的钙含量比人低,已识别出其细胞中含有一种化学物 质,能够抑制细胞内钙含量增高。
14、克隆马 意大利克雷莫纳的 再生技术实验室的研究人员于2003 年5月底克隆出了第一只驮马，这 意味着马也加入了猫、山羊、母牛、 兔子以及绵羊等被人类克隆过的动 物行列。
15、克隆非洲野猫 2003年8月6号， 奥特朋濒危动物研究中心的研究人 员通过单体克隆技术首次成功克隆 出一只非洲野猫。
16、克隆鹿 2003年5月23日，美国 德州农业机械大学克隆出世界第一 只白尾鹿，名字叫“杜威 （Dewey）”。从一头死去的白尾 雄鹿皮肤样本的成纤维细胞作核供 体.
克隆定义



克隆(clone)的音译，原意指用于扦插的枝条，也 即无性繁殖。1963年Haldane最先使用“clone”, 至世纪70～80年代，克隆一词开始广泛使用。 遗传学定义的“克隆”:指遗传上完全相同的分子、 细胞或来自同一祖先的生物个体，通过无性繁殖 而形成的群体。在不发生突变的情况下，它们具 有相同的遗传结构。 “克隆”分为分子克隆、细胞克隆和个体克隆三 个层面。
(2)桑葚胚及其以后阶段的直接分割法



这一阶段的胚胎分割时，可用固定吸管固定胚 胎或不进行固定而直接分割。 囊胚阶段前的胚胎，要对透明带作软化处理。 否则，由于透明带的韧性，在分割时一部分卵 裂球会受到机械损伤。 之后，将胚胎连同少量分割操作液置于分割皿 上，用显微玻璃针、显微刀片分割或徒手分割。
From the skin cells
第八章 动物细胞工程实践之Ⅴ
哺乳动物的克隆
本章主要内容
8.1 动物克隆技术发展简史与意义
简史、克隆动物研究意义
8.2产生遗传相同个体(克隆）的原理与方法
胚胎分割法 细胞核移植技术的原理与方法
8.3 体细胞克隆动物
克隆“多莉”羊的具体操作过程 “多莉”羊独特点及成功的根本原因 克隆人胚胎引发争议 克隆技术未来的发展

动物克隆的里程碑事件：



1938年，Spemann提出以核移植生产克隆动物 的设想开始，1952年，产生了世界上第一种克 隆动物－非洲豹蛙； 1963年，我国胚胎学家于克隆出亚洲鲤鱼； 1997年Wilmut等利用成体细胞核移植技术获得 克隆绵羊“Dolly”，在动物克隆研究领域取得 了重大突破。 迄今为止，动物克隆在各国如火如荼，成功克 隆的动物有20余种，包括鱼、羊(绵、山羊)、 老鼠、猫、狗、牛、马、兔子、骡子、猪、狼、 猕猴等。
出自：山东莱阳农学院教授 董亚娟，柏学进等，2001.12
11、克隆猫CC 美国得克萨斯农工大学于 2001年培育的第一只克隆猫CC。
美科学家进行商业猫克隆
售价5万美元的克隆猫小尼基和它 的主人
Opening the way to replicating pets and other valued animals
图8-1 分割针垂直分割胚胎示意图
图8-2 半胚装入透明带示意图
图8-3 “分割刀”水平分割胚胎示意图
8.2.2 细胞核移植技术


细胞核移植（nuclear transfer）技术是目前最 常用的、科技成分含量高的动物克隆技术， 是动物克隆技术的核心。 细胞核移植技术：是利用显微操作仪， 将外源细胞的核移植入去核卵母细胞中， 经人工活化和体外培养后再移植入代孕母 体内，使其发育为含有与供体细胞相同遗 传物质的个体。
8.2.1 胚胎分割法---“多胚胎复制”的原理与方法


定义：着床的早期胚胎经显微手术后，分 割为二、四、六等多等份，给每个受体子 宫内移植一块分割物而妊娠产仔，这样由 一个胚胎产生出多个遗传性能完全一样的 后代个体。 严格讲，这种胚胎克隆只能算“多胚胎复 制”。随着分割次数增加，发育成完整个 体的能力越差。
8、克隆猕猴 2000年1月，一只 克隆猕猴在美国俄勒冈地区灵长 类动物研究中心呱呱坠地。这是 全世界第一次成功地克隆灵长类 动物———在基因上与人类最接 近的动物。
9、克隆野牛 2001年1月8日，这 只名叫“诺亚”的印度野牛（濒 危野生动物 ）在美国爱荷华州诞 生，体重80磅。只活了一天。
10、克隆兔 2001年，体细胞克隆兔诞生。


第二,胚胎干细胞核移植：胚胎干细胞是 将早期胚胎或胎儿的原始生殖细胞经体 外抑制分化培养后，筛选出的具有发育 全能性的细胞。 核移植方法：与胚胎细胞相同。利用胚 胎干细胞核移植能生产更多的动物个体。 但目前仅在小鼠分离克隆出胚胎干细胞 系并成功克隆出成体鼠。

第二,受体卵去核
图8-4 核受体成熟卵去核过程示意图
②核供体细胞的准备


核供体细胞主要有两大类三种：胚胎细 胞(胚胎细胞、胚胎干细胞)和体细胞 。 第一,胚胎细胞核移植：通过显微手术分 离未着床早期胚胎的单个细胞，并将其 导入去核的成熟卵母细胞，核质融合后 发育为胚胎。



方法：消化掉卵裂球外面的黏 蛋白层和透明带，用细玻璃管 吹打胚胎细胞，使其分散成单 细胞后进行核移植。 如果连续对核移植胚胎分散为 单细胞，作细胞核移植供体， 得到的克隆胚胎称为第二、第 三代….克隆胚，依次类推。 这种技术称为“胚胎继代克隆” （multiple generational embryo cloning）或胚胎再克 隆（embryo re-cloning）。 在山羊，已获得1～5代连续核 移植山羊45只，其中有7只山 羊来自一个胚胎。
图8-5 耳上皮细胞克隆羊”阳阳”左和其原型”青 青”Baidu Nhomakorabea出自：西北农林科技大学张涌等，2000.6.22
图8-6 “阳阳” 5岁生日及其后代，四世同堂，当上太姥姥 证明了第一代克隆羊及其后代都具有正常的生育能力.
7、克隆摩弗伦羊 摩弗伦羊（又称欧洲盘羊）
是一种濒危物种，全世界所存野生盘羊不足一 千只，2000年，科学家从两头分别死亡将近18 小时和24小时的雌盘羊卵巢内取出DNA，将其 注入盘羊的“近亲”――普通白羊的去核卵细 胞内，155天后正常的产下一只小盘羊。首次把 克隆技术应用于一种濒临灭绝的哺乳类动物身 上。
20余种克隆动物大盘点
1 鲤鱼 童第周早在1963年就通过将一只 雄性鲤鱼的遗传物质注入雌性鲤鱼的卵中 从而成功克隆了一只雌性鲤鱼。 2 克隆羊
1996年7月5日，世界上第 一头由成年羊体细胞经过无性繁殖生成 的克隆羊多莉诞生
3、克隆老鼠Cumulina 1997年，夏 威夷科学家从成年小老鼠的细胞复 制出第一只克隆小老鼠，名叫 Cumulina。 4、克隆奶牛 日本石川县家畜研究中心在 世界上率先从体细胞复制牛，首两头克隆牛 分别名为“KAGA-号”和“NOTO一号”
(1)基本原理

软体动物和部分昆虫为镶嵌发育类型:从胚胎发育的2 细胞起，每个分裂球将要发育成什么样的器官组织， 在受精以后就已规定下来。去掉任何一个分裂球，就 不能发育成为一个完整胚胎。 大多数哺乳动物为调节发育类型:具有调节发育的能 力。特点： 第一,去掉早期胚胎的一半，其余部分可以调整发 育方向，仍可形成一个完整胚胎。 第二，将两个胚胎融合在一起，仍发育成一个胚胎。 第三，调整发育分化能力随胚胎发育的进行逐渐减 弱，组织发育方向变得愈来愈固定。直至调整能力 完全丧失。
克隆骡“爱达荷宝石”
两头“出身竞赛名门”的克隆骡子兄 弟于2006年6月参加了美国西部地区 举行的一次“专业赛跑比赛”，结果 它们最终仅仅在有八名“参赛选骡” 参加的短距离跑步项目中名列第三和 第七名。 --为美国的癌症研究活动筹集更科研 经费。 --海外博览 2006年06月06日
2004年在西雅图展出的三匹克隆骡子