包含体复性
包涵体复性
包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤?1、包涵体的洗涤问题?通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
?包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
?2、如何得到比较纯的包涵体?对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3?mM。
去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
?对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体蛋白的纯化和复性
包涵体蛋白的纯化和复性包涵体蛋白的纯化和复性1．菌体的收集和破碎用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。
沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。
【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。
破碎后的匀浆，4℃、 12000 rpm离心15 min。
分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。
2．包涵体的处理洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
重复一次。
再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。
溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。
12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。
【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）3．目的蛋白的纯化亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。
谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。
蛋白质、包涵体复性
目录一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用二、包涵体变复性三、包涵体洗涤纯化——7~10四、包涵体提出、纯化和复性一、二、包涵体变复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。
基本信息中文名称包涵体变复性复性方法稀释复性原因基因工程菌的表达产率过高包涵体变性破菌洗涤溶解目录1包涵体2包涵体变性3包涵体复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性包涵体：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
包涵体的组成与特性：一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
包涵体表达的有利因素：1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。
破菌：1、机械破碎2、超声破碎3、化学方法破碎分离：1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
2、过滤或萃取方法：洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。
(整理)包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
基因重组蛋白包涵体的复性研究
蛋白质与介质的疏水 性相互结合
rhIFN-γ，rhIFN-β， 重组人粒细胞集落刺激因子rhGC-CSF
离子交换色谱 蛋白质与介质间存在 Papiloma virus(HPV)， E7MS2 fusion protein，
（IEC）
电荷作用力
重组白细胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白
亲和色谱 （AFC）
需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有生物 活性的基因工程蛋白
基因重组蛋白包涵体的复性研究
51％
基因重组蛋白包涵体的复性研究
8.2 包涵体的形成
在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式 沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物
包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各 种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽 然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包 涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高 浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。
• 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长 的一段时间，I就可以慢慢地向N转化
基因重组蛋白包涵体的复性研究
影响复性效率的因素
• 4）氧化还原环境
• 复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形 成S-S的环境→合适的氧化还原环境
• 采用配对的氧化型和还原型巯基物质 • 配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基
基因重组蛋白包涵体的复性研究
包涵体形成的几种可能性
• 研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。 • 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞
内溶解度时沉淀； • 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能
重组蛋白基础知识介绍
一，重组蛋白分类：
1，上清：His上清，His-Sumo上清，GST上清,
2，包涵体复性：His包涵体复性，GST包涵体复性
3，包涵体：His包涵体，GST包涵体
二，重组蛋白缓冲体系：
1，His上清NTA-0+500mM咪唑
2，His-Sumo上清NTA-0+500mM咪唑
3，GST上清1*PBS（包含10mMGST）
4，His 包涵体复性TE缓冲液，PBS缓冲液，1M或2M尿素
5，GST包涵体复性TE缓冲液，PBS缓冲液，1M或2M尿素
6，His包涵体6M盐酸胍，8M尿素,
7，GST包涵体6M盐酸胍，8M尿素
三，各种稀释液配方：
TE缓冲液（10mM Tris 5mM EDTA）
NTA-0 ( Tris,NaCl ,10% 甘油)
四，基础知识介绍：
1，His上清与His-Sumo上清的区别：
His上清是用pET28a载体表达的上清蛋白，上面只有一个His标签，His-Sumo上清是pET28a-Sumo载体表达的上清蛋白，Sumo蛋白上面有His标签。
Sumo是一种分子伴侣，大约18KD，可以与小分子量的蛋白相连接，增加蛋白分子量，增加免疫原性。
2，乳化稀释液
一般来说是重组蛋白用哪种缓冲体系，乳化稀释液就用那种稀释液。
NTA-0可以换成1*PBS缓冲液，His包涵体或GST包涵体缓冲液是6M盐酸胍用3M盐酸胍稀释，His包涵体或GST包涵体缓冲液是8M尿素用4M尿素稀释。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体的复性
外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
包涵体(inclusionbody)表达的蛋白的复性
子家的店里。木子是个听话的孩子，所以她总是在假期里帮妈妈打下手。木子记
缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间 体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采
用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比
例。 包涵体表达的有利因素： 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的 攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的 降解。
因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间
进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白
间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解 度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨 基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显
与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞 内 pH 接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于
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白。如有人在 pH9.0 溶解牛生长激素和牛凝乳蛋 白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在 60mMHCl 中。
这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱 性性的环境中如 pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中
不稳定，一般不要超过 pH1.0。有些蛋白只能用
[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦
![[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦](https://img.taocdn.com/s3/m/b6184610ef06eff9aef8941ea76e58fafbb04554.png)
[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦第八章工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化分子生物学的发展使蛋白质的表达和生产进入到一个新的时代。
大肠杆菌由于遗传背景清晰，容易培养，可以大规模发酵，以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体而成为目前人们克隆和表达外源基因的首选菌株。
但是，在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。
包涵体的形成虽有不少优点，如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解;包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高;包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化;包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离等。
但是，无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质，这通常是一件很困难的事情，而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同，因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。
现有的生物技术研究和产业化过程表明，重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一，是基因工程产品商业化的瓶颈，也是一个世界性难题。
第一节包涵体形成的原因,(什么是包涵体所谓包涵体是指由于表达部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构(如Cys含量高)，如低电荷，无糖基化等，使得重组蛋白质与核酸，周围杂蛋白质(如核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白质ompC、ompF和ompA等)，以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图8-1)。
包涵体一般大小为0.1~3.0 μm，具有很高的密度(约1.3 mg/ml)，无定形，呈非水溶性，只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。
包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的50%以上，它们没有生物学活性，因为蛋白质分子没有形成正确的构象。
有报道表明成熟的分子相比包涵体内蛋白质含有更多的β结构而较少的,结构，也有报道表明包涵体中的肽链已获得与天然蛋白质分子非常接近的空间构象。
包涵体复性方法
包涵体复性方法：一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。
（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。
）1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。
2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。
与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。
复性过程始终发生在溶液中。
蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。
在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。
脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。
包涵体的纯化和复性总结
板块一、大肠杆菌(这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。
）一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制.常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解,同样要做,为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。
因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧.我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右.二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。
我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。
至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心.我们判断的依据只是SDS—PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。
看着没问题，实际上是有毛病的。
关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。
缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。
那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。
甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等.我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的!不要让包涵体这个概念给你误导。
三、关于表达量我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。
我要说都是文章的作者在忽悠.不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。
且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。
在公司的QC部门做的对此应该最有体验,20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。
包涵体变性亲和层析复性方法
包涵体变性及亲和层析复性方法实验材料裂解液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0洗涤液：20 mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 3M 尿素，pH 8.0变性液：20 mM Tris-HCl, 8M 尿素，0.5M NaCl，20mM 咪唑，pH 8.5洗脱液：20 mM Tris-HCl, 8M 尿素，500mM 咪唑，pH 8.5复性液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 M L-Arg, 0.5 mM GSH, 0.05 mM GSSG, 5% 甘油，1% PEG实验方法：1.包涵体的变性：收集菌体，加入裂解液，高压破碎，12000rpm离心30min，沉淀中加入包涵体洗涤液，充分溶解，12000rpm离心30min取沉淀，加入变性液（1g包涵体加入15ml），碾压包涵体，置于室温充分溶解，12000rpm离心30min取上清。
2.包涵体的纯化：上述变性液上样至5 ml Ni柱，用变性液平衡，用pH 4.5的20 mM NaAc缓冲液洗涤三个柱体积，然后用含有55mM, 100mM及500mM咪唑的含8M尿素的洗脱液阶段梯度洗脱，每个梯度至少洗五个柱体积。
3.包涵体的复性：上述洗脱液进行SDS-PAGE鉴定，然后用变性液调节其浓度至0.5 mg/ml左右。
再透析至含有4M尿素的复性液中，10℃透析6 h，然后透析至含有2 M尿素的复性液中，透析8 h；再透析至含有1M尿素的复性液中，透析12h; 最后透析至储存缓冲液(20 mM Tris-HCl. 50 mM NaCl ,20 % 甘油, pH 8.0)中。
5000 rpm 离心10 min, 取上清进行还原胶及非还原胶鉴定，并进行酶学性质检测。
包涵体的纯化和复性总结全
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体复性
包涵体复性
结合液80mm 300mm
Tris: 0.4 0.1 0.1
咪唑：0.1 0.4 1.5
氯化钠： 2 0.5 0.5
尿素：9.6g 2.4g 2.4g
水：补足至20mL 补足至5mL 补足至5mL
1.菌体用裂解液重悬，加入溶菌酶，冰上30min或者时间更长一点。
2.破碎，离心，收集沉淀。
加入包涵体溶解液，10min左右包涵体会溶解。
在冰上进行，可放在摇床上。
3.处理镍柱，放出酒精，水洗2遍，结合液3ml平衡2遍。
4.将包涵体蛋白加入柱子中，结合1小时左右。
5.结合液冲洗柱子。
6.80mm 洗脱蛋白
7.300mm洗脱蛋白，收集2ml洗脱蛋白。
8.准备2个超滤管，分别加入1ml洗脱蛋白液，再加入不含尿素的PBS （可加入EDTA等），离心。
再次加入PBS，离心，收集大约2ml的液体分装保存。
包涵体复性
包涵体复性包涵体复性常见问题分析1.对于尿素和盐酸胍该怎么选择。
尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10m，盐酸胍6-8m。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。
但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
2.怎样洗涤包涵体。
通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6m 盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4m，离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。
3.8m尿素溶解的包涵体溶液应如何保存。
在4度放置半个月，都没什么问题。
在室温放置超过48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些处理bi溶液比较好。
4.包涵体复性有什么原则。
低浓度，平缓梯度，低温。
5.复性时的蛋白浓度是。
一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。
6.复性中蛋白析出是怎么回事。
该怎么处理。
出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。
复性应该采取复性液浓度和ph值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔1个ph或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。
此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。
但是复性的比率应该很低。
若加变性剂尿素可加到2m，盐酸胍可加到1-1.5m；另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油。
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等.蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质,如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起,可以通过洗涤去除大多数杂质,但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris,pH7。
0-8。
5，1mM EDTA中洗涤包涵体.此外可以用温和去垢剂TritonX—100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
同时,因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强,所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50％以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍,主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸.盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体.SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。
另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体,通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等.这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素较盐酸胍慢而弱，溶解度为用尿素溶解具有不电离,呈中性，成（8-10M）70-90%本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6—8M)溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
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分子伴侣亲和色谱介导蛋白质的复性同它在 溶液中的作用一致。即分子伴侣在复性蛋白质时, 为变性的蛋白提供一个中空环状疏水腔,当变性蛋 白质进入空腔后,可部分避免或完全消除变性蛋白 质分子间的相互聚集作用,使蛋白质在疏水环境下 进行“结合-释放-再结合”的循环过程, 直到其恢复 到天然的构象状态。
目前英国剑桥大学的一个研究小组在这一领域 中做得最好。他们合成了几个复杂的固定相体系 用于蛋白质复性,使这些在溶液中无法复性的蛋白 质在柱子上得到了好的复性,并称之为折叠色谱
包含体形成的原因
1. 蛋白质高效表达的结果 在载体系统中采用强的启动子和增强子序列,靶
蛋白质表达分别可占细胞总蛋白的40%～50%， 蛋白质的合成速度太快，肽链来不及折叠形成 正确构象，导致分子间疏水基相互作用聚合而 不溶。
2.宿主内缺乏目标蛋白质正确折叠的辅助因子
对于大肠杆菌,来源于真核细胞的蛋白质是一 种外界刺激因子,在进化过程中细菌细胞还没 有形成与之完全相适应的结构基础和折叠机制, 例如,处于还原环境的细菌胞质不能有效地完 成二硫键蛋白质的氧化折叠;又如,辅助肽链折 叠的分子伴侣和折叠酶的种类和功能不能完全 适应较复杂真核蛋白质的折叠。
直链糊精
存在的问题：
分子伴侣在实际应用中尚存在费用高并 需要与复性蛋白质分离等缺点，目前，分 子伴侣还处于研究阶段，没有真正用于工 业规模的包含体复性。
蛋白质的色谱复性及其纯化
液相色谱是纯化蛋白质的一个必不可少的手 段。其原理是根据待分离物质与色谱固定相之间 作用力的不同而得到分离。利用色谱复性正是利 用了变性的蛋白质在色谱固定相上的吸附作用而 避免了分子间的聚集作用，在吸附-脱附-吸附的 过程中实现了蛋白质的复性。
包含体的复性
贾凌云
基因工程产Байду номын сангаас目前的研发状况
目前基因表达的重组蛋白质已超过4000多种, 其中用E.coli表达的要占90%以上,而这些蛋白 质在E.coli中绝大多数是以包含体形式存在；
用于临床的基因重组药物只占研发药物的约1%。
存在的主要问题
复性效率低：常用的复性方法—稀释和透 析法的复性效率为5-20%；
(Refolding chromatography)
疏水色谱（HIC）
复性机理:
当蛋白质、变性剂和杂蛋白质进入HIC系统后,由 于HIC固定相对变性剂的作用力较弱,而对变性 蛋白质的作用力较强,变性剂首先同变性的蛋白 质分离,并随流动相一同流出色谱柱。又因HIC 固定相能提供较通常方法高出数十乃至数百倍 的能量,在变性蛋白质被HIC固定相吸附的同时 瞬时除去以水合状态附着在蛋白质表面和与固 定相表面接触区域的水分子,而蛋白质的特定的 疏水性氨基酸残基与HIC固定相表面作用以形成 区域立体结构(Micro-domain),接着形成折叠
目前用于蛋白质复性分离的色谱方法：
➢ 体积排阻色谱 ➢ 离子交换色谱 ➢ 亲合色谱 ➢ 疏水色谱
排阻色谱（SEC）
复性机理: 在变性蛋白进入柱顶端时,因有高浓度变性
剂的存在,变性蛋白质分子有一个随机的构象状 态和大的动力学水合半径,不能进入柱的空隙,蛋 白质在柱上不保留。当使用复性的缓冲溶液洗脱 时,因其逐步取代变性剂并使变性剂浓度降低,使 变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高能状态, 这些蛋白质分子就会自发地向热力学稳定的低能 态 — 即蛋白质的天然状态转化,从而使蛋白质 开始复性。此时，局部复性的蛋白质可以进入球
分子伴侣：就是在细胞内催化及维持其他蛋白质 正确构象的一类蛋白质，它参与细胞 内许多蛋白质的折叠、聚合及跨膜运 输，通过瞬时稳定其他蛋白质折叠中 间体，阻止了蛋白质中间体聚集，帮 助其形成正确的构象。
环糊精的分子结构
其复性过程分为两步进行：第一步为捕获阶 段，在变性蛋白质溶液中加入去污剂，去污剂分 子通过疏水相互作用与蛋白质的疏水位点结合形 成复合体，抑制肽链间的相互聚集；第二步剥离 阶段，加入环糊精，由于环糊精分子对去污剂分 子有竞争性吸附作用，去污剂分子被剥离下来， 从而使多肽链在此过程中正确折叠为活性蛋白 质。
离子交换色谱
复性机理：不同于SEC之处在于变性蛋白质与 固定相间有分子间的电荷作用,这种作用力可导 致变性的蛋白吸附于固定相表面,在洗脱过程中 进行吸附—解吸—再吸附的复性。
Hamaker将DEAE纤维素卷成柱状装入色谱 柱中,使用等浓度洗脱, 对重组白细胞分泌抑制 因子进行了复性纯化, 用该法复性的蛋白质浓度 比稀释方法提高了6.4倍, 且46%的蛋白质可以获 得复性,质量回收率为96%, 时间只用了5min.
的内部,开始在液固两相间进行分配,随着时间的推 移,当蛋白质分子的结构变得更加紧密时,蛋白质在 两相中的分配系数会逐步增加。当蛋白质进入柱填 料的孔隙后,其扩散速度减缓,从而限制了蛋白质的 聚集,这样就减少了沉淀的产生。蛋白质分子大,先 从柱子上洗脱下来,变性剂分子质量小,最后流出色 谱柱。故SEC的主要作用不是变性蛋白质与SEC固定 相间的特殊作用力,而是有利于更换变性蛋白质复 性的缓冲溶液,这里当然更不涉及二硫键是否正确 对接的问题。与稀释法比较,该方法可使溶菌酶、 碳酸酐酶和重组白细胞介素等的蛋白质质量回收率 和活性回收率显著提高。
通过以上制备可获得高纯度的包含体(纯度 高于70%)。
1. 用膜透析法或凝胶过滤去除变性剂，也可用 稀释的方法，一般1-20mol/ml的低浓度条件 下，重组蛋白的复性效果较好。
对小分子的多肽，复性效率较高，对大分 子蛋白和二硫键较多的分子，复性很困难。
2. 加入分子伴侣
人工分子伴侣体系(去污剂＋环糊精) 环糊精与直链糊精辅助蛋白质复性
与杂蛋白分离困难，产品成本高。
包含体
包含体是指外源基因在宿主细胞中表达时， 表达的蛋白质不仅不能分泌到细胞外，反而在细 胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1-3.0μm的 固体颗粒-包含体。这些基因表达产物的一级结 构(即氨基酸序列)虽然正确，但其立体结构是错 误的。
由于包含体具有很高的密度(约1.3mg/mL ) 它们在细胞裂解后可通过低速离心收获。
色谱法进行蛋白质复性的优点是:
①在进样后可很快除去变性剂; ②由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显地
减少甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性 剂环境后的分子聚集,从而避免了沉淀的产生, 提高蛋白质复性的质量和活性回收率; ③在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白 分离以达到纯化的目的,使复性和纯化同时进 行; ④便于回收变性剂,以降低废水处理成本。
影响色谱复性的因素
色谱固定相 流动相的组成 变性蛋白质的浓度 蛋白质在柱上的停留时间 流动相的流速、pH、温度
疏水柱的复性分离效果
亲合色谱（AFC）
复性机理：利用配体与目标蛋白质间的特异性亲 和作用,使变性蛋白分子保留在柱的 顶端使其与变性剂分离,而后在洗脱 过程中进行复性的。
按配基类型可分为: 固定化金属亲和色谱 脂质体亲和色谱 分子伴侣亲和色谱
脂质体作为配基对蛋白质复性的原理推测为: 局部变性的蛋白质分子结构类似于融球状态,
中间体(Intermediate),随着流动相的不断变化, 变性 蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再 吸附,并在此过程中逐渐被复性, 形成与天然蛋白质 构象相同的蛋白质并流出色谱柱。在此过程中,因不 同的蛋白质与固定,形成与天然蛋白质构象相同的蛋 白质并流出色谱柱。在此过程中,因不同的蛋白质与 固定相上的作用力强弱不同,复性的目标蛋白质就可 以与大部分杂蛋白进行分离。利用HIC对E.coli 表达 的rhIFN和rhIFNα分别在复性的同时进行了纯化。 rhIFN的GuHCl提取液在40 min内使用一次色谱过程 就可以使其纯度达到85%,活性回收率为稀释法的23倍.
且具有与天然蛋白质相类似的二级结构,此时蛋 白质分子仍然具有强的疏水表面,故可同脂质体 的脂质双层作用以帮助蛋白质进行复性。 例如：用脂质体色谱对失活的碳酸酐脱氢酶进行 复性,其活性回收率为83%,如果使用没有脂质体 的柱子,则回收率便降至58%;如果直接采用稀释 50倍的方法,其活性回收率为52%。
AC
A 聚集：是由暴露在溶剂中的疏水区相互作用的过
程，速度快，一般在30秒内完成。 复性：分子链内自我折叠的过程，相对缓慢，完
全复性大约需10分钟的时间。
实现蛋白质重折叠的途径
溶菌酶处理→高压匀浆破碎 → 低速离心 包含体沉淀需用去污剂(Triton X-100 或脱
氧胆酸钠) 和低浓度变性剂(如2 mol/L 尿素或盐 酸胍等) 洗涤以除去脂类和膜蛋白。
环糊精的疏水性空腔能够结合变性蛋白质多 肽链的疏水性位点，可以抑制其相互聚集失活， 从而促进肽链正确折叠为活性蛋白质。
直链糊精基本上能够模拟环糊精在辅助蛋白 质复性方面的作用，而且具有这样一些优点：直 链糊精的螺旋结构形成一个疏水性空管，可以结 合更多的蛋白质分子；在水中溶解度较高，有利 于提高复性酶浓度和实验操作；价格比环糊精便 宜，实际应用前景较好。
如何使包含体复性？
1，先用化学试剂将包含体溶解成为伸展的蛋白 质一级结构；常用变性剂尿素、盐酸胍以及去污剂
SDS等，可分别破坏蛋白质的高级结构及肽链之间的疏 水作用，使其变成松散的水溶状态。
2，使蛋白质的一级结构在合适的条件下重新折 叠成正确的构象。
蛋白质的重折叠机制
U I1 I2 ···IZ IC IN N