第八章 哺乳动物细胞克隆

(2)桑葚胚及其以后阶段的直接分割法



这一阶段的胚胎分割时，可用固定吸管固定胚 胎或不进行固定而直接分割。 囊胚阶段前的胚胎，要对透明带作软化处理。 否则，由于透明带的韧性，在分割时一部分卵 裂球会受到机械损伤。 之后，将胚胎连同少量分割操作液置于分割皿 上，用显微玻璃针、显微刀片分割或徒手分割。
5、克隆山羊 世界上第一批三只克 隆山羊已由美国一家生物公司于 1998 年“制造”出来。克隆山羊 Mira和她的姐妹们都来自美国的实验 室，它们生产含有人类抗凝血酶-3 （antithrombin lll ）的羊奶。
6、首个克隆猪 英国产生克隆绵羊 “多莉”的公司，在美国的分部成功 地产生了5头克隆猪。

第二,受体卵去核
图8-4 核受体成熟卵去核过程示意图
②核供体细胞的准备


核供体细胞主要有两大类三种：胚胎细 胞(胚胎细胞、胚胎干细胞)和体细胞 。 第一,胚胎细胞核移植：通过显微手术分 离未着床早期胚胎的单个细胞，并将其 导入去核的成熟卵母细胞，核质融合后 发育为胚胎。



方法：消化掉卵裂球外面的黏 蛋白层和透明带，用细玻璃管 吹打胚胎细胞，使其分散成单 细胞后进行核移植。 如果连续对核移植胚胎分散为 单细胞，作细胞核移植供体， 得到的克隆胚胎称为第二、第 三代….克隆胚，依次类推。 这种技术称为“胚胎继代克隆” （multiple generational embryo cloning）或胚胎再克 隆（embryo re-cloning）。 在山羊，已获得1～5代连续核 移植山羊45只，其中有7只山 羊来自一个胚胎。


研究表明，哺乳动物从早期分裂阶段到 原肠胚胚胎都能够复制。此后，胚胎的 发育能力会随着胚胎所达到的发育阶段 而改变。 如：分割胚的胚细胞只负责构成胚盘， 胚盘的正常发育需要滋养层细胞。所以, 在分割胚时应包括应滋养层细胞，否则 不足以引起妊娠产仔。
（1）卵裂球分离培养法


用吸管固定胚胎，用玻璃针自上而下切开透明 带使其形成一个切口，用微吸管自切口处伸入 透明带吸住半数卵裂球，等分胚胎为两部分。 将分得的半胚装入空透明带中，置于血清中使 其中充满血清。 琼脂包埋后，移入受体输卵管。 培养3～5d,发育到桑葚胚或囊胚时回收琼脂筒； 去掉琼脂，选择发育好的胚胎进行移植，产仔。
（2）克隆动物研究意义
基础研究
遗传育种
转基因动物乳腺生物反应器
濒 危 动 物
器官移植
克 隆
动物模型
治 疗 性 克 隆
8.2 产生遗传相同个体(克隆）的原理与方法


胚胎分割 细胞核移植（包括连续细胞核移植或 继代核移植或重复克隆）。 以奶牛为例，产生相同遗传个体的方 法有五种：①胚胎分割；②胚胎细胞； ③胚胎干细胞；④胎儿成纤维细胞； ⑤体细胞克隆等。
(1)原理
胚胎细胞核移植到成熟卵母细胞中，可 因其特殊因子的作用，使植入的核基因 表达被重新编排或调整，将“发育钟” 拨回到受精状态，即恢复全能性。 胚胎干细胞具有全能性及调整能力。 胎儿成纤维细胞和成年体细胞等分化细 胞在经过“去分化”培养后，可以恢复 其全能性。
(2)细胞核移植技术
①受体胞质的准备 第一,有三种做核受体的胞质：卵母细胞 （MⅡ期）胞质、原核期受精卵胞质、2C胚 胎的胞质。 研究表明，以MⅡ期卵母细胞胞质为核移植 的受体细胞最好,目前应用也最普遍。 卵母细胞来源有两种：超排（数量少）、屠 宰场收集卵丘--卵母细胞复合体（COC）在体 外培养成熟后作为受体（数量大）。
8.1 动物克隆技术发展简史与意义 8.1.1 简史 由“胚胎分割”开始。1978年，建立了 卵裂球分离和桑葚胚分离技术。之后对胚胎 分割程序简化和提高胚胎分割效率研究；现 已发展到不依赖于显微操作，而在实体显微 镜下操作的胚胎分割。 在胚胎分割基础上，开始“细胞核移植” 研究。“细胞核移植”才是技术含量最高的 动物克隆。
8、克隆猕猴 2000年1月，一只 克隆猕猴在美国俄勒冈地区灵长 类动物研究中心呱呱坠地。这是 全世界第一次成功地克隆灵长类 动物———在基因上与人类最接 近的动物。
9、克隆野牛 2001年1月8日，这 只名叫“诺亚”的印度野牛（濒 危野生动物 ）在美国爱荷华州诞 生，体重80磅。只活了一天。
10、克隆兔 2001年，体细胞克隆兔诞生。
8.2.1 胚胎分割法---“多胚胎复制”的原理与方法


定义：着床的早期胚胎经显微手术后，分 割为二、四、六等多等份，给每个受体子 宫内移植一块分割物而妊娠产仔，这样由 一个胚胎产生出多个遗传性能完全一样的 后代个体。 严格讲，这种胚胎克隆只能算“多胚胎复 制”。随着分割次数增加，发育成完整个 体的能力越差。
14、克隆马 意大利克雷莫纳的 再生技术实验室的研究人员于2003 年5月底克隆出了第一只驮马，这 意味着马也加入了猫、山羊、母牛、 兔子以及绵羊等被人类克隆过的动 物行列。
15、克隆非洲野猫 2003年8月6号， 奥特朋濒危动物研究中心的研究人 员通过单体克隆技术首次成功克隆 出一只非洲野猫。
16、克隆鹿 2003年5月23日，美国 德州农业机械大学克隆出世界第一 只白尾鹿，名字叫“杜威 （Dewey）”。从一头死去的白尾 雄鹿皮肤样本的成纤维细胞作核供 体.
图8-1 分割针垂直分割胚胎示意图
图8-2 半胚装入透明带示意图
图8-3 “分割刀”水平分割胚胎示意图
8.2.2 细胞r transfer）技术是目前最 常用的、科技成分含量高的动物克隆技术， 是动物克隆技术的核心。 细胞核移植技术：是利用显微操作仪， 将外源细胞的核移植入去核卵母细胞中， 经人工活化和体外培养后再移植入代孕母 体内，使其发育为含有与供体细胞相同遗 传物质的个体。
12、克隆老鼠“拉尔夫” 大 老鼠难以复制，2002年复制的 名为“拉尔夫（Ralph）”的老 鼠是第一只。
13、克隆骡子 2003年5月5日，一头 名为“Idaho Gem”的骡子在母驴子 宫中经过346天的正常妊娠期后降生。
克隆骡子：“爱达荷宝石”



2003年5月29日,美国科学家宣布克隆了一头骡子，为 世界范围内第一次克隆出马科动物，也是克隆杂种动 物的首次成功尝试。 方法：从骡子胚胎细胞核内提取DNA（脱氧核糖核酸）， 将其与去核的马卵母细胞细胞结合.形成杂种胚胎。 该成果意义:首先,有助于克隆其他自身繁殖有困难的 濒危动物;其次,对研究癌症等疾病有重要的参考价值。 一些癌症患者细胞内Ca2+含量异常高。而马科动物细胞 内的钙含量比人低,已识别出其细胞中含有一种化学物 质,能够抑制细胞内钙含量增高。




在分子层次上，---“分子克隆”。将DNA片段 插到一个载体中，在宿主细胞中自我复制。 在细胞层次上，---单克隆抗体。指由一个单一 的共同祖先细胞所形成的一个细胞“群体”。 在个体层次上，克隆是指基因型完全相同的2 个或更多个体组成一个“群体” 。 1997年，世界卫生组织（WHO）解释克隆： 克隆为遗传上同一的机体或细胞系（株）的无 性繁殖。


第二,胚胎干细胞核移植：胚胎干细胞是 将早期胚胎或胎儿的原始生殖细胞经体 外抑制分化培养后，筛选出的具有发育 全能性的细胞。 核移植方法：与胚胎细胞相同。利用胚 胎干细胞核移植能生产更多的动物个体。 但目前仅在小鼠分离克隆出胚胎干细胞 系并成功克隆出成体鼠。
20余种克隆动物大盘点
1 鲤鱼 童第周早在1963年就通过将一只 雄性鲤鱼的遗传物质注入雌性鲤鱼的卵中 从而成功克隆了一只雌性鲤鱼。 2 克隆羊
1996年7月5日，世界上第 一头由成年羊体细胞经过无性繁殖生成 的克隆羊多莉诞生
3、克隆老鼠Cumulina 1997年，夏 威夷科学家从成年小老鼠的细胞复 制出第一只克隆小老鼠，名叫 Cumulina。 4、克隆奶牛 日本石川县家畜研究中心在 世界上率先从体细胞复制牛，首两头克隆牛 分别名为“KAGA-号”和“NOTO一号”
From the skin cells
第八章 动物细胞工程实践之Ⅴ
哺乳动物的克隆
本章主要内容
8.1 动物克隆技术发展简史与意义
简史、克隆动物研究意义
8.2产生遗传相同个体(克隆）的原理与方法
胚胎分割法 细胞核移植技术的原理与方法
8.3 体细胞克隆动物
克隆“多莉”羊的具体操作过程 “多莉”羊独特点及成功的根本原因 克隆人胚胎引发争议 克隆技术未来的发展
(1)基本原理

软体动物和部分昆虫为镶嵌发育类型:从胚胎发育的2 细胞起，每个分裂球将要发育成什么样的器官组织， 在受精以后就已规定下来。去掉任何一个分裂球，就 不能发育成为一个完整胚胎。 大多数哺乳动物为调节发育类型:具有调节发育的能 力。特点： 第一,去掉早期胚胎的一半，其余部分可以调整发 育方向，仍可形成一个完整胚胎。 第二，将两个胚胎融合在一起，仍发育成一个胚胎。 第三，调整发育分化能力随胚胎发育的进行逐渐减 弱，组织发育方向变得愈来愈固定。直至调整能力 完全丧失。
图8-5 耳上皮细胞克隆羊”阳阳”左和其原型”青 青” 出自：西北农林科技大学张涌等，2000.6.22
图8-6 “阳阳” 5岁生日及其后代，四世同堂，当上太姥姥 证明了第一代克隆羊及其后代都具有正常的生育能力.
7、克隆摩弗伦羊 摩弗伦羊（又称欧洲盘羊）
是一种濒危物种，全世界所存野生盘羊不足一 千只，2000年，科学家从两头分别死亡将近18 小时和24小时的雌盘羊卵巢内取出DNA，将其 注入盘羊的“近亲”――普通白羊的去核卵细 胞内，155天后正常的产下一只小盘羊。首次把 克隆技术应用于一种濒临灭绝的哺乳类动物身 上。
出自：山东莱阳农学院教授 董亚娟，柏学进等，2001.12
11、克隆猫CC 美国得克萨斯农工大学于 2001年培育的第一只克隆猫CC。
美科学家进行商业猫克隆