微生物代谢人工调节

产 谷 氨 酸 棒 杆 菌 的 谷 氨 酸 合 成 途 径
以废糖蜜为原料的谷氨酸发酵中，因生物素浓 度过高遇到了困难，通过使用青霉素得以克服。这 是因青霉素阻碍细菌生长和细胞壁合成，有利于谷 氨酸的生成和分泌。 表面活性剂具有类似青霉素的作用。其成分中 ，硬脂酸、脂肪酸最有效。这些酸类影响细胞膜的 脂质合成，并改变细胞膜的脂肪酸类组成，从而增 加对谷氨酸的透性。 缺陷油酸型变异株和缺陷甘油型变异株，即使 在生物素丰富的培养基中,在控制这些物质的浓度下 ，也能积累大量谷氨酸。目前,以醋酸为原料的发酵 法制造已建立。发酵中，生物素的影响同样存在。 醋酸是异柠檬酸分解酶的诱导物，并且，醋酸能代 替生物素的部分作用。因此，必须把生物素的浓度 控制得更低。
（图1）对于直线式代谢途径 ，选育末端代谢产物营养缺 陷型的突变株只能积累中间 代谢产物。如末端产物E对途 径第一个酶有反馈阻遏或反 馈抑制，而菌株失去了将C转 化成D的力，是E的营养缺陷 型。假如在培养基中限量添E ，菌体得以生长，中间产物C 能够大量积累。 （图2）对于分支代谢途径。 分支途径因E和G对途径第一 个酶有协同反馈控制，而突 变株失去了将C转变成D的能 力，产物E无法正常生成, 从 而解除了E和G的协同反馈控 制。若培养基中限量补充E， 由于末端产物G对C到F反应的 控制，就会造成中间产物C的 积累。
2）通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透 性
应用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型菌株， 在限量补充油酸的培养基中，因为油酸是细 菌细胞膜磷脂中重要的脂肪酸，油酸缺陷型 突变株不能合成油酸而使细胞膜缺损, 使细 胞膜发生渗漏而提高谷氨酸的产量。
3）加入表面活性剂
将脂类从细胞壁中溶解，使细胞壁疏松， 通透性增加
4）控制Mn2+ 、Zn2+的浓度 控制Mn
氯霉素生物合成途径和反馈阻抑情况
（四）提高产酶的方法
添加诱导物
大多数异化酶属诱导酶。强有力的诱导 物往往不是该酶的底物，而是其类似物。例 如，对大肠杆菌的乳糖酶的诱导来说，异丙 基D-硫半乳糖比乳糖强。
增加遗传子数量
在大肠杆菌，能使某种噬菌体感染，并 重组该菌染色体中某种酶的产生有关遗传子 ，然后通过诱导使之复制增殖。
肌苷酸 产氨短杆菌的磷 酸酶活性很微弱，该 菌的缺陷腺嘌呤型变 异株和缺陷鸟嘌呤型 变异株，能从糖和氨 分别产生肌苷酸和黄 苷酸各20毫克/毫升 以上。发酵中，必须 控制锰离子浓度，其 合适浓度是10微克/ 升。
肌苷酸合成途径
（三）抗菌素
青霉素
苯醋酸能提高苄青霉素（ 即青霉素G）的产量。 青霉素合成受赖氨酸的阻 碍。它们的共同前体是α-氨 基戊二酸。赖氨酸对合成α氨基戊二酸的酶有反馈阻遏或 抑制作用，当赖氨酸达到一定 浓度后，便阻止α-氨基戊二 酸的合成，也阻止了青霉素的 合成。选育赖氨酸营养缺陷型 ，就可解除赖氨酸反馈调节， 同时，也切断了通向赖氨酸的 代谢支路，使大量生成的α氨基戊二酸用于青霉素的合成 。
发酵与分离过程耦合
反馈调节的启动因素就是超过菌体 正常需求量的末端代谢产物，也就是说 ，只有末端代谢产物的浓度超过一定值 后，菌体的反馈调节机制才会发挥作用 。如果我们在发酵的同时就将末端代谢 产物不断地移走，使发酵体系中末端代 谢产物的浓度始终处于较低的水平，那 么菌体内代谢途径将始终畅通无阻。 与发酵过程耦合的分离手段很多, 有膜 分离、双水相萃取。
组成型突变菌株
在发酵工业中，要选择到一种廉价、 高效的诱导物是不容易的，分批限量加入 诱导物在工艺上也多不便，更为有效的方 法是改变菌株的遗传特性，除去对诱导物 的需要，即选育组成型突变株。突变可以 除去酶合成时对诱导物的依赖。例如组成 酶突变抹在没有诱导底物存在时，也能照 常合成诱导酶。在生产中使用组成酶突变 株时，可不必在发酵液中添加诱导物，而 且它们产生的诱导酶活性也比原菌株强， 其优点是显而易见的。
图3
图4
图5
抗反馈控制突变株
抗反馈控制突变株就是指对反馈抑制 不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼而有之 的菌株。在这类菌株中，反馈调节已经解 除，所以能大量积累末端代谢产物。 抗反馈抑制突变株可以从结构类似物 抗性突变株和营养缺陷型回复突变株中获 得。
以氨基酸代谢为例： 正常情况下，代谢末端产物氨基酸 A是菌体蛋白的必需组成成分，它能 反馈阻遏或抑制合成它的有关酶。它 的结构类似物A’在空间结构上与之 相似，也能象A一样与原阻遏物或调 节酶的调节亚基结合，从而发生阻遏 或抑制作用。但A’不能正常参与蛋 白质的合成，或只能合成无活性的蛋 白质。
赖氨酸
该菌的缺陷高丝氨酸型变异株,缺乏催化门冬 氨酸β-半醛为高丝氨酸的酶。因此代谢趋向于赖 氨酸的合成。门冬氨酸活化酶受赖氨酸和苏氨酸的 协同抑制。由于控制了高丝氨酸的浓度，因此，苏 氨酸的生成有限，并且细菌生长达到一定程度,进 入赖氨酸产生期，培养基中苏氨酸已消失，即使大 量赖氨酸存在，门冬氨酸活化酶活性不再受抑制。 S-（2 -氨基乙基）-L-半胱氨酸是赖氨酸的硫 类似物，它对细菌表现出微弱的毒性。在苏氨酸的 存在下，其毒性显著加强，而在赖氨酸存在下，得 到减弱。在苏氨酸存在下选育出来的耐类似物型变 异株，积累大量赖氨酸。该变异株的门冬氨酸活化 酶不再受赖氨酸和苏氨酸的协同抑制。
异常汉逊氏酵母的色氨酸合成 途径和反馈阻抑情况
异亮氨酸
添加中间代谢物的前体，以绕过反馈 阻抑的方法。产氨基酸节杆菌的葡萄糖培 养基中，加入α-氨基丁酸。异亮氨酸的 前体α-乙酰羟基丁酸是由α-酮丁酸同活 性乙醛结合形成的。在正常发酵中，α酮丁酸来自苏氨酸，而这一反应被异亮氨 酸所阻抑。但在该发酵中, α-酮丁酸由 α-氨基丁酸转化过来，因此，其供应不 受影响。 实验证明，使用α-氨基丁酸比 α-酮丁酸更有效。
干扰细胞膜、细胞壁的合成。
二、人为控制在发酵生 产中的应用
（一）氨基酸 （二）肌苷和肌苷酸 （三）抗菌素 （四）提高产酶的方法
（一）氨基酸
谷氨酸
谷氨酸发酵法制造是通过菌种的筛选 和发酵条件的选择来完成的。例如：利用 产谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸。该菌在生长 过程中需要生物素，但在谷氨酸发酵中， 必须把它控制在“次合适”浓度。这不仅 为限制生长，而且使整个代谢向有利于谷 氨酸合成和积累方面转变。在生物素浓度 “次合适”情况下，不会因糖酵解过度而 引起的乳酸的过剩积累。
青霉素生物合成途径 和反馈阻抑情况
头胞霉素C
蛋氨酸促进 该抗菌素的产生 。蛋氨酸反馈阻 抑了从半胱氨酸 到蛋氨酸的合成 途径，从而使更 多的半胱氨酸转 向头胞霉素C 的 合成。 头胞霉素C生物合成途径 和反馈阻抑情况
氯霉素
苯丙氨酸和酩氨酸促进氯霉素的 产生。这是因为这些氨基酸反馈阻抑 了从预苯酸到苯丙酮酸和酚丙酮酸的 合成，从而使更多的预苯酸转向氯霉 素的合成的缘故。
当结构类似物A’达到一定浓度后，一 方面A’能起反馈控制作用，阻止A的正常合 成，另一方面A’又无法代替A参与正常蛋白 质的合成，从而造成正常的细胞因缺乏A而 饥饿死亡。 但如果突变株解除了反馈控制，即末端 产物氨基酸A无法与原阻遏物或调节亚基结 合，那么A’也就无法起反馈调节作用，A’ 的毒害作用就表现不出来。我们说该菌株对 A’有抗性而得以生存下来。根据以上原理 ，只要选取结构类似物抗性突变株，就有可 能得到解除了反馈调节的突变株。 结构类似物抗性菌株不一定都是解除反 馈调节的菌株。
微生物代谢—— 微生物代谢—— 人工控制
一、人工控制
简介
代谢的人工控制：人为地打破微生 代谢的人工控制 物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝 着人们希望的方向进行，这就是所谓代 谢的人工控制。代谢的人为控制，归根 结底，是如何设法绕过、解除反馈阻抑 而使代谢偏离正常途径，借以大量积累 用普通方法不能积累的代谢产物。 目前，人工控制代谢主要是通过遗 传学和生物化学方法来实现的。
产谷氨酸棒杆菌的赖氨酸合成 途径和反馈阻抑情况
色氨酸
以发酵法从葡萄糖和简单氮源制造色氨 酸的企图还没有成功。目前，研究集中在添 加前体的方法上。 异常汉逊氏酵母在普通培养基中积累 100毫克/升的色氨酸。该菌在色氨酸合成中 经过氨茴酸。添加氨茴酸，以绕过反馈阻抑 ，可能增高色氨酸的积累。这种菌株，必须 是： 1.分解氨茴酸的活性弱； 2.合成系各阶段酶不受氨茴酸的阻抑； 3.色氨酸分解能力弱。
（二）生物化学方面
添加前体 控制诱导剂 发酵与分离过程耦合 控制细胞膜的通透性 培养基成分和浓度控制
添加前体
不通过遗传学方法也 能改变菌株的调节机制， 采取添加前体绕过反馈调 节点是一种有效的方法， 能使某种代谢产物大量积 累。如图，在发酵培养基中添加C，可以大 量积累D。其原因是D的前体C来自外源，并 不会因为D的积累而有很大的波动。由于F 对从C到E 的反应有反馈调节，所以，只有 少部分的C 用于合成F，大部分外源的C用 于合成D。
控制细胞膜的通透性
细胞内代谢产物常以较高浓度积累 在细胞内，并反馈控制它的进一步合成。 采用生理学方法，可以改变细胞膜通透性 ，使细胞内代谢产物迅速渗透到细胞外， 消除反馈控制，有利于提高发酵产量。
1）通过生理学手段控制细胞膜渗透性
生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧 化酶的辅基，该酶催化乙酰CoA的羧化生成 丙二酸单酰CoA，进而合成细胞膜磷脂的主 要成分脂肪酸。因此，只要控制生物素的含 量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的 通透性，影响到代谢产物的分泌。 当生物素含量较高时，添加适量的青霉 素也有提高谷氨酸产量的效果。其原因是青 霉素可抑制细菌细胞壁肽聚糖合成中转肽酶 活性，结果引起其结构中肽桥间无法交联， 造成细胞壁缺损，这有利于代谢产物渗漏到 胞外。
（一）遗传学方面
通过改变微生物遗传物质可以从 根本上打破微生物原有的代谢控制机 制，具体包括应用：
营养缺陷型突变株、 抗反馈调节的突变株、 渗漏突变菌株、 抗分解代谢突变株 组成型突变菌株。
营养缺陷型变异株 变异株失去了合成代谢中合 成某一或更多阶段代谢产物的能力 ，在供给所缺陷营养物的情况下， 才能生长。但这些物质往往起反馈 阻抑作用，因此供给的营养物的浓 度必须控制在反馈阻抑有效浓度以 下，这样才有可能随着微生物的生 长积累在缺陷部位直接前面的物质 。这是降低有关效应物的，它不会 产生过量的末端产物，因而可以避开反馈调 节。但它又能合成微量的末端产物，用来进 行生物合成。这样在培养这类突变体时，可 不必在培养基中添加相应的物质，就能积累 所需的产物了。