第四章 灭菌(2013)..

• 在一定温度下，微生物受热致死遵循分子
反应速度理论，微生物受热死亡的速率-
dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比，
即 dN kN
dt
ln Nt kt N0
t 2.303 / k log N0 Nt
当Nt=0时， t=∞， 既无意义，也不可能。
两边取对数得：
(3-5)
或
t 1 ln N 0
k Aexp( E ) RT
都与相应的活化能及T有关
3. 灭菌温度和时间的选择
当T1 →T2 ㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1 (∵ΔE>ΔE’) ∴随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培 养基成分分解速率增加倍数，故一般选 择高温快速灭菌 。
大多数细菌芽孢的杀灭温度和时间
• ①显微镜检查法
•②平板划线检查法：菌落
④发酵工程异常现象观察法
• a、溶解氧水平异常变化显示染菌；
•b、发酵过程pH变化与正常发酵过程有差别； •c、尾气中CO2异常变化显示染菌； •d、发酵液黏度、颜色变化和泡沫增多等。
1 2
2、纯种培养，采取措施：
①设备灭菌并确保不泄漏；
②所用培养基必须灭菌； ③通入的气体过滤除菌； ④种子无污染，确保纯种； ⑤补料要灭菌，确保无污染。
T：绝对温度，K
–活化能ΔE的大小对K值有重大影响。其它条件 相同时， ΔE越高，K越低，热死速率越慢。
–不同菌的孢子的热死灭反应ΔE可能各不相同。
–对上式两边取对数，得
ln
K


E RT

ln
A
(3-8)
–K是ΔE和T的函数
ln
K


E RT
ln
A
K（min-1）
1/T
2. 微生物热死定律：
kt
k↓，热阻↑, t↑
Байду номын сангаас
2 反应速度常数k
• 在相同的温度下，k值愈小，则此微生物愈 耐热。
•细菌芽孢的k值比营养细胞小得多，即细菌芽孢耐 热性比营养细胞大。
•同一种微生物在不同的灭菌温度下，k值不同，灭菌 温度愈低，k值愈小；温度愈高，k值愈大。
提高灭菌温度，k值增大，灭菌时间显著缩短。
• 当温度T一定时，k随微生物不同而不同， 具体计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。
5 灭菌
• 5.1 杂菌污染的危害 • 5.2 培养基的湿热灭菌 • 5.3 空气除菌
5.1 杂菌污染
1、杂菌污染的危害
①消耗营养;
②合成新产物，菌体自溶、发粘等造成分离困难； ③分解产物； ④改变pH，使生物化学反应发生变化； ⑤噬菌体破坏极大。
（2）不同发酵时期染菌对发酵的影响
①种子扩大培养时期:灭菌后弃去；
时 间 营养成分破
（ 0.5min ） 坏8 （%）
0.08
2
0.01
1
• ④ 结论
•采用高温快速灭菌的方法，既可达到灭菌的目的， 又可减少营养物质的破坏，通常为121℃，20－ 30min
微生物 营养细胞和酵母 细菌芽孢 霉菌孢子 病毒和噬菌体
相对热阻 1.0
3×106 2~10 1~5
（4）温度对K的影响
比热死亡速率常数k与灭菌温度T的关系可用阿
累尼乌斯方程表征
K A eE / RT
(3-7)
A：系数（s-1） ΔE：活化能（J/mol）
R：气体常数，8.314 [J/（mol.k）]
温度(℃) 100 110 115 121 125 130
时间
1200 150
51
15
6.4
2.4
（min）
不同温度下灭菌时间及培养基营养成分破坏情况
温度(℃)
100 110 115 120
时 间 营养成分破坏 （40m0 in ） （99%.3）
30
67
15
50
4
27
温度 (1℃30) 140 150
k
Nt
t

2.303
lg
N
(3-6)
0
灭菌时间取决：
k
Nt
污染程度（N0） 灭菌程度（ Nt ）
k值
3. 灭菌温度和时间的选择
• 培养物质受热破坏也可看作一级反应：
dC k'C dt
式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数； k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：
k' A'exp( E') RT
通风加大，加速产酸。
不同发酵时期染菌对发酵的影响
c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，
黄曲霉自溶。
d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐
④发酵后期染菌 – 染菌量不太多，可继续发酵 – 污染严重，则提前放罐
杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
(3)染菌的检查与类型的判断
三、培养基湿热灭菌需解决的 工程问题
需要的温度和时间
取决于： – 杂菌孢子的热灭死动力学 –反应器的形式和操作方式 –培养基中有效成分受热破坏的可接受范围
1. 热阻
• 定义：指微生物在某一特定条件（主要是温
度和加热方式）下的致死时间。可用比死亡
速率常数k来表示
dN kN dt
。 ln
Nt N0
②发酵前期染菌:重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种；
③发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理
方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细
菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；
存活率N／N0对时间t在半对数坐标上标绘，可以得到一 条直线，其斜率的绝对值即为比死亡速率k。
k值越大，表明微生物越容易死亡。
大肠杆菌在不同温度下 的残留曲线
嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同 温度下的死亡曲线
相对热阻：指某一微生物在某条件下的致死时间与 另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。
各种微生物对湿热的相对热阻
4、灭菌的方法
化学法
– 化学药品灭菌法 物理法 –干热灭菌法 –湿热灭菌法
–射线灭菌法
5.2培养基湿热灭菌
5.2.1湿热灭菌原理 5.2.2分批灭菌（实罐灭菌） 5.2.3连续灭菌（连消） 5.2.4分批灭菌与连续灭菌的比较
5.2.1微生物死亡速率与理论灭 菌时间
一、培养基灭菌的要求:
达到要求的无菌程度（10-3）
•尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基 组分的破坏，由两个基本类型的反应引起的：
–培养基中不同营养成分间的相互作用；
–对热不稳定的组分分解；
二、湿热灭菌的原理
原理：高温的蒸汽使微生物细胞中的蛋白质、酶和 核酸分子等大分子发生变性，使微生物死亡。
灭菌效果：穿透力强，湿热灭菌对耐热芽胞杆菌， 温度升高10℃时，灭菌速率常数可增加8～10倍， 对营养细胞更高。