农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。
2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。
3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。
4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。
一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。
4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。
5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。
6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。
7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。
转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理；2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时，将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒，3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料：生殖期的拟南芥植株，含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP)，无菌滤纸仪器设备：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式高速离心机，涡旋仪，抽滤器，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，培养室用具：微量移液器，金属药匙，牙科手术钩或细菌涂布器，100 ml无菌三角瓶，直径9 cm 培养，200 ml及1ml tip枪头，枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉，待其次生薹长出，浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花；2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心，每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底；5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌，直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可；6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中，将花盆倒转过来，将花序浸入农杆菌中20 s，轻轻转动和晃动植物，保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中，取出后能看见植物上有一层水膜，轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天；8）将其遮光袋拿去，移到智能气候室培养，并定期补浇营养液，直到角果成熟收获种。
农杆菌侵染拟南芥方法
农杆菌侵染拟南芥方法植株准备：养的壮壮的，可以适时打顶，剪掉顶端，长更多侧枝。
1.冻融法转化农杆菌1.1 目的质粒与农杆菌GV3101感受态混匀，冰上共孵育5-30min, 液氮中冻5min, 37℃5min, 冰上2min, 加入无抗性LB 28℃恢复培养2-4h, 涂相应抗性板，28℃培养24-48h.2. 摇菌2.1 PCR鉴定单克隆，挑选阳性单克隆接入2-3ml相应抗性LB中，小摇至橙黄色，约24-48h。
如果是保种的菌，最好也要小摇。
2.2 按0.5%-1%接种量接入~150ml相应抗性LB中，过夜至橙黄色。
2.3 收菌，5000rpm,10min（最好用250ml的离心瓶，50ml的离心管也可）。
菌体沉淀用等体积（大摇菌的LB体积, 不是沉淀的体积，收菌的时候在瓶子上画个线即可）5%蔗糖溶液（水溶）重悬，手晃、枪吹打、涡旋均可。
加入~0.1% （0.5‰上下100倍均可）Silwet,摇匀。
3.侵染3.1 待侵染的植株剪去果荚和开放的花。
植株在前一天浇足水。
（可侵染前一天剪，不剪也是可以的）3.2侵染液（5%蔗糖重悬的菌液）倒入比较浅的容器（枪头盒盖子、15cm培养皿或其他类似盒子均可）中。
3.3将保鲜膜铺在桌子上或地上，将植株的花序和茎（茎上的腋芽）浸入侵染液，静置30-60s,拿出放置于保鲜膜上，包起来（包住盆的一部分和植株全部），平着放入黑色塑料袋内或者盆内（遮光即可）。
18-22h后，揭去保鲜膜，正着放置生长即可。
如此时发现还有明显菌液，可晃一晃去除，令植株的花序不要黏在一起。
揭保鲜膜最好不要超过20h, 超过24h，花序蔫掉的比率会大大增加。
3.4 侵染后7-10天后可以进行第二次侵染。
这次坚决不能剪果荚和花二次侵染前提是植株的花序顶端还很壮，还能开好多花，否则就等着花序蔫掉吧，切记切记。
拟南芥蘸花法
农杆菌蘸花转化拟南芥法1、将低温保存的带有表达载体的农杆菌菌株，分别在对应抗性平板上划线，挑取单菌落接种于5ml的已加入对应抗生素的液体LB培养基中，28℃下250rpm振荡培养18-24h；2、然后相同条件下按照1:100接种扩大培养，总菌液体积为200ml，直到OD600值在0.8-1.0范围内；3、离心沉淀并去上清液，用等体积的5%的蔗糖溶液重悬菌体，在菌液中加入0.02%-0.04%的SilwetL-77混匀；4、将拟南芥的花序在菌液中蘸取0.5-1min即可(在转化前要先将拟南芥的角果剪掉);5、然后将拟南芥苗放置于黑暗，湿润的条件下16h，一周后，重复侵染一次；6、收种后种植后代，向12d的幼苗上喷洒54mg/ml除草剂或在将种子播种于抗性MS平板上以筛选阳性植株。
拟南芥播种1、将拟南芥种子用50%的84消毒液表面消毒6-8 min，继而用无菌水漂洗3次;2、在0.1%琼脂糖中悬浮，然后播种在抗性的MS培养基上，4ºC低温避光处理2天后，转入光照培养室生长。
3、幼苗7d左右便可筛到阳性植株，并移栽到含有蛭石的营养土中继续生长（蛭石：营养土=1：3）。
植株种植的培养箱维持22℃恒温和16h光照/8h黑暗培养的循环培养条件。
注：几种常用抗生素的工作液浓度Kanamycin 50μg/mlGentamicin 50μg/mlRifampicin 25-50μg/mlHygromycin 50μg/mlBarstar 25-50μg/ml注：MS培养基配方（1L）MS盐 4.4gMES 0.5g蔗糖10g调PH至5.8-6.0加Agar 10g(在抗性MS培养基上筛选阳性转基因植株时可不加蔗糖防止长菌)42. Schägger H, von Jagow G (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.AnalBiochem166:368–379.。
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究农杆菌介导的植物转基因技术在研究植物基因功能、改良作物农艺性状等方面发挥着重要作用。
拟南芥作为模式植物，是研究植物基因功能的重要材料。
本文主要介绍农杆菌介导的拟南芥转基因方法——浸花法。
该方法操作简单，转化效率高，易于在中学生物实验教学中推广。
通过该实验，可以培养中学生对于生物学科的兴趣，提高学生对于生物知识的理解力和创新能力。
标签：植物转基因；农杆菌；浸花法植物转基因技术是指把目的基因通过各种方法转移到植物基因组中，使之稳定遗传。
利用该技术研究基因在植物个体生长发育以及生理代谢过程中功能，研究成果可应用于农艺性状的改良、植物经济价值和观赏价值的提高等方面。
植物基因转化的方法可分为直接转化和载体介导两种转化方法。
基因直接导入法直接将外源目的基因导入植物的基因组中，包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法、PEG 介导转化方法、脂质体法和花粉管通道法等；载体介导的转化方法需要将目的基因插入到改造后的农杆菌质粒或病毒的DN分子上，利用农杆菌或病毒对植物的侵染作用将目的基因导入到植物基因组中。
农杆菌介导的转化方法具有应用范围广，转化率高，单拷贝比例高，转化子稳定等特点，是植物转基因研究中的常用转化方法。
农杆菌能在自然条件下感染大多数双子叶植物受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
在农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可以插入到植物基因中。
科研人员经过长期的研究，将目的基因插入到经过改造T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，从而获得转基因植株。
利用农杆菌介导的转化方法进行转基因操作时，根据植物材料的不同，采用不同的转化方法，如在烟草转化时常采用叶盘法，而水稻转化则采用愈伤组织转化的方法。
浸花法（floral tip）是拟南芥转化最常用的方法。
这种转化方法不需要组织培养和再生植株的过程，操作简便、转化效率较高，为科研人员提供了极大的便利。
农杆菌侵染拟南芥
拟南芥侵染方法：
1、取150ml 含相应抗生素的液体LB培养基，接入2-3ml准备好的农杆菌菌液，大摇过夜
至培养基由红色转为黄色。
2、将培养后的150ul农杆菌菌液导入灭过菌的50ml离心管中，4℃，3000rmp离心15min
3、弃上清，加入50ml 1／2 MS，将菌泥搅起
4、将培养4周左右,刚开花的拟南芥植株上的果荚去除，将上面准备好的菌液倒入培养皿
中，将整个花序浸入菌液10sec
5、将浸好的拟南芥植株在黑暗条件下，处理18-24h后继续光照，一周后可再dip一次
用于Dip的1／2 MS配方：（每150 ml菌液加50 ml 1／2 MS液）
MS大量5 ml
蔗糖10 g
水95 ml
表面活性剂20 ul
常用1／2 MS配方（1 L）：
10X大量元素50 ml
100X微量元素 5 ml
100X铁盐 5 ml
蔗糖（1%）10 g
琼脂粉8 g
拟南芥生长土壤：
腐殖土：蛭石=1:1混匀，装双层袋子，高压121℃灭菌40分钟
注意：灭完菌后要加适量水将土和湿，不能太湿，然后土装入钵里压实，将钵放入装有水的底盘中，一个小时左右钵中土壤浸湿后便能种苗。
种子消毒：
30%H2O2+85%乙醇1:4混合
取250微升混合液加入种子种用枪头吹打40S，放在滤纸上晾干，然后铺在1／2 MS平板上。
4℃冰箱中放置春花1-5天，一般新种子春花时间长点。
16\8 光周期，待真叶长出时，用镊子将苗从平板移植到土壤中。
营养土产家：吉林省德惠市芳洁花土厂(花卉营养土) 我们是从北京际翔园艺花圃公司买的。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。
2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。
1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。
3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。
28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。
用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。
转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。
2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。
3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。
4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。
5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。
花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。
花序浸染法转化拟南芥
花序浸染法转化拟南芥1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。
营养土和蛭石1：1比例混合。
2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。
不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。
注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。
总之盖膜时间自己灵活掌握。
3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。
浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。
（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3 101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。
拟南芥的花浸渍转化方案
拟南芥的花浸渍转化方案
拟南芥的花浸渍转化是利用其遗传特性实现不同的目的的一项技术。
通常来说，拟南芥的花浸渍转化方案分成三个步骤：1）花粉培养 2）植物体系建立 3）转基因表达系统构建。
首先，在进行拟南芥花浸渍转化方案时，花粉培养是必不可少的一个步骤。
在该步骤中，
一般利用磷酸三钠、核酸抗凝剂、复合氮肥和碳源构建适宜的花粉培养基，利用此基础培养拟
南芥花粉以便获得正常受精细胞。
其次，完成花粉培养和受精细胞形成后，将进行植物体系的建立。
在此步骤中，需要构筑
一个适宜的植物大培养体系，一般以磷酸铵、硝酸钾、硫酸钙和无机氮构建营养基，并加入2％的半乳糖等激素以利于受精细胞的胚胎发育，建立起适宜的植物体系。
最后，构建转基因表达系统，这是拟南芥花浸渍转化中最重要也是最复杂的一步。
常用的
基因载体可以分为普通的DNA质粒和Agrobacterium质粒载体，其中保护基因所需的抗生素
标记也不相同，它们分别是：对于普通的DNA质粒，采用Kanamycin标记；而对于Agrobacterium质粒载体，采用Bastinomycin标记。
在此步骤中，我们还需要将培养好的转
基因拟南芥细胞接种到拟南芥的植株上，以便获得转基因拟南芥以及转基因表达分析。
总之，拟南芥的花浸渍转化方案具有较强的通用性，可以用于实现拟南芥的转基因技术。
此外，拟南芥的花浸渍转化方案分为三个步骤：花粉培养，植物体系建立和转基因表达系统的
构建。
与传统的转基因技术相比，拟南芥的花浸渍转化方案具有更快的获得转基因拟南芥的速度，同时也具有更高的成功率，可以为科研活动提供更高的效率和更好的效果。
采用农杆菌花序浸染法获得转crtB基因拟南芥
采用农杆菌花序浸染法获得转crtB基因拟南芥作者：刘慧娟，冯志国，李先文，等来源：《湖北农业科学》 2013年第1期刘慧娟１，２，冯志国１，２，李先文1，李涛２，３，何光源２（１．信阳师范学院生命科学学院，河南信阳４６４０００；２．华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室，武汉４３００７４；３．重庆警察学院，重庆４０１３３１）摘要：利用农杆菌花序浸染法将构建的植物表达载体ｐＢＩ１２１－ｔｐ－ｃｒｔＢ转入拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）野生型Ｃｏｌｕｍｂｉａ中，共获得了１４株转基因系，并进行了转基因拟南芥种子萌发实验。
结果表明ｔｐ－ｃｒｔＢ基因已经成功转入拟南芥中，其不影响拟南芥种子的正常萌发。
关键词：ｃｒｔＢ基因；农杆菌花序浸染法；拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）中图分类号：Ｑ９４３．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０13）01－0200-03类胡萝卜素（Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ）是一种在自然界中分布广泛、种类丰富的色素，导致许多植物的果实、花及块根呈现橙红色、黄色或红色。
类胡萝卜素对动物、植物、藻类、细菌以及真菌细胞都是不可缺少的营养成分。
植物类胡萝卜素还是植物激素［１］、防御化合物［２］和风味芳香物（如β－吲哚）［３］等许多生理活性物质生物合成的前体。
噬夏孢欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ）类胡萝卜素合成相关基因ｃｒｔＢ编码的八氢番茄红素合成酶是催化类胡萝卜素合成的关键酶和限速酶。
为了研究该酶对类胡萝卜素合成的调控作用，构建了特异性表达载体ｐＢＩ１２１－ｔｐ－ｃｒｔＢ，通过农杆菌花序浸染法将其转入拟南芥，获得转ｃｒｔＢ基因拟南芥植株，为分析ｃｒｔＢ基因的过量表达对拟南芥生长发育的影响奠定基础。
１材料与方法１．１材料大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α、根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５及ｐＢｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔＫＳ、植物表达载体ｐＢＩ１２１－ｎａｐＡ均为华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室保存。
农杆菌转化和侵染拟南芥及其种子的消毒与筛选
一、拟南芥种子的消毒1、网筛：硅胶干燥过两三周的种子，用漏网筛滤几遍，尽量除去皮壳等杂质，倒入EP管中；2、消毒：于超净台上，用无菌枪头，向EP管中加入1ml的70% 酒精，并计时8分钟，在此期间不停的振荡，以使种子与酒精充分接触，最后12000rpm离心30s；3、洗涤：回到超净台上，酒精消毒双手，用无菌枪头将70% 酒精吸出，更换无菌枪头，吸取1ml无菌水加入管中，反复颠倒振荡，以使种子与无菌水充分接触，最后12000rpm离心30s；重复上述操作两次；4、春化：无菌枪头吸取1ml无菌水，加到种子EP管中，放入4℃冰箱中三天。
二、表达载体克隆构建转化农杆菌1、冲洗电击杯：水龙头下流水冲洗3min以上；于超净台上无菌水冲洗：用无菌蓝枪头将无菌水加入电击杯中，然后吸出并打入电击杯底部狭缝，如此重复吹打几次，再换成新的无菌水，如此反复3次；无水乙醇冲洗，同上反复3次；70%酒精冲洗，同上反复3次；最后无水乙醇冲洗1次，并平放于枪头盒上对着超净台风向吹干；2、加样：将已经吹干的电击杯放在冰上预冷，与此同时，从-20℃取出的质粒解冻后亦放在冰上预冷；然后从-80℃中取出已制备好的农杆菌感受态，解冻时离心几秒钟使其均匀分布（储存完整量为50ul）；准备工作做好后，白枪头吸取质粒1ul打入50ul农杆菌感受态细胞中，然后轻轻反复吹打使两者混匀，再用黄枪头全部吸出，沿着电击杯内壁或侧壁打入缝隙中，最后放于冰上保持低温；3、电击：插上电击仪电源，打开开关，调至Bacteria，调至Agr（农杆菌），将电击杯外壁突出面放在前面，并放在电击仪槽中，然后将槽推进去，使两边电击卡住，最后摁下Pulse脉冲进行电击，听到蜂鸣后取出电击杯放回冰上；4、复苏：于超净台上，沿电击杯内壁，往电击杯狭缝中，加入800ul无抗LB培养液，然后换用黄枪头，反复吸出培养液并吹打底部感受态细胞，使其悬浮起来，最后吸到2ml无菌EP管中，于28℃恒温箱中复苏1～2小时；5、涂板：复苏结束后，将菌液涂至含有利福平（菌种自身抗性）和表达载体抗性抗生素的固体培养基平板上，于28℃恒温箱中倒置过夜培养；三、侵染拟南芥植株1、栽种：将春化种子点在土里，隔两天浇一次水；2、打顶：拟南芥幼苗抽薹两三天后，去除其顶上花序，注意要避免伤及叶生花序；3、转化：打顶三四天后，进行侵染转化。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法转化农杆菌：GV3101农杆菌感受态从-80℃取出，冰上融化，加入2-5ul质粒，去郭老师实验室电激转化（拿杯，洗，，吹干，预冷，加菌液，对准方向插杯，AAgr程序，激完后看时间2.2hv、5.0s 左右，每次需确定程序，需带的东西：镊子、枪、枪头、吹风机、纸、水、废液缸），激后往杯中加入200ul不含抗生素的LB，28℃，200rpm复苏30-60min，之后在含50mg/l Kan （1/1000，50mg/ml）、50 mg/l Genta（1/1000，50mg/ml）、50mg/llRif（1/200，10mg/ml）的LB选择平板上涂板，在28℃培养箱中培养2天（1天可见微小单克隆），挑单克隆划板，28℃培养箱中培养2天。
预摇：挑单克隆至30ml 含50mg/l Kan（1/1000，50mg/ml）、50 mg/l Genta（1/1000，50mg/ml）、25mg/llRif（1/400，10mg/ml）的LB 中，28℃，200rpm，24h。
扩培：以1：100扩培至含400ml的1L锥形瓶中，在28℃，200rpm培养13-16h（从冰箱中取出的菌扩培会慢些一般需要16h），至OD600达到1.5-2.0之间收菌，收菌条件5000rpm，8min。
转化植株：转化前一天晚上或是转化当天剪去植株上所有果荚和露白的花配制5%的蔗糖溶液（每种500ml），用少量蔗糖溶液摇悬起菌，在转化前再加入0.02%的Silwet L-77。
将植株茎部浸泡在菌液中50s，取出略甩一下后，放入透明塑料袋中，密封保湿。
所有转化完后，扣上黑色塑料袋和盒子，避光培养24h。
一天后，将植株直立放置，浇水培养，3天1次，保证植株水分充足。
过一周后进行再一次转化。
zqy2009-5-7。
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
侵染液制备
1、将保存的农杆菌拿出按1：100的比例接种与5ml含抗生素的液
体YEP培养基中。
28°C、220rpm过夜培养。
农杆菌2h左右繁殖一代，培养时间较大肠杆菌长。
2、将活化好的农杆菌按1：100的比例加入100ml含抗生素的液
体YEP培养基中继续28°C、220rpm培养16h左右。
3、次日中午测菌液OD600值，用含抗生素的液体YEP培养基作为
空白对照。
OD600值达到1.0-1.3之间时，用50ml离心管，
室温4000rpm离心10min集菌。
倒掉上清，加入悬浮液重悬
菌体，调节OD600达到0.8-1.0.
悬浮液100ml为例：ddH2O 1OOml、MS 0.216g、蔗糖5g、L-77 30ul，调节PH=5.8
4、拟南芥有花序、花蕾的植株浸入悬浮好的菌液40-50s ,确保
所有的花都浸在农杆菌培养液中。
浸染后避光过夜，第二天
揭开覆膜。
正常光照培养。
每隔七天转化一次。
可转化3次
提高转化效率。
农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥的研究
农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥的研究张思维;周文波;张新;陈翠娜;代其林【摘要】耐辐射奇球菌(D.radiodurans,DR)在极端胁迫条件下能够继续生存,其耐辐射奇球菌基因组中(DR R1)拥有一个独特的极端环境抗性基因组而被广泛研究.DR1372基因就是在DR R1中克隆得到的一个基因,其蛋白序列存在一个Why 功能域,此功能域可能参与了植物的抗旱过程.我们利用基因工程手段首先构建了植物DR1372-GV3103表达载体,然后利用花序浸染法成功将目的基因DR1372转入拟南芥中,最后对阳性植株进行盐胁迫,证实了DR1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性.初步建立了农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥体系,为后续DR1372基因的功能研究工作提供了理论基础.【期刊名称】《绵阳师范学院学报》【年(卷),期】2013(032)002【总页数】8页(P57-64)【关键词】DR1372;载体构建;盐胁迫;拟南芥【作者】张思维;周文波;张新;陈翠娜;代其林【作者单位】西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳621000【正文语种】中文【中图分类】O175.120 引言目前，越来越多的抗旱相关基因已经被克隆，并用来提高植物的抗旱性.按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相关基因分为两大类:第一类是编码在植物抗性中直接起保护作用的蛋白质基因，属于功能基因;第二类是编码在信号传导和逆激基因表达过程中起调节作用的转录因子基因，属于调节基因［1］.Pibn－Smits等将otsA和otsB导入烟草，在干旱胁迫下，转基因植株中海藻糖含量比对照高，叶面积增大，光合活性提高［2］.Kishor等将从乌头叶豇豆中克隆的P5CS基因与CaMV35S启动子连接转入烟草中，发现转基因烟草的脯氨酸含量比对照高10－18倍;干旱胁迫下，转基因烟草落叶少而迟，根比对照长40%，生物量增加2倍［3］.Capell等发现Adc在水稻中的超表达缓解了干旱条件下转基因水稻叶绿素的损失，并提高了水稻的抗旱性［4］.由于转录因子能在转录水平上调控一系列基因的表达，所以转化调节基因能有效地提高植物的耐旱性，与抗旱相关的转录因子有DREB、MYC/MYB、bZIP、WRKY和NAC类等，其中MYB/MYC是植物中最大的转录因子家族.Chen等发现了小麦中23个MYB转录因子，其中有4个与抗旱相关［5］.耐辐射奇球菌(D.radiodurans，DR)是Anderson等科学家在1956年从经过灭菌处理的肉类中发现的一种红色非致病性球菌，目前被认为是"世界上抗性最强的细菌"，因其对电离辐射、干燥、紫外线及一些DNA损伤试剂显示超强的抗性，一直倍受生物医学界的关注［6］.White等在1999年公布了DR R1的完全基因组序列，包括两条染色体，共携带有3195个可预测基因，并对部分基因进行了评注［7］.DR R1基因组可以在一个细胞中完成DNA修复，DNA损伤信号输出，干旱和饥饿胁迫的应答，以及基因组的修复等功能.Battista等推测，在耐辐射球菌R1中的抗旱性研究将用于引导较高生物体的抗旱性研究［8］.DR1372基因是耐辐射奇球菌体内1号染色体上的一个基因，把这个基因转入大肠杆菌后进行培养，经初步定性分析发现，在大肠杆菌中有稳定细胞膜，调节细胞内外渗透压的作用，初步推测为与调节水分胁迫应答有关的基因.对DR1372蛋白序列进行分析发现，其内部存在一个WHy功能域非特异性结合位点，与HIN1蛋白中的WHy功能域结构非常相似［9］.WHy结构域存在于几大类蛋白质家族中，大约由100个氨基酸组成，这些氨基酸由亲水性和疏水性氨基酸交替排列，并且在N末端都存在一个非蛋白氮(NPN)结构.同时，研究者还在胚胎发育晚期蛋白中也发现了WHy功能域的存在，最终推测WHy结构域是参与植物水分胁迫应答以及超敏应答的一类功能域［9］.脱水素是一类亲水性蛋白质，其蛋白结构中也含有一个WHy功能域，它们在胚胎发生后期阶段产生，对低温、外源ABA、干旱、盐渍以及脱水胁迫反应迅速，进而在植株中积累［10、11］.由于WHy功能域参与了干旱胁迫应答，这些间接证据表明DR1372基因在干旱胁迫过程中也可能参与了抗旱性相关的基因.因此，本研究利用基因工程手段构建植物DR1372－GV3103表达载体，将DR1372基因转入拟南芥中，得到转基因抗性拟南芥，并对转DR1372基因拟南芥幼苗进行了盐胁迫的反应，不仅为后续的该基因研究提供了丰富的植物材料，也为DR1372的功能研究包括WHy功能域的功能研究奠定了基础，对植物育种工作也有一定的指导意义.1 实验材料1.1 植物材料拟南芥野生型col－0生态型1.2 菌株DR1372+Z3(DR菌内与干旱相关的基因DR1372与穿梭质粒pRADZ3连接转大肠杆菌)，JM109，JM109，GV31032 实验方法2.1 构建DR1372－GV3103植物表达载体2.1.1 DR1372 基因的引物设计根据DR1372基因序列，利用生物软件Primer5设计出该基因的上、下游引物(分别命名为DR1372－F，DR1372－R);根据pBI121质粒图谱，分别引入XbaI，SacI限制性酶切位点，并设计引物如下:2.1.2 PCR扩增目的基因DR1372用试剂盒(TIANGEN)提取DR1372+Z3质粒，在最优扩增体系下进行PCR扩增.电泳验证.2.1.3 质粒pBI121的提取用试剂盒(TIANGEN)提取pBI121质粒.电泳验证.2.1.4 PCR 产物胶回收PCR产物经电泳检测后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)回收扩增的目的片段DR1372和pBI121.电泳验证.2.1.5 DR1372基因和pBI121的酶切，连接，筛选及鉴定2.1.5.1 目的片段DR1372和pBI121质粒用XbaI，SacI(购自Takara公司)进行双酶切，37℃酶切过夜，回收目的片段.2.1.5.2 将回收的目的基因片段和pBI121质粒大骨架片段，16℃连接过夜，重组质粒转化JM109感受态细胞.2.1.5.3 阳性克隆检测:进行菌落PCR初步鉴定，将PCR检测出的阳性单克隆摇菌后送华大基因公司测序.2.1.6 挑取测序成功的JM109单菌落，继代培养，保菌.将保存菌种摇菌提取质粒，得到 DR1372－GV3103植物表达载体.2.2 花序浸染法转化拟南芥2.2.1 培养基:MS培养基中抗性筛选平板加入卡拉霉素(Kan，50 mg/ml)Hoagland＇s(霍格兰氏)液体培养基药品试剂:乙酰丁香酮(AS)Silwet－L77表面活性剂2.2.2 拟南芥种子的消毒、铺板及植株培养选取150粒拟南芥种子，用75%乙醇消毒1 min，然后用无菌水洗2遍;再用2.5%NaClO消毒5 min，用无菌水清洗5遍后，最后用加无菌水少许，放在4℃冰箱春化2 d后进行铺板.铺板前一天按照每板大约25 mL MS配制固体平板培养基，col－0生态型拟南芥种子铺于无抗性培养基上，放入光照培养箱中(22℃，16h/8h光/暗培养 (光强130 μmol·m－2·s－1)).培养10 d后把拟南芥幼苗移栽至培养土中(营养土/蛭石=2:1)，相同温度和光照条件下继续培养，每3 d浇水一次.待拟南芥开出花序准备进行浸染.2.2.3 花序浸染法浸染拟南芥:2.2.3.1 DR1372－GV3103农杆菌的培养:在200 mL LB液体培养基中加入0.2 mL DR1372－GV3103菌液，28℃ 220 rpm振荡培养15 h左右，室温下4000 rpm离心20 min，弃上清，用1/2 MS液体培养基(含AS 100 μmol/L，0.05%Silwet－L77表面活性剂)悬浮菌体，稀释到原体积的10倍，在28℃ 220 rpm振荡培养1 h，菌液浓度达到OD600=0.5时待用.2.2.3.2 浸染:将拟南芥未开花的花序浸入菌液中3－5 s，倒放24 h，并用薄膜覆盖避光24 h，然后21℃光照培养.2.2.4 收取拟南芥的T1代种子:T1代种子采收后，用含有卡那霉素的平板进行转基因阳性筛选，然后提取抗卡那霉素的拟南芥幼苗基因组进行PCR鉴定，阳性T1代幼苗开花结实后，收取T2代种子，得到纯合体转基因拟南芥种子.2.3 转DR1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应2.3.1 拟南芥种子的消毒、铺板选取T2转基因拟南芥种子约200粒，用75﹪乙醇消毒1 min，用无菌水洗2遍;再用2.5﹪NaClO消毒5min，随后用无菌水清洗5遍，再次加入无菌水放置在4℃冰箱进行春化处理2d.然后把春化后的种子铺在25 mL MS固体培养基上，转基因和非转基因拟南芥种子均铺于无卡拉霉素的培养基上，封口放入光照培养箱中培养(22℃，16/8h 光/暗培养 (光强为130 μmol·m－2·s－1)).2.3.2 对拟南芥幼苗进行NaCl盐胁迫待拟南芥幼苗在平板上长出3片叶后，在平板中加入0、100、200、250和300 mmol/L灭菌的NaCl溶液.然后观察拟南芥幼苗的生长状况.3 结果3.1 pBI121－DR1372质粒的构建3.1.1 提取含DR1372基因质粒提取DR1372质粒，其电泳结果如图A所示，我们提取的目标基因条带清晰，无弥散现象，可以用于PCR扩增.3.1.2 DR1372 基因的扩增利用DR1372－F和DR1372－R引物对DR1372基因进行PCR扩增，其电泳结果如图B.DR1372基因分子大小为495 bp，条带位置正确，并且为单一条带.然后对PCR产物进行胶回收，其胶回收电泳结果如图C.3.1.3 pBI121 质粒的提取提取pBI121质粒后进行电泳，其电泳结果如图D所示，所提取的目标基因条带清晰，无弥散现象，可以进行酶切.3.1.4 对DR1372胶回收产物进双酶切，酶切位点分别为XbaI，SacI，经电泳后(图E)再胶回收(图F).同时对pBI121质粒进行XbaI，SacI双酶切，其电泳图和胶回收情况见图G和图H.从图G和图H两个电泳图分析表明:经双酶切后，目的基因DR1372和质粒pBI121都被切开，胶回收后都能够得到清晰单一的条带，该连接了DR1372基因的质粒pBI121载体可以用于大肠杆菌和根癌农杆菌的转化.3.1.5 连接目的基因的质粒转化菌种JM109把链接了目的基因的质粒转化到JM109后，经培养后挑取抗卡拉霉素菌落直接进行PCR扩增，其扩增的部分结果如图I，表明:有多个菌落显示为阳性，把阳性克隆送去测序，测序反馈结果经过软件分析，目的序列与DR1372序列完全一致，说明DR1372外源基因成功导入到了大肠杆菌中JM109.图1 pBI121－1372质粒的构建结果Fig.1 pBI121－DR1372 clone in JM109A －I中M为DL2000 MarkerA:DR1372+Z3质粒电泳条带A:Agar gel electrophoresis of DR1372B:DR1372扩增条带B:Agar gel electrophoresis of PCR productC:DR1372 PCR胶回收验证C:Agar gel electrophoresis of DNA extractionD:pBI121质粒提取验证D:Agar gel electrophoresis ofpBI121E:DR1372双酶切电泳图E:Agar gel electrophoresis of DR1372 digested productsF:DR1372双酶切后胶回收电泳图 F:Agar gel electrophoresis of DR1372 digested products，extractionG:pBI121双酶切电泳图G:Agar gel electrophoresis of pBI121 digested productsH:pBI121双酶切胶回收验证 H:Agar gel electrophoresis of pBI121 digested products，extractionI:JM109菌落PCR验证 I:1:positive control;2:negative control;3－10:PCR products of JM109 with pBI121－DR1372 clone3.2 DR1372－GV3103植物表达载体的构建将测序正确的JM109单菌落质粒转化GV3103感受态，得到的单菌落进行菌落PCR验证，结果如图2.由图2可以选择1－2、4－6号保菌做浸染拟南芥用，阳性率为66.67%.图2 DR1372－GV3103的菌落PCRFig.2 Analysis of DR1372－GV3103M:DL2000 maker，9:阳性对照，10:阴性对照，1 －8:单克隆菌落PCRM:DL2000 Marker;9:positive control;10:negative control;1－8:PCR products of GV3103 with pBI121－DR1372 clone3.3 转DR1372基因拟南芥体系的建立及抗性植株的获得3.3.1 转DR1372基因拟南芥体系的建立利用花序浸染法侵染拟南芥未开花的花序，待拟南芥角果成熟后收取种子(浸染到收取种子的过程如图3所示).将收取的种子用50 mmol/L卡那霉素筛选，得到30株抗卡拉霉素的幼苗，提取抗性幼苗DNA，进行PCR检测，然后得到10株转DR1372基因的阳性拟南芥苗，待成熟后收种T1代种子.对T1代种子进行进一步筛选，得到纯合的转基因阳性植株T2代，T2代得到阳性苗60株，经PCR检测后得到纯合阳性植株22株，阳性率为36.7%.3.3.2 阳性植株的PCR检测对具有卡那霉素抗性的转化植株提取DNA，进行PCR扩增和电泳检测，其电泳的部分结果如图4所示，共检测出12株拟南芥有清晰的495bp大小的扩增条带，说明外源DR1372基因成功转入到野生型拟南芥中.图3 转DR1372基因拟南芥体系的建立Fig.3 Regeneration of transgenic ArabidopsisA:花序浸染后拟南芥 B:50MKan筛选T1代抗性苗 C:T1带抗性拟南芥幼苗 D:T1抗性拟南芥代成株子E:筛选T2代抗性苗 F:T2代抗性拟南芥幼苗G:T2代抗性拟南芥成株A:the impregnated Arabidopsis B:resistant shoots of T1generation C:T1generation Arabidopsis seedlingD:the mature plant of T1generation E:resistant shoots of T2generation F:T2generation Arabidopsis seedlingG:the mature plant of T2generation图4 转DR1372基因拟南芥PCR检测Fig.4 PCR test of DR1372gene in transgenic plantsM:DL2000 maker;1:阳性对照;14:阴性对照(野生型);2－13:抗性植株M:maker;1:positive control;14:Negative controls(WT);2－13:Transformed plants3.4 转DR1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应当转DR1372基因拟南芥T2代和非转基因植株种子发芽生长至第3片叶时，分别添加0、100、200、250和300 mmol/L的NaCl溶液.NaCl胁迫7d后，转DR1372基因拟南芥植株与非转基因植株的生长发育状态发生了很大的变化，并且相同浓度下转基因植株与非转基因植株的萎蔫程度也有着明显的差别(如图5).当NaCL胁迫浓度为100 mmol/L时，非转基因植株叶片开始黄化，盐环境已经对拟南芥的生长产生抑制，而转基因植株未受影响;当NaCL浓度达到200 mmol/L 时，非转基因拟南芥的叶片和茎部黄化程度加重，植株开始萎蔫，同时转基因植株部分叶片也出现黄化;当NaCL浓度达到250 mmol/L时，转基因拟南芥植株与非转基因植株都出现了不同程度的萎蔫死亡，但非转基因植株萎蔫程度要比转基因植株严重;当NaCL浓度达到300 mmol/L时，非转基因拟南芥绝大部分萎蔫死亡，转基因植株虽然叶片和茎部出现萎蔫发紫，但死亡程度较小，部分植株仍能正常生长存活，说明转基因拟南芥有一定的抗盐能力，盐胁迫环境下下，DR1372基因在一定程度上调控了植株度过盐环境.图5 转DR1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应Fig.5 Growth of transgenic and wild type Arabidopsis seedlings treated with different concentrentions of NaCL4 讨论近几年许多与植物抗旱耐盐相关基因被克隆和分析，同时通过转基因技术将这些基因转入到植物中进行异源表达，能显著提高转基因植物的抗旱耐盐能力.其中转录因子通过与相关基因的特异性结合来调控其表达，进而产生相关调控蛋白等物质增强植物在逆境中的生存能力［12］.DR1372基因的蛋白中有WHy结构域，这结构域是通过对HIN1蛋白进行分析鉴定的一种独特的结构域.Francesca D、Ciccarelli、Peer Bork［9］等人研究表明，WHy结构域在植物中具有抗水分胁迫和高敏反应等干燥应答功能.WHy功能域作为一种干燥响应蛋白，在国内的研究中外鲜有报道，在植物体内的抗水分胁迫应答机制中，是WHy功能域独自发挥了作用还是能够识别某些特定的序列而协同发挥响应，这一问题有待进一步探究. 对转化了DR1372基因的大肠杆菌进行定性分析发现，逆境下的大肠杆菌中细胞膜很稳定，其细胞膜调节细胞内外渗透压的能力很强.由此推断，将DR1372基因通过基因工程手段转入植物中，该基因可能会提高植物抗旱性，以此为基础通过培育抗旱品种，以降低干旱对农作物产量的影响.拟南芥是转基因最好的模式植物，由于其基因高度纯合，并且自花授粉，能够快速鉴定基因的相关作用.本研究通过基因工程手段成功将外源基因DR1372转入了拟南芥基因组中.实验中构建了DR1372－pBI121载体，载体上带有一个GUS基因，以及CaMV35S强启动子和NOS终止子，能够稳定调控DR1372基因在植物中的表达.利用冻融法将植物表达载体DR1372－pBI121载体导入农杆菌GV3103，最后利用根癌农杆菌介导法成功将外源基因DR1372整合到拟南芥.对DR1372基因拟南芥幼苗进行盐胁迫反应，发现转基因植株与非转基因植株在盐胁迫反应过程中，当NaCL浓度较小时，虽然植株的生长都受到了抑制性影响，但转DR1372基因拟南芥植株的抑制作用明显小于非转基因植株，当浓度达到300 mmol/L时，非转基因植株基本萎焉死亡，而部分抗性植株仍能存活生长，说明DR1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性.本实验通过基因工程手段，成功得到转DR1372基因阳性植株，盐胁迫处理发现阳性植株比非转基因植株有更强的耐盐功能，这为后续该基因或类似功能基因的抗旱、抗盐性研究提供了丰富的植物材料和理论依据.参考文献:［1］李晓慧，董明伟，刘康.植物抗旱基因及其功能研究进展［J］.江苏农业科学，2009，5(4):73－77.［2］Pilon－Smits E A H，Ebskamp M J M，Paul M J，et al.Improved performance of transgenic fructanaccumulating tobacco under drought stress［J］.Plant Phyiol，1995，107:125 －130.［3］Kishor P B K，Hong Z，M iao G，Hu C A，et al.Overexpression of pyrroline carboxylase synthase increase proline production and confersosmotolerance in transgenic plants［J］.Plant Physiol，1995，108:1367 － 1394.［4］Capell T，Escobar C，Liu H，et al.Overexpression of the oatarg in inedecarboxylase cDNA in transgenic rice affects normal development patterns in vitro and result in putrescine accumulation in transgenic plants ［J］.Theor Appl Genetics，1998，97:246－254.［5］Chen J.and Wang Z.Y.Progress in the study of plant mybtranscription factors，Zhiwu Shengli Yu Fenzi Shengwuxue Xuebao(Journal of Plant Physiology andMolecular Biology)，2002，28(2):81 －88.［6］Anderson，A.W，Nordon，H.C，Cain，R.F.，et al.Studies on a radio－resistant micrococ－cus.I.Isolation，morphology，cultural characteristics，and resistance to gamma radiation［J］.Food Technol，1956，10:575 －578.［7］White O，Eisen J.A，Heidelberg J.F，et al.Genome sequence of the radio－resistant bacterium Deinococcus radiodurans R1［J］.Science，1999，286:1571 －1577.［8］Cominelli E，Sala T，Calvi D，et a.l Over exp ression of theArabidopsis AMYB 41 genealters cell expans ion and leaf surface permeability［J］.Plant Journal，2008，53(1):53 －64.［9］Francesca D.Ciccarelli and Peer Bork .The WHy domain mediates the response to desiccation in plants and bacteria［J］.Discovery Note，2005，8:1304 －1307.［10］Ingram J，Bartels D.The molecular basis of dehydration tolerance in plants［J］.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1996，47:377－403. ［11］刘广宇，魏令波，陈吉龙，等 .植物脱水素研究进展［J］.生物工程进展，2001，21(2):35－38.［12］陈丽萍，何道一.植物抗旱耐盐基因的研究进展［J］.生物工程进展，2010，29(3):542－549.。
农杆菌花序侵染的方法
我们一般采用：花序浸染法转化拟南芥（1）种植：选择吸水性好，土质松软的至石配合营养土（1：）作为拟南芥种植土壤。
直径9cm的花盆，每盆播种20-30颗。
播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。
（2）去顶：在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。
适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。
（3）配制浸染液：在5%的蔗糖溶液中重悬农杆菌使OD=0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。
100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染，2-3个花盆（9cm）植株。
在浸染之前加入表面活性剂至浓度0.05%（500ul/L），如果产生表面活性剂的毒性现象（浸过部分发黄或死亡），将浓度降至0.02%。
戚老师实验室用十万分之一（50ul/L）（4）浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中2-3s，同时轻轻旋转。
（5）暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。
（6）浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。
（7）种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。
（8）转基因种子筛选：在含有Kan抗生素的平板上培养浸染后所得种子。
40mg的种子大约200颗于含kan 10-50μg/ml的0.5×MS培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。
根据生长状况判断是否为转基因种子。
成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。
非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡。
（9）转基因植株转土栽培。
转基因种子在MS+kan平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。
2.5转基因拟南芥纯合子筛选由于农杆菌介导的花序浸染法只能将目标片段整合到一条DNA单链上，为后续生理性状实验需要，将T0代转基因种子培育至T2代，利用抗性筛选得到纯合子。
根据杂合子在发生性状分离时会产生野生型后代，而野生型种子不能在MS+Kanr（50μg/ml）平板上正常生长，进行转基因植株纯合子的筛选。
拟南芥（Arabidopsisthaliana）遗传转化实验技术原理
拟南芥（Arabidopsisthaliana）遗传转化实验技术原理拟南芥是植物领域应用较为广泛的模式生物。
由于具有较小的基因组（135 Mbp），生命周期短，可以在多种环境下生长，一直被视为研究植物遗传学、进化、种群遗传学和植物生长发育的系统。
农杆菌介导的蘸花法是目前相对成熟、应用较为广泛的拟南芥稳定遗传转化方法。
转化步骤大致如下：拟南芥（T0代）的花序浸没在一定浓度的含有目标转化质粒的根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）（常用的根癌农杆菌菌株为GV3101）悬浮液中，然后放在一定条件下进行培养（图1 a-e）。
待植物成熟后收集T0代植物的种子，将这些种子放在含有特定抗生素的培养基上进行生长筛选（图1f），获得阳性植株。
与其他植物转化方法相比，蘸花法需要较少的人力和专用试剂，所需设备相对简单且转化效率较高（在优化的条件下大于1%）（1）。
图 1. 拟南芥蘸花法简要过程（2）。
拟南芥瞬时转化常用的有农杆菌介导的叶片转化、基因枪轰击和聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化等方法。
拟南芥的瞬时转化为研究启动子活性、蛋白的亚细胞定位和蛋白相互作用等提供了支撑。
参考文献：Ghedira R.; et al.(2013) The ef f iciency of Arabidopsis thaliana f loral dip transf ormation isdetermined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotypeof the dipped plant. Moecular Plant Microbe Interaction, 26(7), 823-832.Zhang, X.; et al.(2006). Agrobacterium-mediated transf ormation of Arabidopsis thaliana using thef loral dip method. Nature Protocols, 1(2), 641-645.。
拟南芥的遗传转化技术
拟南芥的遗传转化技术1种子消毒处理用70%的乙醇浸泡2分钟，用15% （体积比）NaClO溶液旋转洗涤10分钟，无菌水漂洗5次。
2播种和移栽用无菌水重悬浮消毒处理的种子，均匀分散到1/2MS固体培养基表面上，培养皿倒置，4°C春化两天，25°C正置暗培养一天，再置于22°C的组织培养室中正常培养。
待苗长至四片叶子时，将其移栽到营养土中，置于22°C恒温环境中，16h光照/8h黑暗培养，初期可适当绕些营养液。
3拟南芥幼苗修剪植株长出顶生花序时，去除其顶生花序，以刺激腋生花序的生长，注意避免伤及腋生花序。
准备侵染前，剪除角果以及开放过的花朵。
4拟南芥的遗传转化4.1农杆菌感受态细胞的制备及转化(1)取-80℃超低温冰箱中保存的农杆菌菌株GV3101，在（含50mg/LRif和100mg/L Kan)的YEB培养基平板上划线，28℃培养约36-48 h。
（单菌落）(2)挑取单菌落GV3101接种于5ml LB液体培养基（含50mg/LRif和100mg/L Kan)中，28℃200rmp/min振荡培养过夜；（活化）(3)取2ml菌液转入100ml LB液体培养基(含50mg/LRif和100mg/LKan)中继续培养至OD600=0.5；（增殖培养）(4)转入50ml无菌离心管中，冰浴30min，4℃，4000r/min离心10min，弃上清；(5)加入10ml预冷的150mmol/L NaCl重悬菌体；(6)4℃，4000rmp/min 离心10min，弃上清；(7)加入1/10体积预冷的50 mmol/L CaC12重悬菌体；(8)分装于无菌l.5ml离心管中，100ul/管，4℃保存备用；取1ug提取纯化的重组质粒DNA，加入200u1感受态细胞中，混匀；(9)冰浴10min，转入液氮冷冻5min，迅速置于37℃水浴，热激5min；(10)加入500ul LB液体培养基，28°C，200rmp/min振荡培养2-3h；(11)5000r/min 离心2min，弃上清；(12)剩余菌液(残留100ul左右)用移液器反复抽吸悬浮，然后均匀涂布于LB平板(含50mg/L Rif，100mg/LKan)表面，28℃培养2-3d。
拟南芥蘸花法
农杆菌蘸花转化拟南芥法1、将低温保存的带有表达载体的农杆菌菌株，分别在对应抗性平板上划线，挑取单菌落接种于5ml的已加入对应抗生素的液体LB培养基中，28℃下250rpm振荡培养18-24h；2、然后相同条件下按照1:100接种扩大培养，总菌液体积为200ml，直到OD600值在0.8-1.0范围内；3、离心沉淀并去上清液，用等体积的5%的蔗糖溶液重悬菌体，在菌液中加入0.02%-0.04%的SilwetL-77混匀；4、将拟南芥的花序在菌液中蘸取0.5-1min即可(在转化前要先将拟南芥的角果剪掉);5、然后将拟南芥苗放置于黑暗，湿润的条件下16h，一周后，重复侵染一次；6、收种后种植后代，向12d的幼苗上喷洒54mg/ml除草剂或在将种子播种于抗性MS平板上以筛选阳性植株。
拟南芥播种1、将拟南芥种子用50%的84消毒液表面消毒6-8 min，继而用无菌水漂洗3次;2、在0.1%琼脂糖中悬浮，然后播种在抗性的MS培养基上，4ºC低温避光处理2天后，转入光照培养室生长。
3、幼苗7d左右便可筛到阳性植株，并移栽到含有蛭石的营养土中继续生长（蛭石：营养土=1：3）。
植株种植的培养箱维持22℃恒温和16h光照/8h黑暗培养的循环培养条件。
注：几种常用抗生素的工作液浓度Kanamycin 50μg/mlGentamicin 50μg/mlRifampicin 25-50μg/mlHygromycin 50μg/mlBarstar 25-50μg/ml注：MS培养基配方（1L）MS盐 4.4gMES 0.5g蔗糖10g调PH至5.8-6.0加Agar 10g(在抗性MS培养基上筛选阳性转基因植株时可不加蔗糖防止长菌)42. Schägger H, von Jagow G (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.AnalBiochem166:368–379.。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
制备转化用的农杆菌菌液
准备：
1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。
2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。
1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。
3．步骤：
共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。
28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。
用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。
转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。
2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。
3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。
4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。
5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。
花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥
（2）拟南芥种植
取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。
一周后，选择生长健壮的幼苗移栽到培养土中。
每周浇一次1/2 PNS培养液。
当幼苗长至3-4cm时，去除花序，在去除顶端花序四天后进行转化。
转化前将已经开花授粉的花和种子去除干净。
（3）抽滤法转化拟南芥及阳性苗筛选
1活化农杆菌；
2、以1:50比例转接到200 ml LB培养基中，28℃，2000rpm培养至OD600=1.2-1.6;
3、4000rpm，离心15min，收集菌体；
4、重悬于渗透缓冲液(1/2 MS培养基+5%蔗糖配置后在121℃ 灭菌20 min，加终浓度0.02-0.03% SilwettL-77，振荡混匀)，以重悬渗透液为对照，调节OD600=0.8-1.0；
5、将已授粉、结荚的拟南芥用消毒剪去除，倒置于装有渗透缓冲液的合适大小的容器上侵染50 S，用塑料薄膜覆盖整个托盘并适留通气孔后，在弱光下培养，24h后取下薄膜，于室温中继续培养。
6、约30日后收获种子，将收获的转基因种子用含有0.2%的Triton X-100浸泡10 min；
7、用10%的次氯酸南表面消毒10-12 min；
8、灭菌水冲洗5-6次，每次约2 min；
9、用水将转基因种子置于含50mg/L Kan的MS平板上，4℃暗培养两天；20 mg/L Hyg潮霉素筛选连续暗培养7天；
10、Kan抗性筛选的种子在22℃，16h光照/8h黑夜光周期培养。
两周后，经Kan 抗性筛选的阳性植物表现良好，长势正常，而阴性植物则不萌发或不久死亡。
1 拟南芥的种植
试剂配制
人工土：3份蛭石，1份珍珠岩和1份黑土混合
PNS营养液：
每升含
5ml 1M KNO3，
2ml 1M Ca(NO3)2˙4H2O，
2ml 1M MgSO4˙7H2O，
2.5ml 20mM Fe.EDTA，
2.5ml 1M磷酸缓冲液（pH5.5），
1ml MS 微量元素。
PNS营养液母液配方
①1M KNO3 101.1g
②1M Ca(NO3)2˙4H2O 236.15 g
③1M MgSO4˙7H2O，246.48 g
④20mM Fe.EDTA：
FeSO4 5.57g
EDTA 7.45g
注意先各自配成溶液，在混合。
⑤1M磷酸缓冲液（pH5.5）：
磷酸二氢钾 130.4g
磷酸氢二钾 9.12g
⑥MS 微量元素
硼酸 0.434g
硫酸锰（MnSO4 H2O） 1.7626g
CuSO4˙H2O 0.0798g
ZnSO4˙7H2O 0.172g
NaMoO4˙2H2O 0.0432g
NaCl 0.585g
CoCl˙6H2O 0.00129g
以上母液均配至1L
种植步骤
将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上。
两天后光照，三天后揭膜。
人工培养室条件：相对湿度80%，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8 h黑暗﹑16 h光照培养。
2 拟南芥的转化
试剂配制
渗透培养基（一升中）：1/2xMurashige-Skoog；5% 蔗糖；0.5克 MES；用KOH 调至pH5.7；再加：10微升1mg/ml的6-BA 母液；200微升Silwet L-77）
注意：6-BA 母液配制时用乙醇溶解。
1/2xMurashige-Skoog是用MS的基本组分配制，但大量元素减半。
另：经转化的拟南芥，种子收获后需在相应的抗性平板上筛选转化子
转化步骤
(1) 制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液O.D600当在1.2到1.6之间。
(2) 室温5000rpm离心15分钟。
(3) 弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使O.D600在0.8左右。
(4) 将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株（或用抽真空的方法），盖上透明的塑料盖子或保鲜膜以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。
(5) 一周后再喷洒一次，方法同上。
3 转化子的筛选
(1) 种子消毒：先用70%乙醇浸泡10分钟，在上述处理时要不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次，在这步处理时最好也不时地使种子悬浮。
注意：用乙醇浸泡的时间不宜过长！
(2) 处理后的种子用Top agar（0.1%琼脂水溶液）均匀涂布在固体筛选培养基表面。
一块150mm直径的平皿最多种1500棵。
(3) 4℃春化2到3天，移入22℃恒温室培养。
(4) 观察种子在固体筛选培养基上生长情况,可确定为转化子时,将转化子移栽
至浇过饱和PNS营养液的人工土壤培养。