限制性核酸内切酶PPT课件
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江西省新余市第四中学高三一轮复习人教版生物选修三课件专题111限制性核酸内切酶(共12张PPT)
多能产生不同的DNA片段种类数是（ ）
A.3 B.4
C.9 D.12
C
8、一环状DNA分子，设其长度为1，已知某种限制性核酸内切酶 在该分子上有3个酶切位点，如图中箭头A、B、C所指。如果该 DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生0.2、0.3、0.5 三种不同长度的DNA片段。现有多个上述DNA分子，若在每个分 子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后， 这些DNA分子最多能产生长度不同的线状DNA的种类数是（ ）
图2 图1
（4）若用图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后形成重组
质粒，则应该选择的限制酶是 BamHⅠ 。在导入重组质粒后，为
筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需用添加 抗生素B 的培养基。
经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确
表达，其最可能的原因是
。
同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接
A 作正确的是（ ）
A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割 C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割 D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
4、下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图 (↓表示剪切点、切出的断面为黏性末端)：
C 请指出下列哪组表达正确（ ）
少有一个酶切位点被该酶切断，则理论上讲，经该酶酶切后，这些
C 线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（ ）
A.3 B.4
C.9 D.12
7、如果一个环状DNA上有三种限制酶a、b、c的酶切位点。现有
多个该环状DNA分子，若在每个DNA分子上至少有一个酶切位点
被该酶切断，则理论上讲，经该酶酶切后，这些环状DNA分子最
质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组PPT课件( 37页)
1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82)
3.定性鉴定:DNA 的琼脂糖凝胶电 泳
4.定量检测：DNA 的紫外分光光度法 测定(P39)
实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的 作用 ;
掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切 酶
一.质粒DNA的提取
(1)重组质粒;
(2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶;
(3)反应缓冲液。
32
2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）
33
2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ
ddH2O
10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
26
1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
•
3、命运给你一个比别人低的起点是想告诉你，让你用你的一生去奋斗出一个绝地反击的故事，所以有什么理由不努力!
•
4、心中没有过分的贪求，自然苦就少。口里不说多余的话，自然祸就少。腹内的食物能减少，自然病就少。思绪中没有过分欲，自然忧就少。大悲是无泪的，同样大悟
无言。缘来尽量要惜，缘尽就放。人生本来就空，对人家笑笑，对自己笑笑，笑着看天下，看日出日落，花谢花开，岂不自在，哪里来的尘埃!
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82)
3.定性鉴定:DNA 的琼脂糖凝胶电 泳
4.定量检测：DNA 的紫外分光光度法 测定(P39)
实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的 作用 ;
掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切 酶
一.质粒DNA的提取
(1)重组质粒;
(2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶;
(3)反应缓冲液。
32
2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）
33
2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ
ddH2O
10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
26
1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
•
3、命运给你一个比别人低的起点是想告诉你，让你用你的一生去奋斗出一个绝地反击的故事，所以有什么理由不努力!
•
4、心中没有过分的贪求，自然苦就少。口里不说多余的话，自然祸就少。腹内的食物能减少，自然病就少。思绪中没有过分欲，自然忧就少。大悲是无泪的，同样大悟
无言。缘来尽量要惜，缘尽就放。人生本来就空，对人家笑笑，对自己笑笑，笑着看天下，看日出日落，花谢花开，岂不自在，哪里来的尘埃!
工具酶(限制性内切酶)优秀PPT
7
Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用 于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。
2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组 成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。
3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸 运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。
在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分 析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
• 这类酶很少能达到完全切割。
11
某些识别和切割独特的酶
12
BsmBⅠ
13
Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
14
15
• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 亚基约 200-350 个氨基酸。
16
某些识别和切割独特的酶
17
限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统 一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出 了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系 的一个简化版。其主要特征是：
Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用 于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。
2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组 成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。
3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸 运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。
在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分 析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
• 这类酶很少能达到完全切割。
11
某些识别和切割独特的酶
12
BsmBⅠ
13
Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
14
15
• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 亚基约 200-350 个氨基酸。
16
某些识别和切割独特的酶
17
限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统 一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出 了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系 的一个简化版。其主要特征是：
限制性核酸内切酶一知识讲稿
总结词
切割方式独特
详细描述
Ⅲ型限制性核酸内切酶的切割方式也较为独特，它通常在识 别位点的两侧进行切割，产生具有不同序列和长度的DNA 片段。
总结词
应用潜力大
详细描述
由于Ⅲ型限制性核酸内切酶的独特特性和切割机制，它在 基因组学、生物信息学和基因治疗等领域具有较大的应用 潜力。
03
限制性核酸内切酶的作 用机制
04
限制性核酸内切酶的基 因工程应用
基因克隆与鉴定
基因克隆
限制性核酸内切酶能将DNA切割成特定序 列的片段，这一特性使得科学家能够通过切 割和重新连接DNA片段，将感兴趣的基因 从复杂的基因组中分离出来，从而实现基因 克隆。
基因鉴定
限制性核酸内切酶可以用来分析特定基因的 表达模式，通过比较不同组织或发育阶段中 特定基因的表达水平，可以了解该基因的功
感谢您的观看
B型限制性核酸内切酶
总结词
切割位点固定
详细描述
B型限制性核酸内切酶的切割位点通常固定，切割后产生具有固定长度和序列的 粘性末端，这使得酶切后的DNA片段容易进行连接和重组。
B型限制性核酸内切酶
总结词
切割效率高
详细描述
B型限制性核酸内切酶具有较高的切割效率，能够在短时间内将大量DNA分子进行切割，提高实验的 效率。
新技术的应用
随着生物技术的不断发展，限制性核酸内切酶的应用前景将更加 广阔，如基因编辑、基因治疗等领域。
安全性和伦理标准的提高
随着人们对生物技术的认识加深，限制性核酸内切酶的安全性和伦 理标准也将不断提高。
法规监管的完善
政府和国际组织将加强对限制性核酸内切酶的法规监管，确保技术 的合理应用和发展。
THANKS FOR WATCHING
切割方式独特
详细描述
Ⅲ型限制性核酸内切酶的切割方式也较为独特，它通常在识 别位点的两侧进行切割，产生具有不同序列和长度的DNA 片段。
总结词
应用潜力大
详细描述
由于Ⅲ型限制性核酸内切酶的独特特性和切割机制，它在 基因组学、生物信息学和基因治疗等领域具有较大的应用 潜力。
03
限制性核酸内切酶的作 用机制
04
限制性核酸内切酶的基 因工程应用
基因克隆与鉴定
基因克隆
限制性核酸内切酶能将DNA切割成特定序 列的片段，这一特性使得科学家能够通过切 割和重新连接DNA片段，将感兴趣的基因 从复杂的基因组中分离出来，从而实现基因 克隆。
基因鉴定
限制性核酸内切酶可以用来分析特定基因的 表达模式，通过比较不同组织或发育阶段中 特定基因的表达水平，可以了解该基因的功
感谢您的观看
B型限制性核酸内切酶
总结词
切割位点固定
详细描述
B型限制性核酸内切酶的切割位点通常固定，切割后产生具有固定长度和序列的 粘性末端，这使得酶切后的DNA片段容易进行连接和重组。
B型限制性核酸内切酶
总结词
切割效率高
详细描述
B型限制性核酸内切酶具有较高的切割效率，能够在短时间内将大量DNA分子进行切割，提高实验的 效率。
新技术的应用
随着生物技术的不断发展，限制性核酸内切酶的应用前景将更加 广阔，如基因编辑、基因治疗等领域。
安全性和伦理标准的提高
随着人们对生物技术的认识加深，限制性核酸内切酶的安全性和伦 理标准也将不断提高。
法规监管的完善
政府和国际组织将加强对限制性核酸内切酶的法规监管，确保技术 的合理应用和发展。
THANKS FOR WATCHING
DNA的限制性酶谱分析ppt课件
实验5 限制性酶切分析
.
1
一. 实验目的
通过本实验了解限制性内切酶的作用原 理，限制性酶切技术及限制性酶切图谱的 分析方法。
.
2
二. 实验原理
限制性内切酶是一类能识别并切割双链 DNA分子中特定核苷酸序列的核酸内切 酶。
.
3
限制性酶切反应体系的组成
1，DNA 2，缓冲液 提供限制性酶作用所需的离子浓度及种 类；提供限制性酶作用所需的 pH值 3，限制性内切酶
.
4
限制性酶切图谱的分析
DNA在限制性酶切后往往会形成多条片段， 从片段的数量和大小大致可以推断DNA限 制性酶切位点的多少及相对位置。
我们往往利用DNA分子量Marker读出酶 切片段的大小。
.
5
DNA分子量Marker
100 bp Marker
.
6
三. 实验方法
1．在0.5 ml 离心管中混和如下试剂()：
.
8
3．取10µl反应液，1％琼脂糖凝胶电泳检测， 同时以 DNA（EcoRI/HindIII）作为分子量 Marker
4.记录实验结果：对照分子量Marker，记录所 得片段的数量和大小，并分析 DNA有几个 HindIII酶切位点
.
9
.
10
.
11
.
12
.
13
.
14
后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用
DNA：
2 µl
10×酶切缓冲液：
2 µl
无菌水：
14 µl
HindIII：
1 µl
EcoRI
1 µl
2．37℃水浴 45 min
.
.
1
一. 实验目的
通过本实验了解限制性内切酶的作用原 理，限制性酶切技术及限制性酶切图谱的 分析方法。
.
2
二. 实验原理
限制性内切酶是一类能识别并切割双链 DNA分子中特定核苷酸序列的核酸内切 酶。
.
3
限制性酶切反应体系的组成
1，DNA 2，缓冲液 提供限制性酶作用所需的离子浓度及种 类；提供限制性酶作用所需的 pH值 3，限制性内切酶
.
4
限制性酶切图谱的分析
DNA在限制性酶切后往往会形成多条片段， 从片段的数量和大小大致可以推断DNA限 制性酶切位点的多少及相对位置。
我们往往利用DNA分子量Marker读出酶 切片段的大小。
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5
DNA分子量Marker
100 bp Marker
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6
三. 实验方法
1．在0.5 ml 离心管中混和如下试剂()：
.
8
3．取10µl反应液，1％琼脂糖凝胶电泳检测， 同时以 DNA（EcoRI/HindIII）作为分子量 Marker
4.记录实验结果：对照分子量Marker，记录所 得片段的数量和大小，并分析 DNA有几个 HindIII酶切位点
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9
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10
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后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用
DNA：
2 µl
10×酶切缓冲液：
2 µl
无菌水：
14 µl
HindIII：
1 µl
EcoRI
1 µl
2．37℃水浴 45 min
.
《生物选修三》PPT课件
A.BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互补序列-AATTB.BamHⅠ和HindⅢ；末端互补序列-GATCC.EcoRⅠ和HindⅢ；末端互补序列-AATTD.BamHⅠ和BglⅡ；末端互补序列-GATC-
【解题关键】首先要明确不同的限制酶有特定的识别 序列，其次要分析切割下的黏性末端能否互补，另外要注意 互补序列的正确书写。
38
ppt课件
【典例3】(2010·江苏高考改造)下表中列出了几种限制酶 识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的 酶切位点。请回答下列问题：
39
ppt课件
(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有 ____个游离的磷酸基团。 (2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质 粒的热稳定性越_____。
36
ppt课件
3.载体的种类 (1)细菌质粒，它是细菌拟核DNA以外的小型环状DNA，有的 细菌只有一个，有的细菌有多个。 (2)λ噬菌体的衍生物和某些病毒的DNA。 一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人 们根据不同的目的和需求，对某些天然的载体进行人工改造。
37
ppt课件
①最常用的载体是质粒，它来源于细菌和酵母菌等 生物，其上的基因属于细胞质基因。它能自我复制，既可在 自身细胞、受体细胞复制，也可在体外复制。 ②主动运输中载体蛋白的化学本质是蛋白质，其作用是运输 离子、氨基酸、核苷酸等物质进出细胞。而基因工程中的载 体的化学本质是DNA，其作用是携带目的基因进入受体细胞。
40
ppt课件
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ 切割，原因是_____________________________________。 (4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ 两种限制 酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_______。 (5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混 合，并加入_____酶。
【解题关键】首先要明确不同的限制酶有特定的识别 序列，其次要分析切割下的黏性末端能否互补，另外要注意 互补序列的正确书写。
38
ppt课件
【典例3】(2010·江苏高考改造)下表中列出了几种限制酶 识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的 酶切位点。请回答下列问题：
39
ppt课件
(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有 ____个游离的磷酸基团。 (2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质 粒的热稳定性越_____。
36
ppt课件
3.载体的种类 (1)细菌质粒，它是细菌拟核DNA以外的小型环状DNA，有的 细菌只有一个，有的细菌有多个。 (2)λ噬菌体的衍生物和某些病毒的DNA。 一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人 们根据不同的目的和需求，对某些天然的载体进行人工改造。
37
ppt课件
①最常用的载体是质粒，它来源于细菌和酵母菌等 生物，其上的基因属于细胞质基因。它能自我复制，既可在 自身细胞、受体细胞复制，也可在体外复制。 ②主动运输中载体蛋白的化学本质是蛋白质，其作用是运输 离子、氨基酸、核苷酸等物质进出细胞。而基因工程中的载 体的化学本质是DNA，其作用是携带目的基因进入受体细胞。
40
ppt课件
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ 切割，原因是_____________________________________。 (4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ 两种限制 酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_______。 (5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混 合，并加入_____酶。
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
目 录
• 限制性核酸内切酶的概述 • 限制性核酸内切酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作原理 • 限制性核酸内切酶的应用 • 限制性核酸内切酶的未来发展
01
限制性核酸内切酶的概述
定义和特性
定义
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定 部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
在生物科学领域的应用
基因克隆和DNA重组技 术
限制性核酸内切酶是基因克隆和DNA重组 技术中的关键工具，用于切割和重组DNA 片段。
基因诊断和基因治疗
限制性核酸内切酶可用于检测和纠正基因突变，为 基因诊断和基因治疗提供有效手段。
生物制药和生物技术
限制性核酸内切酶在生物制药和生物技术领 域中用于生产重组蛋白、抗体和治疗性核酸 等生物制品。
双活性酶
02
同时具有切割和磷酸酶活性，如BstAPI。
多活性酶
03
同时具有多种活性，如FokI同时具有切割、磷酸酶和甲基化酶
活性。
03
限制性核酸内切酶的工作原理
识别和切割DNA的过程
识别
限制性核酸内切酶能够识别特定的 DNA序列，通常是4-6个核苷酸组成 的序列。
切割
在识别位点处，限制性核酸内切酶将 DNA链切开，形成两个断开的磷酸二 酯键。
产生黏性末端
限制性核酸内切酶切割DNA后，通常产生具有突出末端的片段，也称为黏性末端 。这种黏性末端可以用于DNA的连接和重组。
04
限制性核酸内切酶的应用
在基因工程中的应用
1 2 3
基因克隆
限制性核酸内切酶能够将DNA分子切割成特定序 列的片段，为基因克隆提供精确的DNA片段。
目 录
• 限制性核酸内切酶的概述 • 限制性核酸内切酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作原理 • 限制性核酸内切酶的应用 • 限制性核酸内切酶的未来发展
01
限制性核酸内切酶的概述
定义和特性
定义
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定 部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
在生物科学领域的应用
基因克隆和DNA重组技 术
限制性核酸内切酶是基因克隆和DNA重组 技术中的关键工具，用于切割和重组DNA 片段。
基因诊断和基因治疗
限制性核酸内切酶可用于检测和纠正基因突变，为 基因诊断和基因治疗提供有效手段。
生物制药和生物技术
限制性核酸内切酶在生物制药和生物技术领 域中用于生产重组蛋白、抗体和治疗性核酸 等生物制品。
双活性酶
02
同时具有切割和磷酸酶活性，如BstAPI。
多活性酶
03
同时具有多种活性，如FokI同时具有切割、磷酸酶和甲基化酶
活性。
03
限制性核酸内切酶的工作原理
识别和切割DNA的过程
识别
限制性核酸内切酶能够识别特定的 DNA序列，通常是4-6个核苷酸组成 的序列。
切割
在识别位点处，限制性核酸内切酶将 DNA链切开，形成两个断开的磷酸二 酯键。
产生黏性末端
限制性核酸内切酶切割DNA后，通常产生具有突出末端的片段，也称为黏性末端 。这种黏性末端可以用于DNA的连接和重组。
04
限制性核酸内切酶的应用
在基因工程中的应用
1 2 3
基因克隆
限制性核酸内切酶能够将DNA分子切割成特定序 列的片段，为基因克隆提供精确的DNA片段。
限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用 ppt课件
ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。
2、Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割 某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别
序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重 组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文 对称特异核苷酸序列，产生5'或3'黏性末端（也有一些产生平端或钝端）
Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制3、与命修名饰活：性，其切割位点很难预测。
规则： 第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名 第二、三个字母（小写）：该细胞的种名 第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编号
例如：EcoRⅠ、HindⅢ 等等
ppt课件
3
限制性核酸内切酶切割原理
1、Ⅰ类和Ⅲ类酶： 在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于
解决方法
1.标准底物检测酶活性
2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3.检查反应系统是否最佳
4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解，重 新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌 株
5. 换 用 不 同 切 割 非 甲 基 化 位 点 的 同 类 酶 消 化 DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩增
10chenli?结果分析限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向orientationl在选择限制性内切酶时应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要
2、Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割 某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别
序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重 组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文 对称特异核苷酸序列，产生5'或3'黏性末端（也有一些产生平端或钝端）
Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制3、与命修名饰活：性，其切割位点很难预测。
规则： 第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名 第二、三个字母（小写）：该细胞的种名 第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编号
例如：EcoRⅠ、HindⅢ 等等
ppt课件
3
限制性核酸内切酶切割原理
1、Ⅰ类和Ⅲ类酶： 在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于
解决方法
1.标准底物检测酶活性
2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3.检查反应系统是否最佳
4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解，重 新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌 株
5. 换 用 不 同 切 割 非 甲 基 化 位 点 的 同 类 酶 消 化 DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩增
10chenli?结果分析限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向orientationl在选择限制性内切酶时应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要
限制性酶切与连接PPT课件
• 质粒pUC18 DNA • PCR产物 • HindⅢ内切酶 • Hind Ⅲ 10 X buffer • ddH2O
实验步骤与试剂
反应体系 • 质粒pUC18 DNA
2μ l
• PCR产物
2μ l
• HindⅢ内切酶
2μ l
• Hind Ⅲ 10 X buffer 2μ l
• ddH2O
12μ l
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DNA电泳常见问题分析 问题六：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一
原 因
• DNA上结合有蛋白质
• 内切酶中含有DNA外 对
切酶
策
• 减少酶用量或消化时间，换 用新包装的酶
• 减少酶用量或消化时间，换 用新包装的酶
DNA电泳常见问题分析
问题七：酶切后的DNA片段连接效率低
原 因
• 含磷酸盐的浓度高
成都医学院-生化与分子生物实验
注意事项——限制性内切酶酶切
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常
1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物 所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－ ３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中 对内切酶的污染。
第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别 顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核 苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应 用于基因克隆。
实验步骤与试剂
反应体系 • 质粒pUC18 DNA
2μ l
• PCR产物
2μ l
• HindⅢ内切酶
2μ l
• Hind Ⅲ 10 X buffer 2μ l
• ddH2O
12μ l
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DNA电泳常见问题分析 问题六：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一
原 因
• DNA上结合有蛋白质
• 内切酶中含有DNA外 对
切酶
策
• 减少酶用量或消化时间，换 用新包装的酶
• 减少酶用量或消化时间，换 用新包装的酶
DNA电泳常见问题分析
问题七：酶切后的DNA片段连接效率低
原 因
• 含磷酸盐的浓度高
成都医学院-生化与分子生物实验
注意事项——限制性内切酶酶切
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常
1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物 所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－ ３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中 对内切酶的污染。
第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别 顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核 苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应 用于基因克隆。
基因操作工具酶PPT课件
α- 32P-dATP
EcoR I 酶切末端
同位素标记的EcoR I 酶切末端
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3.3 Taq DNA聚合酶
显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性90 %； 93℃ 反应 2 h残留活性60% ；94℃ 反应 2 h残 留活性40%。
应用：（1）对DNA的特定片段进行体外扩增； （2） DNA序列测定。
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2 DNA连接酶
2.1 定义及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项
Home
2.1 定义及功能
DNA连接酶（DNA ligase）： 可使一段DNA 3`-OH末端和5`-P 末端
形成3`,5`-磷酸二酯键，把两DNA片段 连在一起封闭双链上形成的切口的酶。
OH P
5`
• 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个 字母（大写）
• 若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先 后顺序用罗马字母表示。
例如：EcoRⅠ 从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为 EcoRⅠ， 其中E 代表属名（Escherichia)，co 代表种名（coli)， R 代表株系（RY13），Ⅰ 代表该菌株中首次分离到。
应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针
缺口
DNase I DNA聚合酶 I
DNA聚合酶 I dNTP*
缺口
缺口平移法制备DNA分子探针 Back
3.2 Klenow聚合酶
活性： 5`→3`聚合活性，3`→5` 外切酶活性，无5`→3`
外切酶活性。 用途： （1）填补或标记DNA的3`隐蔽末端； （2）催化合成cDNA第二链； （3）DNA序列测定
5-7 bp非对称序 列
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转基因烟草过程中，如下操作错误的是
(A )
A．用限制性核酸内切酶切割烟烟草草花花叶叶病病毒毒的核酸
B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体
C．将重组DNA分子导入烟草原生质体
D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞
（2）作用特点：
识别和切割DNA分子内一小段
特殊核苷酸序列
5’
3’ 5’
3’
A培养基 含四环素杆 菌菌落
2.除利用标记基因筛选是否导入 目的基因之外，你还有什么办法 进行筛选？
核酸分子杂交
3.上述筛选出来的受体细胞是否 一定能表达目的基因？
7.请猜测郭三堆团队检测目的基因表达的方法
个体 让棉铃虫吃棉花叶片，若表达成 水平 功，棉铃虫会死亡
4.郭三堆团队选用的载体是什么？常用载 体有哪些？
（1） 载体的种类： 质粒、 λ噬菌体和动植物病毒。
下列与基因工程载体有关的叙述正确的是（A ）
A．质粒是最常用的载体，在细菌中以独立于拟核之 外的方式存在
B．质粒作为载体的原因之一是它为环状，便于切割 后与目的基因连接
C．载体中的标记基因可促进目的基因的表达 D．当受体细胞为大肠杆菌时，多种噬菌体均可作为
株（假定Bt基因都能正常表达）。某些抗虫植株体细
胞含两个Bt基因，这两个基因在染色体上的整合情况
有下图所示的三种类型（黑点表示Bt基因的整合位
点）；让这些含两个Bt基因抗虫的植株自交，后代含
抗虫基因的个体的比例由大到小顺序为
A．甲、丙、乙 C．丙、乙、甲
B．甲、乙、丙 D．乙、甲、丙
A
9.单一基因培育出的转基 因抗虫棉,虽然具有许多 优点,但也存在着许多不 足,如抗虫范围相对较窄, 抗虫性还不是特别强。为 提高棉花对害虫的抗虫能 力，可采取什么措施？
载体，如λ噬菌体和T2噬菌体
（2） 载体的必要条件
能在受体生物细胞内稳定保存，并大量复制和表达 有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。 具有某些标记基因，便于筛选。
5.抗虫基因是如何导入棉花细胞的？
①农杆菌转化法 ②花粉管通道法
如何将目的基因导入动物细胞？
显微注射技术：将基因表达载体提纯，用显微仪 注射到受精卵中
如何将目的基因导入细菌？
用Cacl2处理细胞，增大细胞壁的通透性
SUCCESS
THANK YOU
2019/6/27
6.若某受体细胞表达了标记基因，是否意 味着导入了目的基因？
目的基因
四环素抗性基因 四环素抗性蛋白
受体细胞
氨苄青霉素 抗性基因
目的基因
四环素抗性基因 四环素抗性基因
为了检测目的基因是否导入原本没有氨苄青霉素抗性基因和四 环素抗性的大肠杆菌，将大肠杆菌在含四环素的培养基上培养， 得到如图二的菌落。再将灭菌绒布轻轻按在培养基上，使绒布 面沾上菌落，然后将绒布平移按到含氨苄青霉素的培养基上培 养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。
SUCCESS
THANK YOU
2019/6/27
根据导入外源基因种类数 的不同,转基因抗虫棉又 可分为： 单价转基因抗虫棉、 双价转基因抗虫棉、 多价转基因抗虫棉等
《棉花与节气》 ----吴广深
清明谷雨紧相连，西北中原齐种棉； 立夏小满轻施肥，滋润幼苗壮棉田； 芒夏连暑勤追肥，促发棵来花铃现； 立秋处暑收获季，采摘归仓笑开颜。
预祝各位同学
高考顺利！
基因工程 ——抗虫棉的培育
考纲考情
基因工程的诞生 I 择题T3
基因工程的原理和技术 II
2009选 2010选择题T2
2011选择题T6
2012选择题T6
2013非选择题T32
郭三堆
2013年CCTV年度科技创新人物 中国“抗虫棉”之父
郭三堆的团队在抗虫棉的培育中运 用了哪些技术？ 所用技术主要包括哪些具体环节？
若某些目的基因表达后在个体水平的表现不明
显，你还有什么办法检测目的基因是否成功表
达？
分子 水平
抗原—抗体杂交
8.抗虫基因会导入到什么部位呢？会导入几个？
目的基因插入位置和数目具有随机性
B B
A
B B
B
B B
C
某农业研究所将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因（Bt）导
入棉花，筛选出Bt基因成功整合到染色体上的抗虫植
3’
5’ 3’ 5’
G使A用ADTNAT连C接酶目的制作G重组A ADNTAT分C子
C T T A A G 基因 C T T A A G
CTTCATG GAAGTACTTAA
AATTCCCTAA GGGATT
质 粒
加入DNA连接酶后，可能生成的产物有哪些? 目的基因和质粒的连接产物是否一定符合要求?
1.郭三堆团队是如何获取目的基因的?
化学合成法
目的基因的核苷酸序列已知
聚合酶链式反应 （PCR）扩增
目的基因的核苷酸序列未知从基因中获取2.基因工程的核心是什么?
构建重组DNA分子
3.需要用到哪些工具?
限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体
限制性核酸内切酶
（1）作用对象： DNA
(2010·浙江卷，2)在用基因工程技术构建抗除草剂的