双向电泳笔记
XX生物技术公司蛋白质双向电泳知识学习
胶条平衡
等电聚焦结束后进行SDS-PAGE电泳之前需 进行胶条平衡，以便于被分离的蛋白质与 SDS充分结合，保证SDS-PAGE电泳的顺利 进行 步骤：一般采用两步平衡法，用含SDS、 DTT、尿素和甘油等的缓冲液先平衡一次， 再用碘乙酰胺取代DTT后再平衡一次
SDS-PAGE电泳
使得蛋白质按照分子量的大小不同而分离， 与普通SDS-PAGE相似 在双向电泳系统中无需浓缩胶，因为第一 向等电聚焦已经使得蛋白得到浓缩
等电聚焦
通过10000V高压使得蛋白质按照其等电点特 性进行聚焦 步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低 压维持 聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平和垂 直条纹，过长会造成蛋白图谱变性，在胶条 碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时 间的确定需要根据蛋白样品类型、蛋白载样 量、PH范围和胶条长度来确定。
图像分析
常用软件： Image-Master (GE Healthcare) PDquest (Bio-Rad) 分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比 较分析
分子量 提取的总蛋 白溶液
2DE图谱
硝酸银染色图谱
考马斯亮蓝染色图谱
双向电泳（DIGE）示意图
样品1： Cy3标记 将标记的 样品混合 样品2： Cy5标记
双向电泳分离
荧光扫描仪扫描
图像重叠分析
DIGE图谱
样品制备
双向电泳的最关键步骤之一 制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽 可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过 程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐 离子等干扰物质
差异蛋白点选取
蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
生物学问题的解释
蛋白质双向电泳的基本原理(一)
蛋白质双向电泳的基本原理(一)蛋白质双向电泳的基本原理蛋白质双向电泳是一种常用的分离和分析蛋白质的技术方法。
它通过利用蛋白质在电场中移动的特性，结合两个方向的电场，实现对复杂蛋白质混合物的分离和鉴定。
下面将从浅入深地解释蛋白质双向电泳的基本原理。
1. 电泳的基本原理电泳是一种基于物质在电场中迁移的原理，将带电粒子或分子分离开的技术。
在电泳过程中，带电的蛋白质分子会受到电场的作用力而移动，移动的速度与其电荷大小和分子质量有关。
2. 单向电泳的局限性在传统的单向电泳中，蛋白质样品被施加一个方向的电场，使得蛋白质分子按一维的方向进行迁移。
然而，由于蛋白质复杂性和电泳条件的限制，单向电泳难以有效地分离复杂的蛋白质混合物。
3. 双向电泳的优势双向电泳是为了克服单向电泳的局限性，实现更好的分离效果而发展起来的一种电泳技术。
它利用两个方向的电场交替施加，使得蛋白质分子在水平和垂直方向上均发生迁移，从而实现更高分辨率的蛋白质分离。
4. 蛋白质双向电泳的操作步骤•第一维电泳：将蛋白质样品在一个细长的电泳槽中垂直施加电场，使得蛋白质在水平方向上移动。
一般使用等电聚焦（IEF）技术，根据蛋白质的等电点来完成分离。
•电泳缓冲：在第一维电泳过程中，需要使用特定的电泳缓冲液，以确保蛋白质在移动过程中维持稳定的电荷状态。
•Gel转移：第一维电泳后，将蛋白质分离到一根细长的凝胶条上，凝胶条上有各种不同pH值的缓冲液。
•第二维电泳：将凝胶条垂直放置在另一个电泳槽中，施加另一个方向的电场。
凝胶条上的蛋白质会在垂直方向上继续移动，最终得到更高分辨率的蛋白质分离结果。
5. 蛋白质双向电泳的应用蛋白质双向电泳在生物医学和生命科学研究中得到广泛应用。
它被用于分离和鉴定复杂蛋白质混合物，寻找新的蛋白质标记物或生物标志物，研究蛋白质的功能和相互作用等。
6. 结论蛋白质双向电泳是一种重要的分离和鉴定蛋白质的技术方法，通过结合两个方向的电场，实现对复杂蛋白质混合物的高效分离。
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing, IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按亚基分子量大小进行分离。
经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
注意事项：
1. 一向聚焦与二向电泳之间需要平衡，时间视蛋白质的性质而定，一般为10min，最多不超过15min。
2. 过量的上样量会引起双向图形畸形，特别在一向聚焦时，当样品浓度超过5mg时，则蛋白质凝聚和沉淀，使二向时产生水平和垂直条纹。
3. 含尿素的试剂均应避免过高的温度处理，一般不要超过30℃，否则尿素分解产生异硫氰酸盐会引起羧基甲酰化而导致电荷不均一性。
4. 第一向中过量的去污剂会严重影响双向电泳图谱，因此聚焦完毕进行平衡前，用双蒸馏水冲洗胶条，以除去残留的去污剂。
5. 双向电泳中双向凝胶间的界面紧密接触非常重要，如果接触不好或者两者之间留有气泡，则导致转移时分子扩散。
6. 双向电泳中的条纹现象是常见的问题。
水平条纹可能与一向电泳时间不够，聚焦不好有关，或者在加样处产生沉淀和引起重新溶解所致；纵向条纹则表明样品没溶解，这可以通过调整样品量，增加电泳时间，改善样品的溶解状态，同时在加样前通过高速离心以除掉所有不溶物。
双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置（经典）
双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置（经典）双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置(经典)3.2点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels(18cm，pH 3-10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品双向电泳实验过程及相关溶液配置A.实验过程一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息二、实验步骤：1.样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白：100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时其中每隔10~15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，-80oC保存2.Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul,5ul,10ul,15ul,20ul的BSA溶解液，另2管中分别加入2ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值(测量过程要在一个小时内完成)例如：编号蛋白量(ul)Buffer(ul)Bradford(ml)OD595值1 080 40 25 75 40.024 310 70 40.061 415 65 40.091 520 60 40.116 Bt4 278 40.079 Bt4 476 4转Bt4 278 40.075转Bt4 476 4标准曲线方程式：Y=aX b.其中Y为OD值，X为蛋白含量a、b 通过作图输入数据可知相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得OD值测量过程：比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值3.双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1水化液的制备称取2.0mg的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05%的溴酚兰，3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer(pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min除杂质，取上清在含300ug蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定(跑胶温度为20oC)S1(30v,12hr,360vhs,step)S2(500v,1hr,500vhs,step)S3(1000v,1hr,1000vhs,step)S4(8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)S5(8000v,5hr,40000vhs,step)共计44110vhs,19.5小时其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦3.4平衡用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干(胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去)，再以超纯水冲洗，滤纸吸。
蛋白质双向电泳
实验报告蛋白质的双向电泳罗云云水产养殖20102190171、第一相等点聚焦电泳的胶条从负极到正极，pH如何排列，为什么？答：从负极到正极PH逐渐减小，也就是PH值小的的一端位于电泳的正极。
因为蛋白质在大于其等电点的PH环境中带负电，在小于其等电点的PH环境中带正点。
根据电泳时正电荷向负极移动原理，如果PH值小的一端位于负极，而此时带正电荷的蛋白质没法再向负极移动，因此只能是PH值小的一端位于正极。
即从负极到正极PH值逐渐减小。
2、为什么双向电泳（无论是第一相和第二相）过程中，要尽量消除气泡？答：第一向：如果在胶条和含蛋白质的水化液之间存在气泡，则气泡下面的蛋白质不能进入胶条。
对结果的影响可分为两种：①如果所有蛋白质在水化液中均匀分布，那么气泡只影响结果的显色程度，即银染后的黑色会减淡。
②如果某种蛋白质很少，恰巧只存在于气泡的下面，则气泡对结果的影响是严重的，直接影响电泳结果所能分析出来的样品中所含有的蛋白质的种类。
第二向：如果放入胶条时在胶条与电泳胶之间产生气泡，气泡会影响其所在通路上的电压分布。
其结果有两种：①蛋白质不能通过气泡，该处的蛋白质被遗漏。
②蛋白质可绕过气泡，但其所在跑道会发生偏移或改变，且移动距离也会发生改变，直接影响结果分析。
3、平衡液中的DTT和碘乙酰胺的作用是什么？答：①ＤＴＴ：即二流苏糖醇，它是一种还原剂。
可以还原蛋白质中的二硫键为巯基。
与巯基乙醇相比效果更好。
②碘乙酰胺：其所用是使蛋白质中由二硫键还原而成的巯基保持还原态。
其机制是在DTT作用的基础上使—SH与I—CH2—CO—NH2发生反映产生HI和—S—CH2—CO—NH2。
这样使—SH 不能复原。
4、水化液中CHAPS的作用是什么？它与SDS有什么区别？答：CHAPS是非离子型表面活性剂，有助于不易溶于水的蛋白质溶解。
SDS也是表面活性剂，但它是离子型的，与蛋白质结合后会使蛋白质分子带上大量的负电荷，从而影响蛋白质的等电点。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种应用在生物和化学实验中的分子电泳技术，它能够将完整的分子进行分离，从而实现提取特定的分子组份。
一、双向电泳的概念双向电泳是一种分子技术，它能够将分子分开并且分离出它们内部的活性组分。
利用电泳技术，可以把一些我们有利用价值的分子聚集到集簇中，把其它不要的环境分子分离出去。
通常情况下，电泳是通过具有某种特殊电势的电流来将分子分离的。
由于双向电泳技术，可以利用液相层析原理，将不同的分子聚集到不同的集簇中，从而把其它的不需要的或者有害的分子挤出去。
二、双向电泳的原理双向电泳的原理是利用电流来将分子进行分离，因此在实践过程中，首先需要构建一个体系，在该体系中，利用某种特殊的电流，生成一种能够将分子分解的条件。
首先，将样品加入到某种带有类似电流的环境中，当样品中的分子接触到了这种带有电流的环境，就会形成一种吸引力，从而使分子受到电流的作用，接着分子中的活性组分也会朝着电流的方向而移动。
而由于这种电流的作用，活性组分会被吸引到这种电流的反方向，使得活性组分能够从样品中分离出来，这就是双向电泳的原理。
三、双向电泳的应用双向电泳技术在生物和化学实验中都有广泛的应用，在蛋白质纯化实验、肽段分离实验等实验中，都可以利用双向电泳技术实现分子的精确分离。
此外，双向电泳技术在疾病的早期筛查中也可以发挥着重要的作用，比如癌症的筛查，可以利用双向电泳技术来检测出肿瘤细胞中的活性组分，为早期筛查提供重要的依据。
四、双向电泳的优势双向电泳技术有着诸多优势，首先，双向电泳技术具有准确性高的优势，可以把不同组分的分子成功地分离出来；其次，双向电泳技术操作简单，可以节省大量的实验时间；最后，双向电泳技术可以把活性分子完美的纯净，大大提高了实验的效率。
总之，双向电泳是一种广泛应用的分子技术，它能够把完整的分子进行分离，从而实现提取特定的分子组份。
双向电泳技术实用性强，可以应用在生物和化学试验中，为后续实验提供重要的依据和有效的结果。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种采用两个方向的电场同时作用于凝胶电泳系统的技术，用于分离复杂样品中的蛋白质或核酸。
首先，将样品溶解于含有凝胶的电泳缓冲液中。
凝胶是一种聚合物网状结构，可以限制分子的运动，将其分离。
常见的凝胶材料包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
第一步是水平电泳。
在水平电泳阶段，一个方向的电场施加在凝胶中，使得带电分子向着相应的电极方向移动。
这个方向通常被称为水平方向，因为它从一个电极移动到另一个电极。
在水平电泳过程中，由于分子的大小和电荷不同，它们将以不同的速度在凝胶中运动。
大分子移动缓慢，小分子移动快速。
这样，分子根据大小按照一定的顺序移动，导致它们在凝胶中排列成一条通常是呈斜角的直线。
这个方向通常被称为水平电泳通道。
第二步是垂直电泳。
在水平电泳结束后，垂直电场被施加在凝胶中，使分子以另一个方向移动。
这个方向通常被称为垂直电泳通道。
在垂直电泳过程中，分子将根据它们的电荷大小被拖曳向上（正电流）或向下（负电流）。
正电流将使分子向上移动，而负电流将使分子向下移动。
这样，分子将根据其电荷被分离并在凝胶中形成一条平行于水平电泳通道的直线。
最终，两个方向的电泳都完成后，在凝胶上会形成一个类似网格的结构，其中分子被分离成不同的带状。
这些带状物可以被染料或放射性示踪剂探测出来，从而确定分离出的分子的位置。
总结起来，双向电泳是一种利用两个方向的电场移动分子的方法。
通过水平电泳和垂直电泳，分子根据其大小和电荷被分离成不同的带状，从而实现复杂样品中蛋白质或核酸的分离和分析。
双向电泳技术手册之四胶蛋白质点的检测(考染和银染)
双向电泳技术手册之四:胶蛋白质点的检测(考染和银染)第四章2-DE 胶蛋白质点的检测2-DE 胶蛋白质点的检测方法大致有：1）考马斯亮兰染色法；2)银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5 ）放射性同位素标记法等。
这几种检测方法的灵敏度各不相同。
目前最常用的是银染法和考染法。
由于银染的灵敏度是考染的50 倍，故一般用银染法进行分析处理，再用考染法来进行样品微量制备。
4.1考马斯亮兰染色:4.1.1经典的考马斯亮兰染色程序：1 固定20 % TCA 1h2 染色0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid 2h3 脱色40% EtOH&10% acetic acid 2x 30 min4 强化1% acetic acid overnight5 清洗deionized H2O 30 min局限：灵敏度低（≈1μg protein/spot）4.1.2 Neuhoff 胶体考染法：1 固定：12％（w/v）三氯醋酸（TCA）2h2 染色：200ml 染色液混合50ml 甲醇16-24h染色液：在490ml 含2％（w/v）的H3PO4中加50g (NH4)2SO4 直至完全溶解，再加0.5g CBB G-250（已溶于10mlH2O中），搅拌混合。
无需过滤，使用前摇匀。
3 漂洗：1）0.1mol/L Tris-H3PO4缓冲液（pH 6.5）漂洗两分钟；2）25％（v/v）甲醇漂洗不超过1min4 稳定：在20％的(NH4)2SO4中稳定蛋白质－染料复合物。
优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot.4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法：1 染色（0.025%(w/v) 考马斯亮兰R350）：将1 片Phast Gel Blue 药片溶入1.6L 10%醋酸，将染色液加热到90℃倒入凝胶染色盘，振荡10min；2 脱色：10%醋酸室温振荡脱色2h ，期间需多次更换脱色液，脱色液可通过铺有活性炭的滤纸层过滤回收；脱色液和染色液可重复使用。
双向电泳操作步骤蛋白质技术
双向电泳操作步骤-蛋白质技术水化上样(被动上样)1 .从冰箱中取出IPG胶条，室温放置IOmin o2 .沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各Icm左右不加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。
3 .用银子轻轻撕去IPG胶条上的保护层。
注意：碱性端较脆弱,应小心操作。
4 .将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。
注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条下面的溶液产生气泡。
如产生了气泡，用镜子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。
5 .放置30~45min大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油,每根胶条约3m1(17cmIPG),防止胶条水化过程中液体蒸发。
6 .置等电聚焦仪于-20。
C水化11〜15h。
第一向等电聚焦1 .将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH205~8μ1润湿。
2 .取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。
3 .将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。
4 .在每根胶条上覆盖2-3m1矿物油。
5 .对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
6 .聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。
或将胶条置于样品水化盘中，-20。
水箱保存，电泳前取出胶条，室温放置10分钟,使其溶解。
第二向SDS-PAGE电泳1 .配制12%的丙烯酰胺凝胶。
2 .待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MiI1iQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MiIIiQ水冲洗。
3 .配制胶条平衡缓冲液I4 .在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。
将另一份厚滤纸用Mi1IiQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
双向电泳法
双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。
本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。
原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。
在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。
通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。
双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。
等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。
在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。
通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。
2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。
在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。
3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。
常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。
对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。
染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。
通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。
步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。
常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。
2013.12.12 实验 蛋白质组学实验技术相关理论介绍(一)双向电泳(2DE)实验技术
第二向SDS-PAGE 垂直电泳
第二向SDS-PAGE 垂直电泳步骤
配制凝胶及准备第二向电泳系统 在SDS 平衡缓冲液中平衡固相pH干胶条 将平衡好的固相pH 干胶条放置在SDS 凝胶 上 进行电泳 染色、显影
平衡固相pH干胶条
平衡缓冲液（75 mM Tris-HCl, pH 8.8）： 使固相pH 干胶条的pH 值维持在电泳适合 的范围内；由缓冲液、尿素、甘油、还原 剂、SDS 和染料组成。
稳定的同位素虽然其化学性质相同，但质 量数却存在差异。 ITRAQ就是利用这一原 理，用稳定同位素分别标记不同的样品， 将标记和未标记的样品以等量混合，酶解 后再用质谱技术检测它们的相对丰度。作 为一种新的蛋白质绝对和相对定量技术， 具有很好的精确性和重复性。
二维凝胶差异电泳技术DIGE
DIGE技术中将样品和对照品的蛋白质用激发波长 不同而化学性质类似的两种荧光染料标记，混合
二维凝胶差异电泳技术digedige技术中将样品和对照品的蛋白质用激发波长不同而化学性质类似的两种荧光染料标记混合二维电泳分离然后采用不同波长扫描通过观察一个蛋白质点两种荧光密度的差异变化得特定蛋白质点的差异表达信息
双向电泳（2DE） 实验技术
中国医学科学院 北京协和医学院 医学生物学研究所 病毒免疫室 赵婷 2013.12.12
IEF注意事项：
Ettan IPGphor Ⅲ系统是高压设备，如果安 全装置失效，可能引起致命电休克。因此， 操作开始前必须锁上安全盖，否则就不会加 电。 每个IPG 胶条的电流限度建议值为50μA， 如超过可能会烧毁胶条并损坏仪器。 常规胶条槽和Manifold 胶条槽采用陶瓷制成， 应小心操作。
基质辅助激光解析质谱成像技术 MALDI MSI
第三章+双向电泳技术修改版
Separation of Proteins
一、蛋白质电泳相关基本知识 二、双向电泳
1、2-DE 常见问题及解决方法 2、对角线电泳SDS-PAGE/SDS-PAGE 3、Native-PAGE/SDS-PAGE
三、2D-LC
一、蛋白质电泳相关基本知识
1、电泳
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 3、等电聚焦电泳 4、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 5、蛋白质的检测－显色剂
基于凝胶中的固相pH梯度。这些具有弱酸或弱碱性质 的丙烯酰胺衍生物共价结合到聚丙烯酰胺凝胶介质形成 pH梯度后，带电的蛋白质分子便开始向自己的等电点 位臵迁移，直到到达自己的等电点。
等电聚焦中应注意的事项
1. pH梯度的选择。先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预 试验确定。 2.IEF如在宽pH范围载体两性电解质内进行，为了克服在中性区 域形成纯水区带，可适当添加中性载体两性电解质。 3.为防止电泳过程中pH梯度的衰变，一般电流降低达最小而恒 定时尽快结束IEF。 4.pH梯度(pI)测定: ①Rotofer制备电泳可分管测定收集液的pH 值；②凝胶IEF后，可分段切割凝胶，用3—5倍体积的蒸馏水 或10mmol KCl浸泡该凝胶，从凝胶浸出液中测定pH值，或 用微电极直接测定凝胶表面pH值；③薄层等电聚焦后，可用 微电极检测凝胶表面pH值根据蛋白质分布的pH值即能确定该 蛋白质的pI。 5.IEF聚焦过程中由于蛋白质泳动到某一区段，而该区段刚好是 该蛋白质的pI，造成蛋白质的沉淀出现絮凝现象，为了解决 此问题，可在样品中添加硫脲、TritonX－100、NP—40或其 他一些非离子型表面活性剂。
固相pH梯度等电聚焦（IPG IEF）
固相pH梯度的介质 Immobilines（固相试剂）是一系列性质稳定的具有弱 酸弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，与丙烯酰胺和甲叉双丙 烯酰胺有类似的聚合行为。每个分子都有一个单一的酸 性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连。 其结构式为：
蛋白质双向电泳
模块五蛋白质双向电泳1. 实验目的掌握双向电泳能根据等电点和分子量分离蛋白质的原理，第一向等电聚焦电泳（IEF）和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）操作步骤，掌握凝胶染色方法，掌握凝胶分析软件的使用，了解对分离出的特异蛋白质的进一步分析方法，了解利用电泳技术分析生物大分子的方法。
2. 实验原理从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。
目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。
这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。
双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。
在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH 环境中以阳离子形式向负极移动。
如果在pH梯度环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。
第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。
蛋白检测篇-双向凝胶电泳分享
编号：1-6主题：双向凝胶电泳概述：双向凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。
这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。
目的：凝胶中蛋白的检测、图像采集和分析、蛋白鉴定、分离蛋白质组所有蛋白。
原理：1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。
蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。
对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。
将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。
在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。
当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。
聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。
双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS．PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。
蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，由于SDS是一种强阴离子去垢剂，所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系。
步骤：１.样品制备２.第一向分离等电聚焦３.第二向分离聚丙烯酰胺凝胶电泳３.修饰和加工，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化流程图：营养知识饮食原则：三高三低（高蛋白/高纤维/高维生素，低糖/低脂肪/低盐）人体六大营养元素脂肪/蛋白质/碳水化合物维生素/矿物质/水比例：脂肪：蛋白质：碳水化合物=1：2：3一、脂肪的作用保护内脏/储存能量/维持神经系统的正常功能/防寒保暖/帮助荷尔蒙的产生/能量的来源之一/支持组织的生长/保护和修复注：脂肪是能量储存的最有效的方式，一克脂肪含热量9.3千卡。
蛋白质双向电泳、western blot原理、方法、应用
双向电泳样品的溶解
• 是成功进行双向电泳的最关键因素之一 • 溶解的目标： • 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积 体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； • 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、 多糖和核酸等物质的去除； • 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
增加样品溶解性的手段
• 离液剂（变性剂）：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充 分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量 域。典型代表是尿素和硫尿。 • 去垢剂（表面活性剂）：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏 水基团后，还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的 去垢剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS应用最普遍。 • 还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可使已 变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的 DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还 原。
什么是蛋白质印迹法 ？
• Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化 技术及分子亲和技术三者融为一体的综合 性技术，其核心在于把凝胶已分离的区带 并印迹于固化纸上，可分为电泳、转印、 酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合 了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感 性和特异性，是一种能用于分析样本组分 的免疫学测定的方法。
胶条的转移
• 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1× 电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在 凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。 • 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶 架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封 胶液（图-6）。 • 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地 将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶 面完全接触（图-7）。 • 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝 固。
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1.当你在首次对未知样品进实验时，建议你使用以下的样品溶液：将蛋白溶解在：·8M尿素，4%CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte 3-10, 0.002%溴酚蓝。
溶解大蛋白或疏水蛋白量更难溶的蛋白可以使用以下方法：·7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS, 60M DTT, 2% Pharmalyte pH 3-10, 0.002%溴酚蓝。
2.为了从蛋白含量很低并且含有大量干扰物质的组织（如植物组织）中制备样品，你可以使用以下推荐方法。
该方法产生的蛋白溶液中不包含盐，核酸及其它污染物。
·将组织在研钵中用液氮研碎。
将粉末悬浮在含有10%TCA，0.3%DTT的丙酮中。
在-18˚C 条件下过夜并离心。
用丙酮清洗沉淀，干燥沉淀并将沉淀溶于9M尿素，2%CHAPS,1%DTT,2% Pharmalyte 3-10(52,63)中。
3.等电聚焦在变性条件下进行，能产生高分辩率和高清晰度的结果。
利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单一形态存在，并且减少凝集和分子间的相互作用。
尿素（Urea）:使蛋白质溶解和变性，通常使用浓度为8mol/L，但为了使蛋白质完全溶解的需要，尿素的浓度往往增加到9或9.8mol/L。
CHAPS :促使疏水蛋白质溶解并减少蛋白质间的结合还原剂：打断二硫键使蛋白质完全展开，往往使用DTT或DTE载体两性电解质混合物：载体两性电解质的混合物在等电聚焦过程中不影响梯度，还能促进样品的溶解度，并且等电聚焦过程中在整个梯度范围内能产生更一致性的导电性。
经典的再水化液组成：8 M urea, 0.5% (w/v)CHAPS, 0.2%(w/v)DTT, 0.5% IPG缓冲液或Pharmalyte, 0.002%溴酚蓝。
***不要让干燥的IPG胶条在室温下存留时间超过10分钟，胶条会从空气中吸收水分，将IPG 胶条密封好在-20℃以下温度保存。
再水化至少需要十个小时。
矿物油加入：利用微量移液器从槽的一端逐滴加入，直至一半条胶被覆盖，然后从另一端逐滴加入，直至整条胶被覆盖。
****聚焦时间过长会发生过聚焦，导致产生水平的条纹,可以在双向电泳的最后结果中见到。
4.可选操作：加入分子量标准蛋白。
分子量标准蛋白溶液与等体积的1%琼脂糖溶液混合后，然后加入到等电聚焦上样滤纸片上能得到很好的效果。
终浓度为0.5%的琼脂糖会凝聚，在施加电压前可以防止标准蛋白的扩散。
其它可选的方法是，将标准蛋白以15-20 μl的体积加入到等电聚焦上样滤纸片上。
如要少加样量，将上样滤纸片切成更小的面积。
将上样滤纸片放在玻璃板上，将一定量的蛋白标准溶液加到上样滤纸片上。
然后用镊子将上样滤纸片放置在IPG胶条末端一侧的凝胶表面。
进行考马斯亮蓝染色标准溶液的各种蛋白成分必须含有200-1000 ng；而进行银染色必须在10-50 ng之间。
5.****上下电泳槽大概需要加多少电极缓冲液使上下电极与缓冲液相接触？问题可能原因解决方法开始电泳时无电流。
在上下电泳槽中缓冲液体积不够。
确保两个缓冲液储液槽盛有足够的SDS电泳缓冲液，使上下电极与缓冲液相接触。
第二向电泳分离速度太慢。
SDS电泳缓冲液制备不正确或溶解凝胶缓冲液制备不正确。
重新配制新鲜的溶液。
丙烯酰胺溶液储存时间太久。
配制新鲜的单体储存液。
染料前沿边缘向上弯曲（微笑样）凝胶没有正确降温。
在电泳过程中，用恒温循环水浴对凝胶进行冷却降温。
在底部储存槽中尽可能多地使用缓冲液。
电流强度或功率过大。
按表20推荐值限定电流或功率染料前沿向下弯（皱眉样）凝胶在垫片附近聚合不完全。
除去凝胶溶液中的气体或增加过硫酸铵和TEMED量的50%。
仪器安装不正确（SE600）。
确保密封管条没有收缩。
上部储液槽渗漏。
在上部储液槽中确保有足量的缓冲液。
第二向分离电流高、速度慢密封装置的槽未被胶模具或空白插板由于阴极或阳极缓冲液过量导致两种缓冲液混合确认12个插槽都被占满下槽不要超过建议体积(7.5 L)。
电泳单元完全装好后确认阳极液面没有超过密封装置。
如果多余的阳极缓冲液在上槽，需要排出。
确认阴极缓冲液的液面没有超过上槽角落的通气孔。
可通过在装胶前向下槽加入溴酚蓝染料来加入来检查上下槽的混合。
几滴1%溴酚蓝足够染阴极液染料前沿不规则。
凝胶聚合不均匀。
第二向上表面不平在放置IPG胶条时破坏了凝胶上表面凝胶与玻璃板之间存在气泡凝胶和玻璃板之间存在液体除去凝胶溶液中的气体或增加过硫酸铵和TEMED量的50%。
灌胶后立即用水饱和丁醇来覆盖凝胶表面在放置IPG胶条时小心不要损坏凝胶用滚子除去凝胶和玻璃板之间的气泡和多余的液体确认无可见的气泡，凝胶紧贴着玻璃板，不可移动凝胶一侧染料前沿明显向下弯曲凝胶与垫片之间的缝隙未被填充预制凝胶模具未正确合住在封IPG胶条时，确认密封液也封住凝胶与垫片之间的缝隙确认模具合闭正确，重新电泳2-D图像扭曲凝胶与玻璃板之间存在气泡凝胶与玻璃板之间存在液体第一向存在干扰性物质用滚子除去凝胶和玻璃板之间的气泡和多余的液体确认无可见的气泡，凝胶紧贴着玻璃板，不可移动样品中的干扰性物质会导致扭曲或IPG胶条局部肿胀，这些变化又会影响第二向。
改变样品制备方法限制污染物2-D图像垂直缺失IPG胶条和第二向凝胶上表面之间存在气泡确认IPG胶条和第二向凝胶上表面之间没有气泡垂直拖尾平衡液配制不正确蛋白从IPG胶条向第二向转移不充分平衡不够根据说明准备平衡液在转移步骤中采用低功率和低电流。
如果需要延长转移步骤时间延长平衡时间垂直出现双点或“重点”IPG胶条放置不正确确认IPG胶条的塑料支持膜紧贴着第二向胶的玻璃板高分子量蛋白损失平衡液准备不正确蛋白从IPG胶条向第二向转移不充分根据说明准备平衡液在转移步骤中采用低功率和低电流。
如果需要延长转移步骤时间干胶条的尖端是酸性端，应当正对着正极（+）。
6. 12.5%凝胶制备：丙烯酰胺16.7ml；分离胶缓冲液10ml ；10×SDS 400μl；无菌水12.8ml；10％过硫酸胺200μl；TEMED*13.3μl*在灌胶之前加入，药品配制：丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml分离胶缓冲液：Trisbase181.5g 溶于750ml 无菌水中调PH8.8总体积1000ml10％SDS：SDS5g溶于无菌水中总体积50ml10％的过硫酸胺：0.1g溶于无菌水中总体积1mlSDS 电泳缓冲液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml 琼脂糖0.5g溴酚蓝少许附：蛋白质含量测定的方法（Bradford 方法）7.植物组织蛋白质提取方法(summer)三氯醋酸—丙酮沉淀法（1）在液氮中研磨叶片（2）加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1 小时）弃上清。
（3）加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
（4）上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
（5）用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
药品：提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！8.蛋白质样品制备秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等（1986）的方法进行。
100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM 即0.07%β- 巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1 小时，4℃，15000 r/min 离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮（含10 mMβ-巯基乙醇），再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80%丙酮（含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT（二硫苏糖醇），2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10），6% Triton X-100]，37℃育30min，（含有尿素的溶液加热温度不能超过30°）期间搅动几次，16000 r/min离心15 min28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰），离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。
或者-70度保存9.双向电泳操作步骤及相关溶液配置一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、实验步骤：1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液（1mg蛋白：100ul裂解液）振荡器上振荡10min 左右，共处理一个小时。
其中每隔10~15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，-80℃保存。
2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解，测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul，5ul，10ul，15ul，20ul 的BSA 溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液（10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4℃，4000 r/min离心15min，弃上清，再加入100μl冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100μl PBS溶液（磷酸盐缓冲液）复溶），再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml 的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
（测量过程要在一个小时内完成）。
3. 双向电泳第一向——IEF（双向电泳中一律使用超纯水）3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后，加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer （pH 3-10）振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。