电化学发光检测技术原理
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..
失Leabharlann .+H+还原
失
e-
电 极
激发态Ru(bpy)32+
基态Ru(bpy)32+
+
CH3CH2CH2-N-C-CH2CH3 H 三丙胺自由基 CH2CH2CH3 氧化 CH3CH2CH2-N-H + CH3CH2CHO CH2CH2CH3
丙醛 二丙胺
电化学发光免疫检测原理--固相载体
独特的磁性微粒作为固相载体
TPA TRIPROPYLAMINE
电化学发光免疫检测原理—竞争法检测原理
eagent Reagent
sipper
1.加入R1- [Ru(bpy)3]2+标记的抗体 2.加入待测样本，温育9min，形成抗原抗体 复合物。3.加入R2 -生物素标记的与样本同源的抗体。 4.,加入M-亲和素包被的磁微粒；温 育9min。未与待测抗原结合的钌标 记物通过R2结合到磁微粒上 5.反应复合物被吸入测量室进行磁 性分离及其电化学发光测量。
美国FT4项目20个不同批号的的病人结果分布
mIU/ml
pMol/l
37
电化学发光免疫检测原理—线性范围
宽广的线性范围
光子数范围:0-10,000,000(1亿)
电化学发光免疫检测原理—宽线性及灵敏度
超宽的线性范围及检测灵敏度
电化学发光免疫检测原理－简单的试剂管理
多模块通用试剂
E 170,e411,e601,e602
电化学发光免疫检测原理—桥联法检测原理
桥联法（Bridging Principle） 双抗原夹心测定抗体 测定成正比： 信号低 = 浓度低 信号高 = 浓度高
理论基础： 单位IgG分子具有2个抗原结合位点
二聚体分泌型IgA具有4个抗原结合位点
五聚体IgM可有10个抗原结合位点
检测相应的IgG和IgM抗体总量。如HBcAb
二维条形码自动输入全部信息 试剂联体包 成分独立 稳定好 无需配制，即开即用 自动开闭试剂瓶盖，有效地防止
挥发等
主要内容
标记免疫技术的发展
电化学发光检测原理
电化学发光的技术特点
校准概念及溯源性 校准报警分析 常见数据报警分析 试剂特性解读
电化学发光免疫检测原理—竞争法检测原理
COMPETITIVE PRINCIPLE
FIRST REACTION
竞争法 测定小分子抗原
SECOND REACTION
LIGHT REACTION
SIGNAL (LIGHT)
测定成反比： 信号低 = 浓度高 信号高 = 浓度低
TPA
MAGNETIC FORCE & ELECTRICAL POTENTIAL
•缺点
–传统的微板吸附包被技术 –均一性差、 重复性差 –批量检测不能实现全自动 –每次检测需要做定标曲线，
‟ 灵敏度较高
‟ 成本较低 ‟ 荧光检测信号
‟ 操作简便
浪费成本
样本的前处理技术操作过程完全同ELISA方法
标记免疫技术的发展－酶荧光免疫测定法(MEIA)
• • • • 标记物： ALP 碱性磷酸酶 底物：MUP（4甲基伞形酮酰磷酸 ） 激发物：光 最终检测信号：荧光强度 – 美国Abbott AXSYM
– 美国BeckmanCoulter Access,Dxi800
标记免疫技术的发展－直接化学发光(CLIA) „ „ „ „ 标记物：吖啶酯,吖啶酯衍生物 发光底物：无需底物,标记物直接发光 激发物：特定的化学环境 最终检测信号：可见光强度
• 代表产品：
– 德国SIEMENS Centaur XP
sipper
1.加入R1-生物素结合的抗体 2.加入R2- [Ru(bpy)3]2+标记的的抗体 3.加入待测样本，温育9min，形成双抗夹 心复合物
4.加入M-亲和素包被的磁微粒, 温育9min， 钌标记物通过待测样本和亲和素生物素 连接到磁微粒上。
5.反应复合物被吸入测量室进行磁 性分离及其电化学发光测量。
– 美国Abbott I2000
标记免疫技术的发展－电化学发光(ECLIA) „ „ „ „ 标记物：三联吡啶钌 发光底物：三丙胺 激发物：直流电场 最终检测信号：可见光强度
• 代表产品：
–罗氏公司 e411,E170,e601,e602
主要内容
标记免疫技术的发展
电化学发光检测原理
电化学发光的技术特点
–包被均一性不足（精密度） –检测技术多为颜色反应（特异性和灵敏度） –反应时间不一致,造成结果的偏差(特别在手 工操作时)
–灵敏度较高 –试剂稳定 –较快的速度 –无污染
标记免疫技术的发展－时间分辨荧光免疫(TRFIA)
„ 优势
标记物：铕(Eu3+)、钐(Sm3+)等镧系元素 底物: 镧系元素螯合物
直径2.8um 表面的凸凹使包被面积放大 悬浮于反应体系中，形成均一稳 定的液相,大大提高反应效能
磁性微珠易于通过磁场磁性吸引
和分离
显微镜下的磁微粒
电化学发光免疫检测原理--链霉亲和素和生物素技术
专利的链霉亲和素－生物素系统
SA
链霉亲和素 Streptoavidin
+
B
B
B
B
生物素 生物素 生物素 生物素 Biotin Biotin Biotin Biotin
校准概念及溯源性 校准报警分析 常见数据报警分析 试剂特性解读
检测菜单介绍
电化学发光免疫检测原理-名称的由来
ELECTRO CHEMI LUMINESCENCE I MMUNO ASSAY
电 化学 发光 免疫 分析
电化学发光免疫检测原理-技术特点
电化学发光免疫测定系统
Elecsys®
电化学发光
磁性微粒子固相载体 链霉亲和素-生物素间接包被技术
Elecsys Principle
电化学发光检测原理及要点解读
主要内容
标记免疫技术的发展
电化学发光检测原理
电化学发光的技术特点
校准概念及溯源性 校准报警分析 常见数据报警分析 试剂特性解读
检测菜单介绍
标记免疫技术的发展
电化学发光
放免
酶免 荧光免疫 化学发光
1960‘S
1970~80‘S
2000‘S
ANTIGEN BIOTINYLATED ANTIGEN
ECL
CONCENTRATION
检测仅一个结合位点的抗原等 如FT3，E2，HBcAb等。
RUTHENIUM LABELLED ANTIBODY STREPTAVIDIN-COATED MICROPARTICLE
TPA TRIPROPYLAMINE
SIGNAL (LIGHT)
TPA
MAGNETIC FORCE & ELECTRICAL POTENTIAL
ECL
CONCENTRATION
检测有多个结合位点的抗原
如TSH，HCG，HBsAg，AFP等
ANTIGEN BIOTINYLATED ANTIBODY
RUTHENIUM LABELLED ANTIBODY STREPTAVIDIN-COATED MICROPARTICLE
• 代表产品： – 法国bioMé rieux VIDAS
标记免疫技术的发展－酶促化学发光免疫(CLIA) „ „ „ „ 标记物：HRP 辣根过氧化物酶/ALP 碱性磷酸酶 发光底物：鲁米洛、金刚烷 激发物：特定的化学环境 最终检测信号：可见光强度
• 代表产品：
– 美国J&J Ortho Vitros Eci
1.使用清洗液(Clean Cell)清洁 测量室 2.移入磁铁,并使用TPA清洁测 量室活化电极 3.反应复合物随TPA一起吸入 测量室, 磁微粒被吸附 未结合到固相的游离标记 物被冲走 4.工作电极加电压, 5.电极表面反应后发出光子 ,同时PMT检测光子信号 6.移开磁铁，TPA冲走所有 反应物。 7.使用清洗液(Cleancell)清洁测 量室。
三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+ + NHS (N羟基琥珀酰胺酯)
电化学发光免疫检测原理--电化学发光的反应过程
电极表面的电化学发光反应
发光标记物:
三联吡啶钌 Ru(bpy) 32+ 发光底物: 三丙胺(TPA) 电化学发光启动条件: 直流电场 反应产物: 三丙胺自由基(TPA*) + 620nm的光子
1200 900 600 300 0
直 流 电 场 1.5v 电 压 启 动
0.2-0.6秒达到发光峰值
可控 迅速 放大
电化学发光免疫检测原理—稳定的试剂
稳定的试剂
电化学发光免疫检测原理—优异的结果稳定性
mIU/ml
2010.1-2014.9 全球客户端FSH 中位值变化
%
%
2010.1和2014.9 全球客户端FSH病人结果分布
检测系统
电化学发光免疫检测原理--电化学发光
专利的电化学发光技术
标记物：三联吡啶 Ru(bpy) 32+
递电子体：三丙胺 TPA
反应启动方式: 直流电场
电化学发光免疫检测原理--标记物
里程碑式的标记物：三联吡啶钌
水溶性，分子量小 结构稳定，免疫损伤小,易于标记 应用广泛（激素，DNA等） 与三丙胺(Tripropylamine,TPA) 共同构成电化学发光系统
电化学发光免疫检测原理—夹心法检测原理
SANDWICH PRINCIPLE
FIRST IMMUNOLOGICAL REACTION
夹心法 测定大分子抗原
SERUM CONSTITUENTS
SECOND REACTION
测定成正比： 信号低 = 浓度低 信号高 = 浓度高
LIGHT REACTION
亲和素 磁性颗粒
B
生物素 抗体
ECL检测原理 ElectroChemiLuminescence (ECL)
结合 Ruthenium
转移至 电极;标 施加电压 结合 记后免疫 启动化学 电化学发光技术 磁珠 复合物与 发光反应 游离组分 分离
信号检测
e analyzer performance
ECL检测原理
反应特点: 迅速,可控,循环发光
三联吡啶钌
“催化” 三丙胺 发出可见光
电化学发光免疫检测原理—电化学发光的反应过程
失
CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3 三丙胺 CH2CH2CH3 Ru(bpy)33+ - e-
e-
阳离子三丙胺自由基
电极
CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3 CH2CH2CH3
主要内容
标记免疫技术的发展
电化学发光检测原理
电化学发光的技术特点
校准概念及溯源性 校准报警分析 常见数据报警分析 试剂特性解读
检测菜单介绍
电化学发光免疫检测原理—发光及检测系统
ECL intensity (counts)
applied voltage [mV]
1500
发 光 光 子 数
350,000 300,000 250,000 200,000 150,000 100,000 50,000 0 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 Time [sec.]
抗体
免疫复合物的形成
第一抗体标记生物 素（与微磁珠结合）
抗原
第二抗体标记 Ruthenium（产生光信 号）
生物素
Ruthenium
两种抗体皆能与靶抗 原特异性结合
免疫复合物
抗体
Source: Roche Diagnostics Research and Development
电化学发光免疫检测原理—测量室中的反应
1，抗体技术的革命，从使用多克隆抗体向使用单克隆抗体转变 2，从手工操作向全自动分析仪的转变 3，从液相放射免疫技术向均相和固相免疫分析技术的转变
标记免疫技术的发展－放射免疫测定法(RIA) 标记物: 碘125
• 优点
–分子量小,免疫损耗小 –简便、灵敏、特异 –可自行设计试剂盒 –应用范围广
底物: 无需底物
=
B B SA B B
电化学发光免疫检测原理—链霉亲和素和生物素技术
链霉亲和素----生物素包被技术
Streptoavidin,SA Biotin，B
适用于包被各种化合物，如多肽、脂多糖。
SA均匀牢固地包被在磁性微粒上
SA
亲和素 磁性颗粒
B衍生物结合的抗原或抗体与标本进行液相反应
B
生物素 抗体
SA
电极
TPA
光电倍增管
TPA TPA
电极
TPA
工作电极
磁铁
电化学发光免疫检测原理—测量室的结构
测量室组成和结构
流动测量室 可升降的磁性分离系统 彻底的清洗系统 高度自动化
电化学发光免疫检测原理—分析类型
夹心法
桥联法
竞争法
电化学发光免疫检测原理—夹心法检测原理
Reagent Reagent
• 缺点 半衰期短，试剂货架期短 标记物不稳定 每次需做标准曲线 反应时间长，不易自动化检测 使用放射性核素，需要一定防护
标记免疫技术的发展－酶联免疫测定法(ELISA)
标记物: HRP 辣根过氧化物酶/ALP 碱性磷酸酶
• 优势
底物:TMB四甲基联苯胺/对硝基苯磷酸酯P-NPP • 缺点
–包被表面积小（灵敏度和速度）
失Leabharlann .+H+还原
失
e-
电 极
激发态Ru(bpy)32+
基态Ru(bpy)32+
+
CH3CH2CH2-N-C-CH2CH3 H 三丙胺自由基 CH2CH2CH3 氧化 CH3CH2CH2-N-H + CH3CH2CHO CH2CH2CH3
丙醛 二丙胺
电化学发光免疫检测原理--固相载体
独特的磁性微粒作为固相载体
TPA TRIPROPYLAMINE
电化学发光免疫检测原理—竞争法检测原理
eagent Reagent
sipper
1.加入R1- [Ru(bpy)3]2+标记的抗体 2.加入待测样本，温育9min，形成抗原抗体 复合物。3.加入R2 -生物素标记的与样本同源的抗体。 4.,加入M-亲和素包被的磁微粒；温 育9min。未与待测抗原结合的钌标 记物通过R2结合到磁微粒上 5.反应复合物被吸入测量室进行磁 性分离及其电化学发光测量。
美国FT4项目20个不同批号的的病人结果分布
mIU/ml
pMol/l
37
电化学发光免疫检测原理—线性范围
宽广的线性范围
光子数范围:0-10,000,000(1亿)
电化学发光免疫检测原理—宽线性及灵敏度
超宽的线性范围及检测灵敏度
电化学发光免疫检测原理－简单的试剂管理
多模块通用试剂
E 170,e411,e601,e602
电化学发光免疫检测原理—桥联法检测原理
桥联法（Bridging Principle） 双抗原夹心测定抗体 测定成正比： 信号低 = 浓度低 信号高 = 浓度高
理论基础： 单位IgG分子具有2个抗原结合位点
二聚体分泌型IgA具有4个抗原结合位点
五聚体IgM可有10个抗原结合位点
检测相应的IgG和IgM抗体总量。如HBcAb
二维条形码自动输入全部信息 试剂联体包 成分独立 稳定好 无需配制，即开即用 自动开闭试剂瓶盖，有效地防止
挥发等
主要内容
标记免疫技术的发展
电化学发光检测原理
电化学发光的技术特点
校准概念及溯源性 校准报警分析 常见数据报警分析 试剂特性解读
电化学发光免疫检测原理—竞争法检测原理
COMPETITIVE PRINCIPLE
FIRST REACTION
竞争法 测定小分子抗原
SECOND REACTION
LIGHT REACTION
SIGNAL (LIGHT)
测定成反比： 信号低 = 浓度高 信号高 = 浓度低
TPA
MAGNETIC FORCE & ELECTRICAL POTENTIAL
•缺点
–传统的微板吸附包被技术 –均一性差、 重复性差 –批量检测不能实现全自动 –每次检测需要做定标曲线，
‟ 灵敏度较高
‟ 成本较低 ‟ 荧光检测信号
‟ 操作简便
浪费成本
样本的前处理技术操作过程完全同ELISA方法
标记免疫技术的发展－酶荧光免疫测定法(MEIA)
• • • • 标记物： ALP 碱性磷酸酶 底物：MUP（4甲基伞形酮酰磷酸 ） 激发物：光 最终检测信号：荧光强度 – 美国Abbott AXSYM
– 美国BeckmanCoulter Access,Dxi800
标记免疫技术的发展－直接化学发光(CLIA) „ „ „ „ 标记物：吖啶酯,吖啶酯衍生物 发光底物：无需底物,标记物直接发光 激发物：特定的化学环境 最终检测信号：可见光强度
• 代表产品：
– 德国SIEMENS Centaur XP
sipper
1.加入R1-生物素结合的抗体 2.加入R2- [Ru(bpy)3]2+标记的的抗体 3.加入待测样本，温育9min，形成双抗夹 心复合物
4.加入M-亲和素包被的磁微粒, 温育9min， 钌标记物通过待测样本和亲和素生物素 连接到磁微粒上。
5.反应复合物被吸入测量室进行磁 性分离及其电化学发光测量。
– 美国Abbott I2000
标记免疫技术的发展－电化学发光(ECLIA) „ „ „ „ 标记物：三联吡啶钌 发光底物：三丙胺 激发物：直流电场 最终检测信号：可见光强度
• 代表产品：
–罗氏公司 e411,E170,e601,e602
主要内容
标记免疫技术的发展
电化学发光检测原理
电化学发光的技术特点
–包被均一性不足（精密度） –检测技术多为颜色反应（特异性和灵敏度） –反应时间不一致,造成结果的偏差(特别在手 工操作时)
–灵敏度较高 –试剂稳定 –较快的速度 –无污染
标记免疫技术的发展－时间分辨荧光免疫(TRFIA)
„ 优势
标记物：铕(Eu3+)、钐(Sm3+)等镧系元素 底物: 镧系元素螯合物
直径2.8um 表面的凸凹使包被面积放大 悬浮于反应体系中，形成均一稳 定的液相,大大提高反应效能
磁性微珠易于通过磁场磁性吸引
和分离
显微镜下的磁微粒
电化学发光免疫检测原理--链霉亲和素和生物素技术
专利的链霉亲和素－生物素系统
SA
链霉亲和素 Streptoavidin
+
B
B
B
B
生物素 生物素 生物素 生物素 Biotin Biotin Biotin Biotin
校准概念及溯源性 校准报警分析 常见数据报警分析 试剂特性解读
检测菜单介绍
电化学发光免疫检测原理-名称的由来
ELECTRO CHEMI LUMINESCENCE I MMUNO ASSAY
电 化学 发光 免疫 分析
电化学发光免疫检测原理-技术特点
电化学发光免疫测定系统
Elecsys®
电化学发光
磁性微粒子固相载体 链霉亲和素-生物素间接包被技术
Elecsys Principle
电化学发光检测原理及要点解读
主要内容
标记免疫技术的发展
电化学发光检测原理
电化学发光的技术特点
校准概念及溯源性 校准报警分析 常见数据报警分析 试剂特性解读
检测菜单介绍
标记免疫技术的发展
电化学发光
放免
酶免 荧光免疫 化学发光
1960‘S
1970~80‘S
2000‘S
ANTIGEN BIOTINYLATED ANTIGEN
ECL
CONCENTRATION
检测仅一个结合位点的抗原等 如FT3，E2，HBcAb等。
RUTHENIUM LABELLED ANTIBODY STREPTAVIDIN-COATED MICROPARTICLE
TPA TRIPROPYLAMINE
SIGNAL (LIGHT)
TPA
MAGNETIC FORCE & ELECTRICAL POTENTIAL
ECL
CONCENTRATION
检测有多个结合位点的抗原
如TSH，HCG，HBsAg，AFP等
ANTIGEN BIOTINYLATED ANTIBODY
RUTHENIUM LABELLED ANTIBODY STREPTAVIDIN-COATED MICROPARTICLE
• 代表产品： – 法国bioMé rieux VIDAS
标记免疫技术的发展－酶促化学发光免疫(CLIA) „ „ „ „ 标记物：HRP 辣根过氧化物酶/ALP 碱性磷酸酶 发光底物：鲁米洛、金刚烷 激发物：特定的化学环境 最终检测信号：可见光强度
• 代表产品：
– 美国J&J Ortho Vitros Eci
1.使用清洗液(Clean Cell)清洁 测量室 2.移入磁铁,并使用TPA清洁测 量室活化电极 3.反应复合物随TPA一起吸入 测量室, 磁微粒被吸附 未结合到固相的游离标记 物被冲走 4.工作电极加电压, 5.电极表面反应后发出光子 ,同时PMT检测光子信号 6.移开磁铁，TPA冲走所有 反应物。 7.使用清洗液(Cleancell)清洁测 量室。
三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+ + NHS (N羟基琥珀酰胺酯)
电化学发光免疫检测原理--电化学发光的反应过程
电极表面的电化学发光反应
发光标记物:
三联吡啶钌 Ru(bpy) 32+ 发光底物: 三丙胺(TPA) 电化学发光启动条件: 直流电场 反应产物: 三丙胺自由基(TPA*) + 620nm的光子
1200 900 600 300 0
直 流 电 场 1.5v 电 压 启 动
0.2-0.6秒达到发光峰值
可控 迅速 放大
电化学发光免疫检测原理—稳定的试剂
稳定的试剂
电化学发光免疫检测原理—优异的结果稳定性
mIU/ml
2010.1-2014.9 全球客户端FSH 中位值变化
%
%
2010.1和2014.9 全球客户端FSH病人结果分布
检测系统
电化学发光免疫检测原理--电化学发光
专利的电化学发光技术
标记物：三联吡啶 Ru(bpy) 32+
递电子体：三丙胺 TPA
反应启动方式: 直流电场
电化学发光免疫检测原理--标记物
里程碑式的标记物：三联吡啶钌
水溶性，分子量小 结构稳定，免疫损伤小,易于标记 应用广泛（激素，DNA等） 与三丙胺(Tripropylamine,TPA) 共同构成电化学发光系统
电化学发光免疫检测原理—夹心法检测原理
SANDWICH PRINCIPLE
FIRST IMMUNOLOGICAL REACTION
夹心法 测定大分子抗原
SERUM CONSTITUENTS
SECOND REACTION
测定成正比： 信号低 = 浓度低 信号高 = 浓度高
LIGHT REACTION
亲和素 磁性颗粒
B
生物素 抗体
ECL检测原理 ElectroChemiLuminescence (ECL)
结合 Ruthenium
转移至 电极;标 施加电压 结合 记后免疫 启动化学 电化学发光技术 磁珠 复合物与 发光反应 游离组分 分离
信号检测
e analyzer performance
ECL检测原理
反应特点: 迅速,可控,循环发光
三联吡啶钌
“催化” 三丙胺 发出可见光
电化学发光免疫检测原理—电化学发光的反应过程
失
CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3 三丙胺 CH2CH2CH3 Ru(bpy)33+ - e-
e-
阳离子三丙胺自由基
电极
CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3 CH2CH2CH3
主要内容
标记免疫技术的发展
电化学发光检测原理
电化学发光的技术特点
校准概念及溯源性 校准报警分析 常见数据报警分析 试剂特性解读
检测菜单介绍
电化学发光免疫检测原理—发光及检测系统
ECL intensity (counts)
applied voltage [mV]
1500
发 光 光 子 数
350,000 300,000 250,000 200,000 150,000 100,000 50,000 0 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 Time [sec.]
抗体
免疫复合物的形成
第一抗体标记生物 素（与微磁珠结合）
抗原
第二抗体标记 Ruthenium（产生光信 号）
生物素
Ruthenium
两种抗体皆能与靶抗 原特异性结合
免疫复合物
抗体
Source: Roche Diagnostics Research and Development
电化学发光免疫检测原理—测量室中的反应
1，抗体技术的革命，从使用多克隆抗体向使用单克隆抗体转变 2，从手工操作向全自动分析仪的转变 3，从液相放射免疫技术向均相和固相免疫分析技术的转变
标记免疫技术的发展－放射免疫测定法(RIA) 标记物: 碘125
• 优点
–分子量小,免疫损耗小 –简便、灵敏、特异 –可自行设计试剂盒 –应用范围广
底物: 无需底物
=
B B SA B B
电化学发光免疫检测原理—链霉亲和素和生物素技术
链霉亲和素----生物素包被技术
Streptoavidin,SA Biotin，B
适用于包被各种化合物，如多肽、脂多糖。
SA均匀牢固地包被在磁性微粒上
SA
亲和素 磁性颗粒
B衍生物结合的抗原或抗体与标本进行液相反应
B
生物素 抗体
SA
电极
TPA
光电倍增管
TPA TPA
电极
TPA
工作电极
磁铁
电化学发光免疫检测原理—测量室的结构
测量室组成和结构
流动测量室 可升降的磁性分离系统 彻底的清洗系统 高度自动化
电化学发光免疫检测原理—分析类型
夹心法
桥联法
竞争法
电化学发光免疫检测原理—夹心法检测原理
Reagent Reagent
• 缺点 半衰期短，试剂货架期短 标记物不稳定 每次需做标准曲线 反应时间长，不易自动化检测 使用放射性核素，需要一定防护
标记免疫技术的发展－酶联免疫测定法(ELISA)
标记物: HRP 辣根过氧化物酶/ALP 碱性磷酸酶
• 优势
底物:TMB四甲基联苯胺/对硝基苯磷酸酯P-NPP • 缺点
–包被表面积小（灵敏度和速度）