双向电泳笔记

1.当你在首次对未知样品进实验时，建议你使用以下的样品溶液：

将蛋白溶解在：

·8M尿素，4%CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte 3-10, 0.002%溴酚蓝。

溶解大蛋白或疏水蛋白量更难溶的蛋白可以使用以下方法：

·7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS, 60M DTT, 2% Pharmalyte pH 3-10, 0.002%溴酚

蓝。

2.为了从蛋白含量很低并且含有大量干扰物质的组织（如植物组织）中制备样品，你可以使用以下推荐方法。该方法产生的蛋白溶液中不包含盐，核酸及其它污染物。

·将组织在研钵中用液氮研碎。将粉末悬浮在含有10%TCA，0.3%DTT的丙酮中。

在-18˚C 条件下过夜并离心。用丙酮清洗沉淀，干燥沉淀并将沉淀溶于9M尿素，

2%CHAPS,1%DTT,2% Pharmalyte 3-10(52,63)中。

3.等电聚焦在变性条件下进行，能产生高分辩率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单一形态存在，并且减少凝集和分子间的相互作用。

尿素（Urea）:使蛋白质溶解和变性，通常使用浓度为8mol/L，但为了使蛋白质完全溶解的需要，尿素的浓度往往增加到9或9.8mol/L。

CHAPS :促使疏水蛋白质溶解并减少蛋白质间的结合

还原剂：打断二硫键使蛋白质完全展开，往往使用DTT或DTE

载体两性电解质混合物：载体两性电解质的混合物在等电聚焦过程中不影响梯度，还能促进样品的溶解度，并且等电聚焦过程中在整个梯度范围内能产生更一致性的导电性。

经典的再水化液组成：8 M urea, 0.5% (w/v)CHAPS, 0.2%(w/v)DTT, 0.5% IPG缓冲液或Pharmalyte, 0.002%溴酚蓝。

***不要让干燥的IPG胶条在室温下存留时间超过10分钟，胶条会从空气中吸收水分，将IPG 胶条密封好在-20℃以下温度保存。再水化至少需要十个小时。

矿物油加入：利用微量移液器从槽的一端逐滴加入，直至一半条胶被覆盖，然后从另一端逐滴加入，直至整条胶被覆盖。

****聚焦时间过长会发生过聚焦，导致产生水平的条纹,可以在双向电泳的最后结果中见到。

4.可选操作：加入分子量标准蛋白。

分子量标准蛋白溶液与等体积的1%琼脂糖溶液混合后，然后加入到等电聚焦上样滤纸片上能得到很好的效果。终浓度为0.5%的琼脂糖会凝聚，在施加电压前可以防止标准蛋白的扩散。

其它可选的方法是，将标准蛋白以15-20 μl的体积加入到等电聚焦上样滤纸片上。如要少加样量，将上样滤纸片切成更小的面积。将上样滤纸片放在玻璃板上，将一定量的蛋白标准溶液加到上样滤纸片上。然后用镊子将上样滤纸片放置在IPG胶条末端一侧的凝胶表面。进行考马斯亮蓝染色标准溶液的各种蛋白成分必须含有200-1000 ng；而进行银染色必须在10-50 ng之间。

5.****上下电泳槽大概需要加多少电极缓冲液使上下电极与缓冲液相接触？

问题可能原因解决方法

开始电泳时无电流。在上下电泳槽中缓冲液

体积不够。

确保两个缓冲液储液槽盛有足

够的SDS电泳缓冲液，使上下

电极与缓冲液相接触。

第二向电泳分离速度太慢。SDS电泳缓冲液制备不

正确或溶解凝胶缓冲液

制备不正确。

重新配制新鲜的溶液。

丙烯酰胺溶液储存时间

太久。

配制新鲜的单体储存液。

染料前沿边缘向上弯曲（微笑样）凝胶没有正确降温。在电泳过程中，用恒温循环水浴

对凝胶进行冷却降温。

在底部储存槽中尽可能多地使

用缓冲液。

电流强度或功率过大。按表20推荐值限定电流或功

率

染料前沿向下弯（皱眉样）凝胶在垫片附近聚合不

完全。

除去凝胶溶液中的气体或增加

过硫酸铵和TEMED量的50%。

仪器安装不正确

（SE600）。

确保密封管条没有收缩。

上部储液槽渗漏。在上部储液槽中确保有足量的

缓冲液。

第二向分离电流高、速度慢密封装置的槽未被胶模

具或空白插板

由于阴极或阳极缓冲液

过量导致两种缓冲液混

合

确认12个插槽都被占满

下槽不要超过建议体积(7.5 L)。

电泳单元完全装好后确认阳极

液面没有超过密封装置。如果多

余的阳极缓冲液在上槽，需要排

出。

确认阴极缓冲液的液面没有超

过上槽角落的通气孔。可通过在

装胶前向下槽加入溴酚蓝染料

来加入来检查上下槽的混合。几

滴1%溴酚蓝足够染阴极液

染料前沿

不规则。

凝胶聚合不均匀。

第二向上表面不平

在放置IPG胶条时破坏

了凝胶上表面

凝胶与玻璃板之间存在

气泡

凝胶和玻璃板之间存在

液体除去凝胶溶液中的气体或增加过硫酸铵和TEMED量的50%。灌胶后立即用水饱和丁醇来覆盖凝胶表面

在放置IPG胶条时小心不要损坏凝胶

用滚子除去凝胶和玻璃板之间的气泡和多余的液体

确认无可见的气泡，凝胶紧贴着玻璃板，不可移动

凝胶一侧染料前沿明显向下弯曲凝胶与垫片之间的缝隙

未被填充

预制凝胶模具未正确合

住

在封IPG胶条时，确认密封液

也封住凝胶与垫片之间的缝隙

确认模具合闭正确，重新电泳

2-D图像扭曲凝胶与玻璃板之间存在

气泡

凝胶与玻璃板之间存在

液体

第一向存在干扰性物质

用滚子除去凝胶和玻璃板之间

的气泡和多余的液体

确认无可见的气泡，凝胶紧贴着

玻璃板，不可移动

样品中的干扰性物质会导致扭

曲或IPG胶条局部肿胀，这些

变化又会影响第二向。改变样品

制备方法限制污染物