分子生物学实验 质粒的提取和酶切鉴定

提取步骤
1.5ml 菌液 重复3次 10000g离 心1min 250ul P1 吹打 250ul P2
沉淀
500ul 平衡液BL 350ul P3
溶液清亮粘稠
12000g离 心10min
上清 白色沉淀
12000g 离心 1min 重复1 次PW
12000g 离心 1min
CP3 柱
来自百度文库
600ul PW
0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中， 迁移率 溴酚蓝=300bp 二甲苯胺蓝=4kbp
结果分析
M 1 2 3 4 5 6
M：1kbDNA Mark 1: 酶切前质粒DNA 2-6：酶切后产物
NCBI
PUBMED
The concentration and purity of Plasmid
Plasmid/dsDNA: 1 OD260 = 50ug/ml
100% DNA: OD260/OD280 = 1.8
100% RNA: OD260/OD280 = 2.0
Question:
OD260/OD280 < 1.8 ? OD260/OD280 > 1.8 ?
0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～4 0.1～3
0.3 0.6
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶
Agarose gel electrophoresis identification
Marker A B C D
BamH I EcoR I
6000bp 5000bp 2000bp 1000bp
pcDNA3.1/myc-His质粒的提取（预先过夜摇好菌液） 6、12,000rpm离心1分钟，弃流出液。 7、加入600ul溶液PW，12,000rpm离心1分钟，弃 流出液。(重复1次) 8、12,000rpm离心2分钟，彻底去除残留的PW。 9、将吸附柱置于一干净的1.5ml Ep管中，在柱的 中央加入30-50ul EB（pH>7.0），室温静置1分钟。（EB在60-70℃ 水浴预热，使用效果更好 10、10,000rpm离心1分钟，洗脱质粒DNA待用。
Plasmid conformation variation leads to different migration
DL5Kb Marker
A
B
C
5000bp 3000bp
2000bp
1500bp 1000bp
750bp
A: cleavage plasmid B: linear plasmid C: superhelix plasmid
CP3柱开 盖2-5min
50ul EB 静置 2min
12000g 离心 2min
pcDNA3.1/myc-His质粒的提取（预先过夜摇好菌液） 1、吸取1.5ml过夜培养的细菌于Ep管中，10,000rpm 离心1分钟，小心吸弃上清 重复两次操作，共获得 4.5ml过夜培养的细菌。 2、加入250ul溶液P1（含RNase A）于Ep管中，移液 枪吹打悬浮细菌。 3、加入250ul溶液P2，温和地上下翻转混合6次 （2-5分钟）。 4、加入350ul溶液P3，轻轻混合6次，室温静置2分钟 。 5、12,000rpm离心10分钟，小心吸取上清加入吸附 柱中。 (可选步骤：吸附柱实验前加500ulBL平衡液， 12,000rpm离心1分钟后倒弃收集管内液体)
质粒提取：碱裂解法
基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差 异而达到分离目的。 pH =12.6（碱性）
染色体DNA：氢键断裂变性。
pH=中性
质粒DNA：复性，溶于溶液中
质粒DNA：大部分氢键断裂， 染色体DNA：不能复性；形成缠连 但超螺旋共价闭合环状的两 的网状结构。 条互补链不会完全分离。 （不完全变性） NaAc溶液（pH4.8） 离心 染色体DNA与不稳定的大分子RNA、 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来
7.核糖体结合 位点：53005304bp
3.Pcmv 巨细胞疱疹病毒启动子
4.BGHpA,牛生长因子polyA 5.SV40 猴空泡病毒 SV40pA 猴空泡病毒polyA 6. pUC ori复制起始位点 f1 ori 噬菌体复制位点，能产 生单链DNA，可用于测序
1. 氨苄青霉素抗性， 新霉素抗性。
• 提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。
The principles of plasmid extraction 质粒抽提： 即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分 开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯 净的质粒。 如何去除 RNA 使用 RNase 消化 (抽提中或者抽提后)。 经过 RNase 消化后，RNA 变得比较小了， 其残留对酶切反应几乎没有影响。
如何将质粒与细菌基因组DNA分开
利用 NaOH/SDS 完全裂解细菌，让质粒和细菌基因组 DNA 都从细菌中出来，再利用质粒和基因组 DNA 在变性/复性过 程中的不同表现，将质粒与基因组 DNA 分开。
去除蛋白质及其它杂质
基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是，依据不 同的细菌，不同的培养条件，以及操作时的精细程度等，杂 质的残留量会不同。所以，通常需要使用苯酚做更进一步的 纯化。
pCDNA3.1/myc-His-IFT57重组质粒: 6475bp pCDNA3.1/myc-His：5497bp (讲义上错误) IFT57基因（intraflagellar transport 57，鞭毛内运输蛋 白)：1270bp
酶切位点：BamHI:G^GATCC 920bp
EcoRI : G^AATTC 941bp
The extraction and
endonuclease cleavage of plasmid 质粒的提取和酶切鉴定 huang chunhong
掌握质粒DNA提取的原理与方法
了解DNA限制性核酸内切酶酶切 鉴定原理
质粒为环状双链DNA，它是染色体DNA之外 的单独复制单元。质粒一般存在于细菌细胞中，并 常用于DNA重组，用于外源基因的克隆和表达。
pcDNA3.1/ myc-His A 5.5kb
Insert fragment: 1270bp
750bp
琼脂糖凝胶电泳上样
-
1
2
3
4
每组上2个样品
1：DNA Marker（10 l） 2：提取的质粒DNA （10 l）
3：质粒DNA酶切产物 （20l）
+
Loading Buffer 上样缓冲液 组成 • • • • EDTA 甘油 ……………增大溶液密度 溴酚蓝…………指示剂 二甲苯胺蓝……指示剂
• 溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium
dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴 离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎 片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。 再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。
• 溶液Ⅰ—溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris-Cl(pH8.0)， 10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。 • 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。 • 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰 醋酸 11.5ml，水 28.5ml。
质粒的分类与构成
• 克隆载体；表达载体 • 原核质粒；真核质粒
• 质粒的构成 -复制起始位点
-多克隆位点（含多个内切酶位点，用于外源基因插入） -选择性标记（抗性基因）
T7启动子，比大 肠杆菌RNA聚合 酶启动子强5倍 2. 多克隆位点C端含有myc表位 标签和His6标签。Myc标签和 His6标签与外源蛋白融合表达 ，可以用以亲和层析分离和 western blot
质粒DNA的酶切分析操作 在一个洁净的0.2 ml离心管中混匀下列反应物：
反应物 体积（µl)
bufferMC
质粒DNA
2
15.8( µl)
BamH I
EcoR I BSA
1
1 0.2
混合后37 ℃水浴1h
三 、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％）
线性DNA分子大小 （kb） 5～60 1～20