细胞工程学实验课件ppt.ppt
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一、实验目的
通过对长春花叶片愈伤组织的诱导，分析生长素和细胞分 裂素对长春花叶片离体培养的作用，熟练掌握植物组织离体培 养培的基本操作技术，了解植物组织在离体培养条件下脱分化 的条件及特点。
1 900 1 650 370 170 440 22.3 8.60 6.20 0.83 0.25 0.025 0.025 37.30
扩大倍 数
10 10
1ห้องสมุดไป่ตู้0
100
称取量（mg）
母液体积 （mL）
19 000 16 500 3 700 1 700 4 400 2 230 860 620 83 25 2.5 2.5 3 730
5、精确称取15g琼脂加入其中，在电磁炉上煮沸溶解琼脂。此 过程需加以搅拌，防止琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出；
6、琼脂溶解后，及时将培养基分装于150mL三角瓶中，约
注意：培养基的pH直接影响培养物对离子的吸收，过酸或 过碱不仅影响到培养材料的生长，而且还影响到琼脂的凝固， pH低于5.5时，琼脂凝固程度不好，pH高于6.0时，琼脂过度 凝固，培养基变硬，不利于培养材料对营养物质的吸收及对代 谢废物的排放，从而影响培养材料的生长。培养基的pH可用 酸度计测试，并用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调整至适宜范 围（1mol/L盐酸配制方法：取12mol/L HCl 84mL，加入蒸馏 水定容至1 000mL；1mol/L氢氧化钠配制方法：称40g NaOH， 溶解后加入蒸馏水，定容至1 000 mL）。培养的植物材料其生
细胞工程学实验内容
★ 实验一 植物细胞培养基的种类及配制 ★ 实验二 植物愈伤组织的诱导 ★ 实验三 植物愈伤组织细胞的培养
实验一 植物细胞培养基的种类及配制
一、实验目的
1、了解植物细胞培养基的种类及营养要求。 2、掌握MS培养基的配制方法。
二、实验材料
1、实验设备：高压灭菌锅、电子分析天平、pH计、超净 工作台。
（二）MS完全培养基的配制
以配制1 000mL MS完全培养基为例，配制全过程如下： 1、在洁净的不锈钢（或搪瓷）容器中加入1/2终体积
（500mL）的蒸馏水； 2、按上表内容规定的量，精确吸取各种母液，依次加入到
盛有1/2终体积蒸馏水的不锈钢（或搪瓷）容器中，记录 此时的总体积。注意：母液不能混合后加入，也不能同 时加入，必须依次缓慢加入，且要一边加入一边搅拌， 以免造成电解质局部浓度过高而发生沉淀反应； 3、根据培养目的及要求，加入所需量的各种生长调节物
3、中等无机盐含量培养基：中等无机盐含量培养基中， 大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量 较MS的高，适合于花药培养。主要有Nitsch培养基和NT培养 基。
4、低无机盐含量培养基：低无机盐量培养基中，大量元 素含量大幅降低而且种类减少，多数用于生根培养基。主要有
四、MS培养基的配制
三、植物细胞培养基的种类
在100多年的植物组织、器官和细胞离体培养研究中，研 制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育 的培养基配方，但多数培养基是在几种普遍应用的培养基上演 变而来的，其中应用最为广泛的仍为MS培养基。植物组织培 养基早期的建立，如White提出的根培养基和Gautheret提出的 愈伤组织培养基，都是由先前的用于整体植物栽培的营养液发 展而来的。以后所有的各种培养基又都是在White培养基和
4、加入30g蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone， PVP，抗氧化剂，防止或减轻植物组织褐化，也可用一定 量的维生素C、活性碳代替，或不加，视情况而定），充 分混匀后，补充蒸馏水至终体积1 000mL，然后用1mol/L 盐酸或1mol/L氢氧化钠调节培养基至pH5.8；
植物细胞培养基种类很多，如MS、ER、B5、N6、NT和 White等。本实验以MS完全培养基为例，介绍植物细胞培养 基的配制方法。
（一）MS培养基母液的配制 母液的配制是按药品的种类和性质分别配制，单独保存 或几种混合保存。配制好的母液种类一般有大量元素、微量 元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类
对于某些不能高压高温灭菌的试剂或药品，必须过滤除菌， 待培养基灭菌后未凝固之前（45~60℃）加入，并轻摇使混匀。 这时，每个培养容器的装入量和过滤除菌后的物质都要事先计 算好，定量加入其中。植物培养基的配制程序可用流程图表示 如下：
水 药品 混匀 pH调整 琼脂 加热溶解 糖
实验二 长春花叶片愈伤组织的诱导
1000 1000 1000
1000
配1L培养基吸取 量（mL）
100 100
10
10
上表提供了MS培养基母液的配方。将各种化合物按指定扩大
倍数准确称量、分别溶解后，按先后次序加入蒸馏水中，最后用蒸 馏水定容。
注意：在混合定容时，一定要掌握药剂的先后次序或稀释度， 以免发生沉淀。钙盐和铁盐由于与其它母液混合容易发生沉淀反应， 因此需单独配制。铁盐为螯合状态时，有利于植物在适宜的pH下吸 收和利用，因此需与螯合剂Na2·EDTA混合配制。生长调节类物质 一般分别配制成0.2~1.0mg/L的母液，用时按量吸取。某些生长调节 剂不溶于水，需用不同溶剂进行溶解，如NAA、2,4-D、IAA、IBA、 GA3是醇溶性的，配制时先用少量95%酒精溶解，然后再用蒸馏水 定溶；KT、6-BA、2ip、ZT先溶于少量1mol/L盐酸中，然后再用蒸
母液 编号 种类
大
量
1
元
素
2
钙盐
微
量
3
元
素
铁
4
盐
成分
KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O H3BO3 KI Na2Mo4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O Na2·EDTA
规定量 （mg/L）
1、高无机盐含量培养基：高无机盐含量培养基中，钾盐、 铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，养分数量及比例 较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。 主要有MS培养基和ER培养基。
2、较高硝酸钾含量培养基：较高硝酸钾含量培养基适合于 木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主
通过对长春花叶片愈伤组织的诱导，分析生长素和细胞分 裂素对长春花叶片离体培养的作用，熟练掌握植物组织离体培 养培的基本操作技术，了解植物组织在离体培养条件下脱分化 的条件及特点。
1 900 1 650 370 170 440 22.3 8.60 6.20 0.83 0.25 0.025 0.025 37.30
扩大倍 数
10 10
1ห้องสมุดไป่ตู้0
100
称取量（mg）
母液体积 （mL）
19 000 16 500 3 700 1 700 4 400 2 230 860 620 83 25 2.5 2.5 3 730
5、精确称取15g琼脂加入其中，在电磁炉上煮沸溶解琼脂。此 过程需加以搅拌，防止琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出；
6、琼脂溶解后，及时将培养基分装于150mL三角瓶中，约
注意：培养基的pH直接影响培养物对离子的吸收，过酸或 过碱不仅影响到培养材料的生长，而且还影响到琼脂的凝固， pH低于5.5时，琼脂凝固程度不好，pH高于6.0时，琼脂过度 凝固，培养基变硬，不利于培养材料对营养物质的吸收及对代 谢废物的排放，从而影响培养材料的生长。培养基的pH可用 酸度计测试，并用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调整至适宜范 围（1mol/L盐酸配制方法：取12mol/L HCl 84mL，加入蒸馏 水定容至1 000mL；1mol/L氢氧化钠配制方法：称40g NaOH， 溶解后加入蒸馏水，定容至1 000 mL）。培养的植物材料其生
细胞工程学实验内容
★ 实验一 植物细胞培养基的种类及配制 ★ 实验二 植物愈伤组织的诱导 ★ 实验三 植物愈伤组织细胞的培养
实验一 植物细胞培养基的种类及配制
一、实验目的
1、了解植物细胞培养基的种类及营养要求。 2、掌握MS培养基的配制方法。
二、实验材料
1、实验设备：高压灭菌锅、电子分析天平、pH计、超净 工作台。
（二）MS完全培养基的配制
以配制1 000mL MS完全培养基为例，配制全过程如下： 1、在洁净的不锈钢（或搪瓷）容器中加入1/2终体积
（500mL）的蒸馏水； 2、按上表内容规定的量，精确吸取各种母液，依次加入到
盛有1/2终体积蒸馏水的不锈钢（或搪瓷）容器中，记录 此时的总体积。注意：母液不能混合后加入，也不能同 时加入，必须依次缓慢加入，且要一边加入一边搅拌， 以免造成电解质局部浓度过高而发生沉淀反应； 3、根据培养目的及要求，加入所需量的各种生长调节物
3、中等无机盐含量培养基：中等无机盐含量培养基中， 大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量 较MS的高，适合于花药培养。主要有Nitsch培养基和NT培养 基。
4、低无机盐含量培养基：低无机盐量培养基中，大量元 素含量大幅降低而且种类减少，多数用于生根培养基。主要有
四、MS培养基的配制
三、植物细胞培养基的种类
在100多年的植物组织、器官和细胞离体培养研究中，研 制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育 的培养基配方，但多数培养基是在几种普遍应用的培养基上演 变而来的，其中应用最为广泛的仍为MS培养基。植物组织培 养基早期的建立，如White提出的根培养基和Gautheret提出的 愈伤组织培养基，都是由先前的用于整体植物栽培的营养液发 展而来的。以后所有的各种培养基又都是在White培养基和
4、加入30g蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone， PVP，抗氧化剂，防止或减轻植物组织褐化，也可用一定 量的维生素C、活性碳代替，或不加，视情况而定），充 分混匀后，补充蒸馏水至终体积1 000mL，然后用1mol/L 盐酸或1mol/L氢氧化钠调节培养基至pH5.8；
植物细胞培养基种类很多，如MS、ER、B5、N6、NT和 White等。本实验以MS完全培养基为例，介绍植物细胞培养 基的配制方法。
（一）MS培养基母液的配制 母液的配制是按药品的种类和性质分别配制，单独保存 或几种混合保存。配制好的母液种类一般有大量元素、微量 元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类
对于某些不能高压高温灭菌的试剂或药品，必须过滤除菌， 待培养基灭菌后未凝固之前（45~60℃）加入，并轻摇使混匀。 这时，每个培养容器的装入量和过滤除菌后的物质都要事先计 算好，定量加入其中。植物培养基的配制程序可用流程图表示 如下：
水 药品 混匀 pH调整 琼脂 加热溶解 糖
实验二 长春花叶片愈伤组织的诱导
1000 1000 1000
1000
配1L培养基吸取 量（mL）
100 100
10
10
上表提供了MS培养基母液的配方。将各种化合物按指定扩大
倍数准确称量、分别溶解后，按先后次序加入蒸馏水中，最后用蒸 馏水定容。
注意：在混合定容时，一定要掌握药剂的先后次序或稀释度， 以免发生沉淀。钙盐和铁盐由于与其它母液混合容易发生沉淀反应， 因此需单独配制。铁盐为螯合状态时，有利于植物在适宜的pH下吸 收和利用，因此需与螯合剂Na2·EDTA混合配制。生长调节类物质 一般分别配制成0.2~1.0mg/L的母液，用时按量吸取。某些生长调节 剂不溶于水，需用不同溶剂进行溶解，如NAA、2,4-D、IAA、IBA、 GA3是醇溶性的，配制时先用少量95%酒精溶解，然后再用蒸馏水 定溶；KT、6-BA、2ip、ZT先溶于少量1mol/L盐酸中，然后再用蒸
母液 编号 种类
大
量
1
元
素
2
钙盐
微
量
3
元
素
铁
4
盐
成分
KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O H3BO3 KI Na2Mo4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O Na2·EDTA
规定量 （mg/L）
1、高无机盐含量培养基：高无机盐含量培养基中，钾盐、 铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，养分数量及比例 较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。 主要有MS培养基和ER培养基。
2、较高硝酸钾含量培养基：较高硝酸钾含量培养基适合于 木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主