生物化学实验报告

一、实验目的：

1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项；

2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法；

3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；

4、掌握酶蛋白分离提纯的原理；

5、掌握酶的比活力测定及其计算方法；

6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法；

7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。

称量技术：

1、了解电子天平的用途

2、了解电子天平的工作原理

3、掌握电子天平的使用方法

4、掌握电子天平使用前后的注意事项

离心技术：

1、了解离心机的基本原理和用途

2、了解离心机的类型和用途

3、了解离心机的型号和控制版面

4、掌握离心机的使用方法

5、掌握离心机使用的注意事项

层析技术：

1、了解层析技术的基本原理

2、了解层析技术的分类情况

3、了解各种层析技术的原理

4、掌握凝胶层析技术

光谱分析技术：

1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理

2、了解仪器结构和分类

3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项

电泳技术：

1、了解电泳的基本原理

2、了解电泳的类型

3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理

4、掌握垂直板电泳的操作技术

5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术

6、了解转移电泳的基本原理和操作方法

7、了解双向电泳的基本原理和操作方法

二、实验原理：

1、蔗糖酶的提取：

①酵母菌的基本特征：

单细胞，椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm，宽1-5μm。

②生物材料破碎方法：

（1）机械（匀浆）法

①研钵

②玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯

先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。

③高速组织捣碎机（0.5-1L）

将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

④高压匀质机（XL）

高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂。

优点：快速，产热小，对蛋白损伤小，破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上

（2）超声波处理法

用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常在30 至60Hz 频率下处理10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。（3）反复冻融法

将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！

（4）化学处理法

有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。

（5）溶胞作用(酶溶解法)

用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。（6）自溶法

将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。

2、蔗糖酶的纯化：

①酶与蛋白质纯化过程的独有特点：

（1）特定的一种酶在细胞内的含量很少……纯化困难

（2）可以通过测定活力的办法加以跟踪……寻找关键

②酶的纯化方法：

1.酶的蛋白属性；

两性电离：

蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH 条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。

等电点(isoelectric point, pI)：

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点。

大分子(胶体)：

分子量可自1 万至100 万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。

稳定的因素：

颗粒表面电荷

水化膜

2.调节酶溶解度的方法；有机溶剂分级沉淀

（1）改变离子强度；盐析硫酸铵分级沉淀（反抽提法）

反抽提法（Back Extraction）

例：E.coli RNA聚合酶42% - 50% 硫酸铵饱和度时沉淀

通常方法：先33%-------再50%

反抽提法：再42%

将包含待分离酶在内的多种蛋白一起先沉淀出来，然后再选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。蛋白从溶液中沉淀析出十分容易，沉淀在溶液中溶解有高特异性。

（2）改变pH或温度；

改酶变在介未电纯常化数之；前PI也是未知的，pH不宜变化过大，以免失活。Cu,Zn-SOD的纯化可在70 oC，10 min。

（3）改变介电常数；

有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。

有机溶剂分级沉淀操作条件的控制：

溶剂选择：

常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。

温度：

使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。

样品浓度的控制：

一般认为蛋白质的初始浓度为0.5%-2% 为好。

3.根据酶分子大小、形状不同的分离方法；透析、凝胶层析

（1）离心分离；最为常用分布在细胞器匀浆后离心

（2）透析、超滤；

利用具有一定孔径的亲水膜，在常压下依靠小分子物质的扩散运动，将含有高分子和

其他小分子的溶液与纯水或缓冲溶液分隔的一种方法.用于去除大分子溶液中的小分子物质，称为脱盐。用于去除大分子溶液中的溶剂，此称为浓缩。

（3）凝胶层析；

凝胶层析的定义：

凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析

凝胶层析

常见名称：凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析。

凝胶层析的基本原理：

凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而