酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交ppt课件

报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)
的重组质粒的宿主细胞。 最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道 株 具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。 〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特 征性报道基因。 〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳 动物的蛋白结合
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与 已知蛋白质Bait protein的基因构建在同 一个表达载体上，在酵母中表达两者的
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3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白 质之间相互作用的影响 酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋 白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可 以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗 疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾 病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合 酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETAimportin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找 到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相 应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止 RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。
组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传
导、代谢途径等有重要意义
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在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵 母单杂交、酵母三杂交和酵研究 和两种蛋白相互作用的结构和位点。
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酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展
BD-Bait protein融合表达载体上,在酵母中
表达两者的融合蛋白。
如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那 么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激
活结构域就会相互作用，从而激活lacZ
报道基因的表达。所以我们可以通过转
化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白
酵母双杂交酵 母单杂交酵母 三杂交课件
酵母双杂交系统的建立是基于对真核 生物调控转录起始过程的认识。细胞 起始基因转录需要有反式转录
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激活因子的参与
• 反式转录激活因子
结构上是组 件式的， 即这些因子往往由两个或两 个以上相互独立的结构域构成， 其中 有DNA结合结构域(DNA binding domain， 简称为BD)和转录激活结构 域(activation domain， 简称为AD) 。
是否有相互作用。
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这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生 GAL4，又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP，因 此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。 当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时， 功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的 报告基因ADE、 HIS、LACZ、MEL1，从而通过功 能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的 酵母菌株中的AD-LIBRAR酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此
协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着
功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多 新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将因之间的联系，建立基因
• 这两个结合域将它们分开时仍分别具有功 能，但不能激活转录，只有当被分开的两 者通过适当的途径在空间上较为接近时， 才能重新呈现完整的转录因子活性，并可 激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启 动子，使启动子下游基因得到转录。
酵母双杂交
酵母双杂交系统的另一个重要的元件
综上：酵母双杂交系统通过两个杂交
蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基 因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致 步骤为: 1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵 (bait)，将其与DNA结合域融合，构建成 诱饵质粒。 2、将待筛选蛋白母细胞中。 4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和 转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若 能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用 ，则可激活报告基因的转录；反之，则不 能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉 到新的蛋白质。
而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行 检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单 杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、 蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表 达调控。
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原理用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因
子。研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结 构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构 域可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的 活性。在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独 立地发挥作用。 • 据此，我们可将GAL4 的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要 他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激 活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是 利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相 互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质 与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应 则可以通过酵母双杂交进行检测。
• 酵母双杂交系统的应用
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 • 当到的阳性酵母菌株中可以分离得到ADLIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段， 并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因 在生物学功能上的联系。 • 另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基 因之间功能相关的主要方法。