考马斯亮蓝法测蛋白质含量(1)
蛋白质含量测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作步骤。
2. 学习使用分光光度计进行比色分析。
3. 通过实验，掌握蛋白质含量测定的实际操作，提高实验技能。
二、实验原理考马斯亮蓝法是一种快速、简便的蛋白质定量方法。
该法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合，蛋白质含量与染料结合程度呈线性关系。
通过测定溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质的含量。
实验原理：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与考马斯亮蓝G-250染料发生结合，形成有色的复合物。
该复合物在特定波长下有特征性吸收峰，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。
三、实验材料1. 蛋白质标准品（如牛血清白蛋白）。
2. 考马斯亮蓝G-250染料。
3. 6.0mol/L NaOH溶液。
4. 双蒸水。
5. 分光光度计。
6. 试管、移液器、吸管等实验器材。
四、实验步骤1. 标准曲线制作：将不同浓度的蛋白质标准品配制成溶液，分别加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，得出线性方程。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品中的蛋白质含量为XX g/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免污染和误差。
2. 在制作标准曲线时，应选择合适的浓度范围，保证线性关系良好。
3. 待测样品的稀释倍数应根据实际浓度选择，以保证在检测范围内。
4. 在测定吸光度时，应注意仪器校准和操作，避免误差。
七、实验总结本次实验通过考马斯亮蓝法测定了待测样品中的蛋白质含量，实验结果准确可靠。
实验考马斯亮蓝测蛋白质含量
实验考马斯亮蓝测蛋白质含量本实验旨在研究一种蛋白质染色测定的方法，即考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。
该方法基于蛋白质对酸碱滴定指示剂颜色变化的影响，使用考马斯亮蓝G-250作为染料，通过疏水作用与蛋白质相结合形成蛋白质染料复合物，再通过比色测定吸光值来测定蛋白质含量。
标准曲线的制作包括取7支试管，加入不同浓度的标准蛋白溶液和考马斯亮蓝试剂，摇匀后放置20分钟，再用分光光度计比色测定吸光值A595nm，以A595nm为纵坐标，标准蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
样品的测定包括取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液、蒸馏水和考马斯亮蓝试剂，摇匀后放置20分钟，再比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。
需要注意的是，该方法适用范围为0.01-1.0mg蛋白质/ml，不同蛋白质之间差异大，标准曲线线性差，且高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
1、染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，因此与蛋白质结合的染料增加会导致试剂背景值不断降低。
当蛋白质浓度较大时，标准曲线会稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不会影响测定结果。
2、测定工作应在蛋白质染料混合后2分钟开始，力争1小时内完成。
否则，蛋白质一染料复合物可能会发生凝集沉淀，影响测定结果。
实验报告应绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法进行比较分析。
思考题：1、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是通过蛋白质与染料结合后产生的颜色变化来测定蛋白质含量。
2、Bradford法的优点是灵敏度高，测定快速、简便，只需要加一种试剂。
干扰物质相对于其他方法较少。
缺点是不同蛋白质测定时有较大的偏差，仍有些物质干扰此法测定，标准曲线也有轻微的非线性。
在操作时，不可使用石英比色皿，应使用塑料或玻璃比色皿，并立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。
实验1考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
蛋白质含量的测定
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法（Lowry法） 双缩脲法（Biuret法） 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法）
▪ 实验类型——基础验证型
实验目的
掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法 测定蛋白质含量的基本方法。
五 思考题
测定蛋白质含量还有哪些方法， 测定原理有哪些不同？
移液枪的使用方法
量程的调节 枪头（吸液嘴）的装配 移液的方法 移液器的正确放置 维护保养时的注意事项
吊钩 手柄
移液控制及调节旋纽 吸/枪头推出器
数字显示器
枪杆
移液枪的结构
1.量程的调节 ！！看清量程再调节
千万不要将按钮旋出量程， 否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出 残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的 吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中， 以免污染吸量管及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应 及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上 冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。
/mL
0
10
蛋白质浓度
(μg/mL)
A595
3
4
5
6
7
0.2
0.4
0.6
0.8 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
4.0
4.0
4.0
4.0 4.0
20
40
60
蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
实验名称：蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-燃料结合的原理。
考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。
当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，且其光吸收值与蛋白质含量（10~100μg/ml蛋白质浓度）成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
【实验准备】一、材料（1）血清二、试剂（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。
(2)标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根基其纯度用0.15mol/L NaCl配置成1.0mg/ml蛋白溶液。
（3）0.9% NaCl溶液。
三、器材（1）试管和试管架（2）722型分光光度计（3）吸量管（4）移液枪【实验步骤】一、制作标准曲线取6支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂光度值（A595值）。
以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。
二、血清蛋白质浓度测定测定方法同上。
1mL稀释血清加2.5mL考马斯亮蓝试剂，血清用0.9%NaCl稀释200倍，使其测定值在标准曲线的直线范围内。
用上述0号管调零，测出血清的A595值。
【实验结果】以吸光度A595（2）根据所测血清的值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，乘以稀释倍数，从而计算出血清的蛋白质浓度（mg/ml）0.26 mg/ml【实验讨论】①必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
②测定中蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将比色杯洗干净。
③不要将标准蛋白质和待测蛋白质搞混，以免造成实验结果的改变。
④考马斯亮蓝（ＣＢＢ）显色法测定蛋白质含量的主要缺点之一是线性关系差．通过研究显色液组分对线性关系的影响，发现显色液Ｈ＋浓度是影响线性关系的主要因素【1】。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量(1)
三、实验器材与试剂
⒈器材。 可见分光光度计、试管、试管架、研钵、离心机、离心管、 10ml容量瓶、刻度移液管、移液枪、小麦叶片或绿豆下胚 轴。 ⒉试剂。 ⑴0.9％生理盐水 ⑵考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G250 100㎎，加95％乙醇100ml，溶解后 加85％H３ＰＯ４， 100 ml，加水稀释至 1000ml，存于棕色瓶。 ⑶蛋白质标准溶液 准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配置 1000µg/ml标准溶液。
★实验优点 （1）灵敏度高。据估计比Lowry法约高四倍，蛋白质－染料复 合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定， 只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟 至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法 那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 ★实验缺点 （1）Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面 的偏差。 （2）标准曲线也有轻微的非线性。因而不能用Beer定律进行计 算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
考马斯亮蓝法测定 ——蛋白质含量
一、实验目的。
⒈掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原 理与方法。 ⒉熟练分光光度计的使用和操作方法。
考马斯亮蓝法出现背景
• 双缩脲法和Folin—酚试剂法的 明显缺点和许多限制，促使科学家们去 寻找更好的 蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法 （Bradford法），是根据蛋白质与染料 相结合的原理设计的。这种蛋白质测定 法具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。这一方法是 目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质得含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质得含量。
因此,制作标准曲线就是生物检测分析得一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0、01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4、7%(W/V)乙醇,8、5%(W/V)H3PO4。
2、标准蛋白质溶液:纯得牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0、15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
(二)、器材:1、722S型分光光度计使用及原理()。
2、移液管使用()。
(三)、标准曲线制作:1、2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。
1)、利用标准曲线查出回归方程。
2)、用公式计算回归方程。
3)、或用origin作图,测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0、999以上,至少2个9以上。
4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上得点应该在直线两侧。
(四)、蛋白质含量得测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品得A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品得A595nm值在0、1—0、05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。
(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量【实验目的】1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。
2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。
【实验原理】1976年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。
染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm 变为595 nm ，光吸收增加。
蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g 蛋白。
染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
N CH 2CH 3CH 2N +CH 3CH 2CH 2NHCH 3CH 3O CH 2CH 3SO 3-SO 3Na蛋白质+ 蛋白质-染料复合物H +考马斯亮蓝G-250（蓝色，λmax595nm ）【仪器与试剂】1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。
2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。
【实验步骤】1．标准蛋白质溶液的配制称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml 的溶液。
2．蛋白试剂的配制称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。
试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。
3．标准曲线的制作取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 μl于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。
以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。
4．样品测定取含10~100 μg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量
二、Bradford法(一）、原理：考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。
这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。
CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。
（二）器材及试剂1、器材A. 分光光度计B. 微量加样器C. 移液管、试管及试管架D. 坐标纸2. 试剂（1）考马斯亮蓝G-250溶液：称取CBB- G-250 100毫克溶于50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升85%（V/V）磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
(4) 血清样品(已稀释200倍)(5) 层析样品(三）、操作（标准曲线制作）：取7支试管按下表操作：混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D 值为纵坐标绘制标准曲线．以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容：实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是1976年Bradform建立。
考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量
二、Bradford法(一）、原理：考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。
这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。
CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。
（二）器材及试剂1、器材A. 分光光度计B. 微量加样器C. 移液管、试管及试管架D. 坐标纸2. 试剂（1）考马斯亮蓝G-250溶液：称取CBB- G-250 100毫克溶于50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升85%（V/V）磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
(4) 血清样品(已稀释200倍)(5) 层析样品(三）、操作（标准曲线制作）：取7支试管按下表操作：混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D 值为纵坐标绘制标准曲线．以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容：实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是1976年Bradform建立。
考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
（优选）考马斯亮蓝法法测定 蛋白质含量
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于 染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕 红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白 质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色， 其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数 更大。
考马斯亮蓝G-250在游离状态 下呈红色，最大光吸收在 465nm；当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质 含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的 结合十分迅速，约2min即可 反应完全，其复合物在1h内 保持稳定。
考马斯亮蓝R250与蛋白 质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条 带染色。
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）,
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；
蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 考马斯亮蓝试剂（mL）
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液(I)
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1µg）。 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。 （优选）考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。 可见光范围内波长和颜色的关系
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验报告
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验报告考马斯亮蓝法（Bradford assay）是一种常用于测定蛋白质含量的实验方法。
本文将对考马斯亮蓝法进行详细介绍，并展示一个实验报告的范例。
1. 引言蛋白质是生命体中不可或缺的重要分子，因此准确测定蛋白质的含量对于生物学研究至关重要。
考马斯亮蓝法是一种常用的蛋白质测定方法，其原理基于蛋白质与考马斯亮蓝染料之间的非共价结合。
2. 实验目的本实验的目的是利用考马斯亮蓝法测定给定溶液中蛋白质的含量。
3. 实验步骤3.1 准备工作首先，准备好所需的试剂和设备，包括考马斯亮蓝试剂、蛋白质标准品、显微管、离心机等。
3.2 制备标准曲线按照给定的浓度，分别取一系列蛋白质标准品，加入不同的显微管中。
然后，加入适量的考马斯亮蓝试剂，充分混合。
将显微管放入离心机中离心，使液体沉淀。
离心后，取出显微管，观察颜色变化，并使用分光光度计测定吸光度。
3.3 测定待测样品将待测样品加入显微管中，加入适量的考马斯亮蓝试剂，充分混合。
然后，将显微管放入离心机中离心，使液体沉淀。
离心后，取出显微管，观察颜色变化，并使用分光光度计测定吸光度。
4. 结果与讨论通过测定标准曲线，我们可以得到各个蛋白质标准品的吸光度与浓度之间的关系。
利用这个关系，我们可以计算出待测样品中蛋白质的浓度。
在实验中，我们观察到显微管中的液体颜色会随着蛋白质浓度的增加而加深。
这是因为考马斯亮蓝染料与蛋白质发生非共价结合，形成复合物，使溶液变色。
吸光度的测定则是通过分光光度计来实现的。
需要注意的是，考马斯亮蓝法对于某些物质的干扰较大，因此在实验中应该选择适当的样品稀释倍数，以确保测定结果的准确性。
5. 结论通过考马斯亮蓝法，我们成功测定了给定溶液中蛋白质的含量，并得到了标准曲线。
通过标准曲线，我们可以计算出待测样品中蛋白质的浓度。
6. 结束语考马斯亮蓝法是一种简单、快速且准确的测定蛋白质含量的方法。
它被广泛应用于生物学研究和实验室工作中。
浙江大学生物化学实验甲 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
浓度的计算
• 测出未知样品在595nm处的光吸收值，通过标准 曲线求出未知样品的蛋白含量并进而求出未知样 品的浓度。
• 但由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的
含量不同，因此考马斯亮蓝法用于测定不同蛋白 质时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
• 主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二 烷基硫酸钠（SDS）等。
3、实验材料及试剂
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
管号 1 试剂 0.1mg/ml标准蛋白质溶液（ml） 蒸馏水（ ml ） 考马斯亮蓝试剂（ ml ） 1.0 5 0.2 0.8 5 0.4 0.6 0.6 0.4 5 5 0.8 0.2 5 5 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 5 5 2 3 4 5 6 7 8
即摇匀使反应完全。 • 反应的灵敏度很高，比Lowry法约高四倍，因此
是一种常用的快速测定微量蛋白质的方法。
• 且结合物在室温下1h内保持稳定，在5～20min之 间，颜色的稳定性最好。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
2、考马斯亮蓝法的特点
• 操作简便快捷；可测范围为0～1 000μg/mL，最小
可测2.5μg/mL蛋白质， • 干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+ 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、 EDTA等均不干扰此测定法。
（1）、试验材料 • 待测蛋白溶液 （2）、试验试剂 • 0.1mg/ml的牛血清白蛋白 • 蒸馏水
• 考马斯亮蓝试剂
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
4、操作步骤
（1）、标准曲线的制作
蛋白质含量的测定(一)——考马斯亮蓝染色法
考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量，属于染料结合法的
一种 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕红色，当它与蛋白质通过 疏水作用结合后变为蓝色，前者的最大光吸收在465nm，后 者在595nm 在一定蛋白质浓度范围内（0.01～1.0mg/mL），蛋白质-色素 结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合2min左右达到平衡，完成反应 十分迅速，其结合物在室温1h内保持稳定 考马斯亮蓝G-250染色法简单迅速，灵敏度高，一些阳离子如 K+、Na+、Mg2+、NH4+以及乙醇等物质都不干扰测定，但一 些去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定，且样品测定 后不能回收
常用的检测器有光电管、光电倍增管和光电二极管矩阵 显示装置 把从光电监测器中获得的电信号，通过放大器后，以图形或数字等形式显
示出来 主要有四种类型：指针式、LD数字式、VGA屏幕式和计算机式
722 型 可 见 光 分 光 光 度 计
1.数字显示器；2.吸光度调零旋钮；3.选择开关；4.吸光度调斜率电位器； 5.浓度旋钮；6.光源室；7.电源开关；8.波长手轮；9.波长刻度窗；10.式 样架拉手；11.100%T旋钮；12. 0%T旋钮；13.灵敏度调节旋钮；14.干 燥器
吸收池
亦称样品室、比色池或吸收池，由透明材料（有机玻璃、石英或蓝宝石等）
制成 在紫外光波区检测选用石英、蓝宝石比色杯；在可见光波区检测可选用有机 玻璃比色杯 吸收池使用注意事项 吸收池必须与光束方向垂直 每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生误差 比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性，因此在使 用前务必彻底清洗 检测器 是一种光电转换装置，主要是把光强度转变成电讯号，再通过放大器把信号 输送给测量仪器
实验 6.考马斯亮蓝法测蛋白质的含量
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）, 蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速， 约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳 定。由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系 数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低 检出量为1µg）。由于染色法简单迅速，抗干扰 性强，灵敏度高，线性关系好，近年来在某些方 面有取代经典的Lowry法的趋势，是一种较好的 蛋白质快速微量测定方法。
（二） 样品提取液中蛋白质含量的测定
1.蛋白质提取: 称取样品400mg，加蒸馏水5ml，匀 浆，4000rpm离心10min， 取上清液。 残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，4000rpm离 心10min，合并上清液并定容至10ml。
2. 蛋白质含量测定:
取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，
加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡
枪头（吸液嘴）的装配 在将枪头（pipette tips）套上移 液枪时，正确的方法是将移液枪 （器）垂直插入枪头中，稍微用力 左右微微转动即可使其紧密结合。
移液的方法
1.吸取液体时，用大拇指将按钮按下至第一 停点，移液器保持竖直状态，将枪头插入液 面下2－3毫米。 2.然后慢慢松开按钮回原点。 3.接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停 片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。 最后松开按钮。
1. NaCl、KCl、MgCl2、(NH4)2SO4、乙醇等物 质对测定无影响，而大量的去污剂如Triton X100、SDS等严重干扰测定，少量的去污剂及 Tris、乙酸、2-巯基乙醇、蔗糖、甘油、 EDTA有少量颜色干扰，可很容易地通过用适 当的溶液对照而消除。同时注意，比色应在显 色2min～1h内完成；如果测定很严格，可以 在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因 为在这段时间内颜色最稳定。
实验考马斯亮蓝测蛋白质含 量
实验7 考马斯亮蓝考G-250染色法测定蛋白质含量一、目的1、学习一种蛋白质染色测定的方法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。
涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成蓝色的蛋白质染料复合物，在595nm处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质染料符合物在595nm处的吸光度与蛋白质杭亮成正比，因此可用于蛋白质含量测定。
反应2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。
在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。
高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。
棕色瓶保存，该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。
3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1ml,5ml）3、可见光分光光度计四、操作步骤（一）标准曲线的制作1、取7支试管，按下表加入试剂试0123456管编号00.10.20.40.60.81蛋白标准溶液10.90.80.60.40.20蒸馏水考5555555马斯亮蓝2、将试管摇匀，放置20分钟。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测卵白质含量之迟辟智美创作一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量.因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术.二、卵白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定卵白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤.最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4.2、标准卵白质溶液：纯的牛血清血卵白，预先经微量凯氏定氮法测定卵白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml卵白溶液.（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）.2、移液管使用（）.（三）、标准曲线制作：1、10ug、20 个点为ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线.1）、利用标准曲线查出回归方程.2）、用公式计算回归方程.3）、或用origin作图，测出回归线性方程.即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上.4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧.（四）、卵白质含量的测定：样品即所测卵白质含量样品（含量应处置在所测范围内），依照把持步伐1把持，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品卵白质含量.一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太年夜，可以稀释后再测A595nm 值，然后再计算.（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净.2、取量要准确.3、玻璃仪器要干燥，防止温度变动.4、对比：用被测物质以外的物质作空白对比.药品的配制（磷酸缓冲液的配制）一、药品的配制步伐（一）、实验准备：1、准备所需的药品和玻璃仪器.2、洗涤.（怎样洗涤算干净？）（二）、计算：1、百分比浓度计算：1)、G/V比例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水.2）、V/V比：例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X, X=75ml.取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水.乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100ml，200 ml混合.3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量.2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明. 1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml.M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G （g）/摩尔质量毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量微摩尔数=G（ug）/摩尔质量称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug 3、混合溶液配制的计算：如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制.注意：1、分别标定体积计算2、分别配制再混合，但总体积不能为100ml （三）、标量：1、根据需要选择分歧量程的天平根据要求去分歧精度的丈量器，如量筒或移液管.2、电子分析天平的使用.（四）、溶解：1、根据药品配置要求选择溶剂.蒸馏水，双蒸水，无离子水等.2、只能用烧杯溶解.注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤烧杯三次左右，直到洗涤干净.小知识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的知识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）.如酸碱两性物质的配制（AA、卵白质、核苷酸等）如果溶解性能欠好可以用稀酸或稀碱增进溶解，但pH应在被要求的范围内.3、加热增进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好.如:配0.1%的淀粉，水裕加热（温度在80-90.C），过量会糊化.（五）、定容：1、用容量瓶定容；2、用玻璃棒引流或用小漏斗；3、用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度.要求刻度与液体凹面相切为止（眼睛可视）；4、上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可.(注意不再定容了，防止溶液漏失落.)（六）、装入试剂瓶，贴上标签.标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等.（七）、清理实验场所.二、磷酸缓冲液的配制.（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液.用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液.选用药品：Na2HPO4·12H2O（碱）和NaH2PO4·12H2O （酸）配缓冲液100ml.书中说明.（二）、计算：1、注：书中有注明配置的量.2、含有分歧结晶水的换算.书中配1/15mol/L的缓冲液配1L，书中用Na2HPO4·2H2O 需要11.87g/L但用Na2HPO4·12H2O需几多g？11.87=（178/358）×X，X=23.87g.（三）、分别配制缓冲液各100ml（根据需要确定配制的量）.即：0.2M Na2HPO4·2H2O和NaH2PO4·2H2O100ml.（四）、按书中的量配制取量再混合.如：pH=6.8，分别去缓冲对49ml和51ml.（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值，检测配置是否准确.（六）如配50mM pH =6.8的缓冲液100ml ，以你配制的母液稀释即可.计算：50×0.1=0.2×1000×X （L）；X =0.025L；取0.2M pH=7.2的缓冲液25ml，用蒸馏水定容至100ml即可.。
可溶性蛋白含量测定法(考马斯亮蓝染色法)
.可溶性蛋白含量测定（考马斯亮蓝染色法）1. 试剂配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L。
在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。
90% 乙醇配制：95%乙醇和75%乙醇按3:1体积比混合配制，即95%乙醇37.5ml，75%乙醇12.5ml或取45ml无水乙醇直接定容至50ml。
（2）100 g/ml 牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取10mg BSA定容至100 ml即为100 g/ml。
或称取25 mg BSA加蒸馏水水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40 ml蒸馏水定容至100ml。
（3）0.05 mol/L，pH7.8磷酸配制：A母液，0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO 412H2O (分子量358.14)35.85 g，用蒸馏水定容至500 ml。
B母液，0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O (分子量156.01)1.5601 g，用蒸馏水定容到50 ml。
0.05M pH7.8磷酸：分别取A母液228.75ml，B母液21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
2. 标准曲线绘制取6支具塞试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min 左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
试剂0号1号2号3号4号5号标准蛋白体积/ml0.000.200.400.600.80 1.00蒸馏水体积/ml 1.000.800.600.400.200.00蛋白质含量/g020*********3. 样品测定（1）样品提取：取鲜样0.2—0.5g，用蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min—4000r/min 离心10min，上清液备用。
（2）吸取样品提取液1.0ml（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复两次），加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min带反应完成，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查蛋白质含量。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量（一）一、曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作曲线，然后根据曲线查出所测物质的含量。
因此，制作曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、曲线制作：1、2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。
药品的配制（磷酸缓冲液的配制）一、药品的配制步骤（一）、实验准备：1、准备所需的药品和玻璃仪器。
2、洗涤。
（怎样洗涤算干净？）（二）、计算：1、百分比浓度计算：1)、G/V比例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。
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据所测A595值，于标准曲线 上查出相当标准蛋白的量，取
三重复样品蛋白含量均值
以制作标准曲线的1号试管 做空白对照，595nm测吸光度
㈢结果计算
样品蛋白质含量=—m —(µg)—×提—取液—总—体积—（m—l）
／g鲜重﹚
所取提取液体积×样品鲜重（
m为从标准曲线查得的蛋白质含量。
﹙µg
㈣、标准比较法 取三只试管，按下表操作
试管编号 待测管（U) 标准管（S) 对照管（B)
试剂
V(样品提取液）0.1 ／ml
__
__
V（蛋白质标 —
0.1
准液)ml
V(0.9％生理 — 盐水）／ml
__
0.1
V（考马斯亮 3.0 蓝试剂）／㏕
3.0
3.0
混匀放5min
A595
调零
★样品蛋白质提取液含量m(µg)=Au／ As×100
五、注意事项
（µg／0.1ml)
20 40 60
80 100 20 0 80 100
每支试管加入3ml考马斯亮蓝试剂
振荡混合后放置5分钟
A595为纵坐标、标准蛋白含量横坐标 绘制标准曲线
于595nm测定吸光度
㈡样品提取液中蛋白质含量的测定
取3支试管，各吸蛋白提 取液0.1ml，分别加考 马斯亮蓝试剂3ml
振荡混合放置5分钟
三、实验器材与试剂
⒈器材。 可见分光光度计、试管、试管架、研钵、离心机、离心管、
10ml容量瓶、刻度移液管、移液枪、小麦叶片或绿豆下胚 轴。 ⒉试剂。 ⑴0.9％生理盐水 ⑵考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G250 100㎎，加95％乙醇100ml，溶解后 加85％H３ＰＯ４， 100 ml，加水稀释至 1000ml，存于棕色瓶。 ⑶蛋白质标准溶液
⒈待测液中蛋白质浓度不可过高或过低，应 控制在100~800µg／ml为宜。
⒉比色测定时，考马斯亮蓝易吸附在比色皿 表面，对后续测定造成影响，因此测定结 束后用无水乙醇清洗比色皿。
预期结果
• Brandford染色液和蛋白液在酸性条件 下结合，溶液颜色由棕黑色转为蓝色。
一、实验目的。
⒈掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原 理与方法。
⒉熟练分光光度计的使用和操作方法。
考马斯亮蓝法出现背景
•
双缩脲法和Folin—酚试剂法的
明显缺点和许多限制，促使科学家们去
寻找更好的 蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法
（Bradford法），是根据蛋白质与染料
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。
★实验缺点
（1）Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面 的偏差。
（2）标准曲线也有轻微的非线性。因而不能用Beer定律进行计 算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配置 1000µg/ml标准溶液。
四、实验步骤
㈠标准曲线的制作 取试管6只，按下表进行编号并加入试剂，充分摇匀。
试管编号
1234 Nhomakorabea56
试剂
V（标准蛋白溶液） 0
／µl
20 40 60
V(0.9％生理盐水） 100 80 60 40
／µl
Ρ(蛋白质含量）／ 0
★在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质 浓度成正比
★实验优点
（1）灵敏度高。据估计比Lowry法约高四倍，蛋白质－染料复 合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定， 只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟 至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法 那样费时和严格地控制时间。
相结合的原理设计的。这种蛋白质测定
法具有超过其他几种方法的突出优点，
因而正在得到广泛的应用。这一方法是
目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
二、实验原理
★考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中 与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的 位置，由465nm变为595nm，溶液的颜 色也由棕红色变为蓝色。经研究认为， 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 （特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基 相结合。