农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法

制备转化用的农杆菌菌液

准备：

1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。

2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。

1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。

3．步骤：

共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。

4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。

（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。

2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。

4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。

5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。

花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥

（2）拟南芥种植

取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。一周后，选择生长健壮的幼苗移栽到培养土中。每周浇一次1/2 PNS培养液。当幼苗长至3-4cm时，去除花序，在去除顶端花序四天后进行转化。转化前将已经开花授粉的花和种子去除干净。（3）抽滤法转化拟南芥及阳性苗筛选

1活化农杆菌；

2、以1:50比例转接到200 ml LB培养基中，28℃，2000rpm培养至OD600=1.2-1.6;

3、4000rpm，离心15min，收集菌体；

4、重悬于渗透缓冲液(1/2 MS培养基+5%蔗糖配置后在121℃ 灭菌20 min，加终浓度0.02-0.03% SilwettL-77，振荡混匀)，以重悬渗透液为对照，调节OD600=0.8-1.0；

5、将已授粉、结荚的拟南芥用消毒剪去除，倒置于装有渗透缓冲液的合适大小的容器上侵染50 S，用塑料薄膜覆盖整个托盘并适留通气孔后，在弱光下培养，24h后取下薄膜，于室温中继续培养。

6、约30日后收获种子，将收获的转基因种子用含有0.2%的Triton X-100浸泡10 min；

7、用10%的次氯酸南表面消毒10-12 min；

8、灭菌水冲洗5-6次，每次约2 min；

9、用水将转基因种子置于含50mg/L Kan的MS平板上，4℃暗培养两天；20 mg/L Hyg潮霉素筛选连续暗培养7天；

10、Kan抗性筛选的种子在22℃，16h光照/8h黑夜光周期培养。两周后，经Kan 抗性筛选的阳性植物表现良好，长势正常，而阴性植物则不萌发或不久死亡。

1 拟南芥的种植

试剂配制

人工土：3份蛭石，1份珍珠岩和1份黑土混合

PNS营养液：

每升含

5ml 1M KNO3，

2ml 1M Ca(NO3)2˙4H2O，

2ml 1M MgSO4˙7H2O，

2.5ml 20mM Fe.EDTA，

2.5ml 1M磷酸缓冲液（pH5.5），

1ml MS 微量元素。

PNS营养液母液配方

①1M KNO3 101.1g

②1M Ca(NO3)2˙4H2O 236.15 g

③1M MgSO4˙7H2O，246.48 g

④20mM Fe.EDTA：

FeSO4 5.57g

EDTA 7.45g

注意先各自配成溶液，在混合。

⑤1M磷酸缓冲液（pH5.5）：

磷酸二氢钾 130.4g

磷酸氢二钾 9.12g

⑥MS 微量元素

硼酸 0.434g

硫酸锰（MnSO4 H2O） 1.7626g

CuSO4˙H2O 0.0798g

ZnSO4˙7H2O 0.172g

NaMoO4˙2H2O 0.0432g

NaCl 0.585g

CoCl˙6H2O 0.00129g

以上母液均配至1L

种植步骤

将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上。两天后光照，三天后揭膜。

人工培养室条件：相对湿度80%，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8 h黑暗﹑16 h光照培养。

2 拟南芥的转化

试剂配制

渗透培养基（一升中）：1/2xMurashige-Skoog；5% 蔗糖；0.5克 MES；用KOH 调至pH5.7；再加：10微升1mg/ml的6-BA 母液；200微升Silwet L-77）

注意：6-BA 母液配制时用乙醇溶解。1/2xMurashige-Skoog是用MS的基本组分配制，但大量元素减半。

另：经转化的拟南芥，种子收获后需在相应的抗性平板上筛选转化子

转化步骤

(1) 制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液O.D600当在1.2到1.6之间。

(2) 室温5000rpm离心15分钟。

(3) 弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使O.D600在0.8左右。

(4) 将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株（或用抽真空的方法），盖上透明的塑料盖子或保鲜膜以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。

(5) 一周后再喷洒一次，方法同上。

3 转化子的筛选

(1) 种子消毒：先用70%乙醇浸泡10分钟，在上述处理时要不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次，在这步处理时最好也不时地使种子悬浮。

注意：用乙醇浸泡的时间不宜过长！

(2) 处理后的种子用Top agar（0.1%琼脂水溶液）均匀涂布在固体筛选培养基表面。一块150mm直径的平皿最多种1500棵。

(3) 4℃春化2到3天，移入22℃恒温室培养。

(4) 观察种子在固体筛选培养基上生长情况,可确定为转化子时,将转化子移栽