4第四章半薄切片法和超薄切片法
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②可以保存组织、细胞中很多化合物(蛋白质、 核酸)很少变性。
③可以保持细胞的酶活性，所以由GMA制成 的切片也适合做组织化学、酶活性和荧光显微观 察。
④染色时无需把塑料去掉，便可以直接染色。
➢GMA混合包埋剂的配方
GMA
93g
聚乙二醇400 (增塑剂) 7g
过氧化苯酰 （加速剂） 0.6g
➢渗透与包埋 浸透 1、GMA混合液和无水酒精或丙酮（1：1），
小麦叶片的显微结构（半薄切片）
小麦叶片的显微结构（石蜡切片）
植物材料的超薄切片技术
▪取材
材料大小： 1mm3大小的小块。太大固定液 不易透入，造成材料的内外固定不均一；太 小则材料受损伤的比例增高。
在取材时要注意两个方面： 1. 切取后的组织应立即放入固定液中进行 固定。 2. 要使试验和对照的取材严格一致。
两天，然后用清水冲洗数次，再用蒸馏水洗涤。 ②干燥后用砂轮刻一圈痕迹放入棕色磨口玻璃
瓶中，加盖后用力摇动，使安培瓶破碎。 ③按比例加入蒸馏水或缓冲液。 配好的锇酸溶液密封后存放在2—4℃的冰箱中，
至少要经过24小时的熟化后才能使用。
ห้องสมุดไป่ตู้材料固定 采用戊二醛和锇酸双重固定法。 1、将材料切成0.5—1.0 mm3的小块。 2.前固定 把材料浸入戊二醛固定液中，
▪切片 ➢制刀
超薄切片和半薄切片都需用玻璃刀切片，玻 璃刀可用制刀机制作，也可手工制作。 ➢组织块的修整和切片
1.将包埋块夹在样品夹上，有材料的一端向 上，在解剖镜下修整.
2.把初步修整好的组织块装在切片机夹物部 上，再进一步修整使材料略露出。
3.在玻璃刀上进行半薄切片，每切一片后直 接用细毛笔尖从刀口上取下放在有水滴的载玻 片上展片。
采用各级酒精或丙酮，在室温条件下，按30 ％→50％→70％→85％→95％→100％→100％ 逐级脱水，每级需30分钟，但在纯酒精中每次 则需停留1—2小时。
▪渗透与包埋 乙二醇甲基丙烯酸脂包埋法
(glycolmethacrylate以下简称GMA)。 ➢GMA的性质
①水溶性塑料包埋剂，凝固后可以很容易被 切成1—2µm的薄片。
抽气后固定2—4小时或在冰箱中过夜。 3.洗涤 倒掉固定液，用0.1M磷酸缓冲液
(pH7.3)洗涤3—4次，每次15—20分钟。
4.后固定 将材料投入1％锇酸固定液中， 在4℃冰箱中固定1—4小时。
5.洗涤 倒掉固定液（放入专用回收瓶）， 用0.1M磷酸缓冲液洗涤4次，每次15—20分钟。 ▪脱水
④锇酸分子量大，造成渗透缓慢。 ⑤对核酸和糖原的保存作用很差。 锇酸大都封装在安培瓶中，为淡黄色晶体， 是一种强氧化剂。新鲜的锇酸溶液颜色为 浅黄，如果贮存时间太长或容器不干净， 溶液很快还原成黑色而失效。
2.锇酸配制方法 锇酸一般包装为0.1g，0.25g，0.5g，1g安培瓶，
常配成2％的锇酸溶液。 ①将安培瓶洗净，最好在洗液中浸泡数小时到
采用醋酸铀和柠檬酸铅的双染法。
➢铜网和支持膜 1、铜网：超薄切片要放在铜网上才能进
超薄切片机
➢展片与粘片 展片时，放在70℃的温台上展片(包埋剂不必除
去，它本身与玻璃还有一定的粘着力，一般也不 必使用粘着剂)。 ▪染色
染石蜡切片的染料都可以用来染GMA薄切片。以 甲苯胺蓝-O为例来说明染色程序。
1.将甲苯胺蓝染液滴在载玻片的材料上染色 1—2分钟。
2.蒸馏水清洗。 3.室温下干燥。 4.树胶封片。
植物材料的半薄切片技术 ▪固定液 ➢戊二醛固定液
1.固定液的特性 ①能和蛋白质分子的氨基和肽键很快交联而 起到稳定蛋白质的作用，对组织的渗透力强。 ②对锇酸不能固定的糖原和某些蛋白结构如 微管有很好的保存作用，对核蛋白的固定也比 锇酸好。 ③戊二醛对脂类的保存很差，也不能使细胞 产生足够的反差。
2.戊二醛固定液的配制：
0.2M磷酸缓冲液（ml） 50 50 50 50 50
（最终浓度为0.1M）
25%戊二醛（ml） 8 10 12 16 20
蒸馏水（ml）
42 40 38 34 30
戊二醛最终浓度（%）2 2.5 3.0 4.0 5.0
➢锇酸固定液 1.锇酸的特性 ①不但能够固定蛋白质，同时对一些脂类 具有很好的固定作用，因此锇酸能将戊二 醛未能固定的组织加以固定。 ②锇是重金属，用锇酸固定的细胞可以增 加电子反差。 ③锇酸不使细胞收缩、膨胀、变脆、变硬 等优点，用它固定的材料切割性能好。
动边一滴滴加入DMP-30，每加一滴充分搅拌后， 再加下一滴，一般要搅拌半小时以上。
➢渗透： (1)材料入丙酮：包埋剂=3：1的混合物中2小时。 (2)丙酮：包埋剂=2：2的混合物中2小时。 (3)丙酮：包埋剂=1：3的混合物中2小时。 (4)转入纯包埋剂中过夜。
➢包埋：将材料转入包埋板中，放好标鉴，注满纯包 埋剂，放入37℃温箱中过夜。 ➢聚合：将包埋板放入60℃温箱中聚合24—48小时。 ▪切片和染色
15分钟 15分钟 15分钟 15分钟 15分钟 30分钟 30分钟
▪渗透、包埋与聚合
包埋剂Epon8l2混合物可按下列配方去配制：
春、秋季 夏季 冬季
(ml)
(ml) (ml）
Epon812
13
13
13
DDSA(软化剂) 8
7
10
MNA(固定剂)
7
10
1-8
DMP-30(加速剂) 15滴 15滴 15滴 前三种药物按顺序混合后搅拌均匀，然后边搅
▪固定
采用戊二醛和锇酸双重固定法。 (1)将材料投入2.5％戊二醛固定液中，室
温下固定2小时。 (2)倒去戊二醛固定液，材料用0.1M磷酸缓
冲液冲洗三次，每次放置30分钟。 (3)用2％锇酸在4℃冰箱中固定2—4小时。 (4)用磷酸缓冲液冲洗[同(2)]。
▪脱水
(1)30％丙酮 (2)50％丙酮 (3)70％丙酮 (4)80％丙酮 (5)90％丙酮 (6)100％丙酮 (7)100％丙酮
10—12小时。 2、纯GMA包埋剂替换3次，每次24小时。 3、以上步骤均在0—4℃冰箱中进行。 包埋 先在多孔橡胶模板中注入少量的包埋
剂，后用牙签将材料挑起放进模板中，然后注 满包埋剂，放上标签。
聚合 将模板放入温箱中，按40℃ 1天， 50℃ 1天，60℃ 1天的顺序升温聚合。
橡 胶 包 埋 板
③可以保持细胞的酶活性，所以由GMA制成 的切片也适合做组织化学、酶活性和荧光显微观 察。
④染色时无需把塑料去掉，便可以直接染色。
➢GMA混合包埋剂的配方
GMA
93g
聚乙二醇400 (增塑剂) 7g
过氧化苯酰 （加速剂） 0.6g
➢渗透与包埋 浸透 1、GMA混合液和无水酒精或丙酮（1：1），
小麦叶片的显微结构（半薄切片）
小麦叶片的显微结构（石蜡切片）
植物材料的超薄切片技术
▪取材
材料大小： 1mm3大小的小块。太大固定液 不易透入，造成材料的内外固定不均一；太 小则材料受损伤的比例增高。
在取材时要注意两个方面： 1. 切取后的组织应立即放入固定液中进行 固定。 2. 要使试验和对照的取材严格一致。
两天，然后用清水冲洗数次，再用蒸馏水洗涤。 ②干燥后用砂轮刻一圈痕迹放入棕色磨口玻璃
瓶中，加盖后用力摇动，使安培瓶破碎。 ③按比例加入蒸馏水或缓冲液。 配好的锇酸溶液密封后存放在2—4℃的冰箱中，
至少要经过24小时的熟化后才能使用。
ห้องสมุดไป่ตู้材料固定 采用戊二醛和锇酸双重固定法。 1、将材料切成0.5—1.0 mm3的小块。 2.前固定 把材料浸入戊二醛固定液中，
▪切片 ➢制刀
超薄切片和半薄切片都需用玻璃刀切片，玻 璃刀可用制刀机制作，也可手工制作。 ➢组织块的修整和切片
1.将包埋块夹在样品夹上，有材料的一端向 上，在解剖镜下修整.
2.把初步修整好的组织块装在切片机夹物部 上，再进一步修整使材料略露出。
3.在玻璃刀上进行半薄切片，每切一片后直 接用细毛笔尖从刀口上取下放在有水滴的载玻 片上展片。
采用各级酒精或丙酮，在室温条件下，按30 ％→50％→70％→85％→95％→100％→100％ 逐级脱水，每级需30分钟，但在纯酒精中每次 则需停留1—2小时。
▪渗透与包埋 乙二醇甲基丙烯酸脂包埋法
(glycolmethacrylate以下简称GMA)。 ➢GMA的性质
①水溶性塑料包埋剂，凝固后可以很容易被 切成1—2µm的薄片。
抽气后固定2—4小时或在冰箱中过夜。 3.洗涤 倒掉固定液，用0.1M磷酸缓冲液
(pH7.3)洗涤3—4次，每次15—20分钟。
4.后固定 将材料投入1％锇酸固定液中， 在4℃冰箱中固定1—4小时。
5.洗涤 倒掉固定液（放入专用回收瓶）， 用0.1M磷酸缓冲液洗涤4次，每次15—20分钟。 ▪脱水
④锇酸分子量大，造成渗透缓慢。 ⑤对核酸和糖原的保存作用很差。 锇酸大都封装在安培瓶中，为淡黄色晶体， 是一种强氧化剂。新鲜的锇酸溶液颜色为 浅黄，如果贮存时间太长或容器不干净， 溶液很快还原成黑色而失效。
2.锇酸配制方法 锇酸一般包装为0.1g，0.25g，0.5g，1g安培瓶，
常配成2％的锇酸溶液。 ①将安培瓶洗净，最好在洗液中浸泡数小时到
采用醋酸铀和柠檬酸铅的双染法。
➢铜网和支持膜 1、铜网：超薄切片要放在铜网上才能进
超薄切片机
➢展片与粘片 展片时，放在70℃的温台上展片(包埋剂不必除
去，它本身与玻璃还有一定的粘着力，一般也不 必使用粘着剂)。 ▪染色
染石蜡切片的染料都可以用来染GMA薄切片。以 甲苯胺蓝-O为例来说明染色程序。
1.将甲苯胺蓝染液滴在载玻片的材料上染色 1—2分钟。
2.蒸馏水清洗。 3.室温下干燥。 4.树胶封片。
植物材料的半薄切片技术 ▪固定液 ➢戊二醛固定液
1.固定液的特性 ①能和蛋白质分子的氨基和肽键很快交联而 起到稳定蛋白质的作用，对组织的渗透力强。 ②对锇酸不能固定的糖原和某些蛋白结构如 微管有很好的保存作用，对核蛋白的固定也比 锇酸好。 ③戊二醛对脂类的保存很差，也不能使细胞 产生足够的反差。
2.戊二醛固定液的配制：
0.2M磷酸缓冲液（ml） 50 50 50 50 50
（最终浓度为0.1M）
25%戊二醛（ml） 8 10 12 16 20
蒸馏水（ml）
42 40 38 34 30
戊二醛最终浓度（%）2 2.5 3.0 4.0 5.0
➢锇酸固定液 1.锇酸的特性 ①不但能够固定蛋白质，同时对一些脂类 具有很好的固定作用，因此锇酸能将戊二 醛未能固定的组织加以固定。 ②锇是重金属，用锇酸固定的细胞可以增 加电子反差。 ③锇酸不使细胞收缩、膨胀、变脆、变硬 等优点，用它固定的材料切割性能好。
动边一滴滴加入DMP-30，每加一滴充分搅拌后， 再加下一滴，一般要搅拌半小时以上。
➢渗透： (1)材料入丙酮：包埋剂=3：1的混合物中2小时。 (2)丙酮：包埋剂=2：2的混合物中2小时。 (3)丙酮：包埋剂=1：3的混合物中2小时。 (4)转入纯包埋剂中过夜。
➢包埋：将材料转入包埋板中，放好标鉴，注满纯包 埋剂，放入37℃温箱中过夜。 ➢聚合：将包埋板放入60℃温箱中聚合24—48小时。 ▪切片和染色
15分钟 15分钟 15分钟 15分钟 15分钟 30分钟 30分钟
▪渗透、包埋与聚合
包埋剂Epon8l2混合物可按下列配方去配制：
春、秋季 夏季 冬季
(ml)
(ml) (ml）
Epon812
13
13
13
DDSA(软化剂) 8
7
10
MNA(固定剂)
7
10
1-8
DMP-30(加速剂) 15滴 15滴 15滴 前三种药物按顺序混合后搅拌均匀，然后边搅
▪固定
采用戊二醛和锇酸双重固定法。 (1)将材料投入2.5％戊二醛固定液中，室
温下固定2小时。 (2)倒去戊二醛固定液，材料用0.1M磷酸缓
冲液冲洗三次，每次放置30分钟。 (3)用2％锇酸在4℃冰箱中固定2—4小时。 (4)用磷酸缓冲液冲洗[同(2)]。
▪脱水
(1)30％丙酮 (2)50％丙酮 (3)70％丙酮 (4)80％丙酮 (5)90％丙酮 (6)100％丙酮 (7)100％丙酮
10—12小时。 2、纯GMA包埋剂替换3次，每次24小时。 3、以上步骤均在0—4℃冰箱中进行。 包埋 先在多孔橡胶模板中注入少量的包埋
剂，后用牙签将材料挑起放进模板中，然后注 满包埋剂，放上标签。
聚合 将模板放入温箱中，按40℃ 1天， 50℃ 1天，60℃ 1天的顺序升温聚合。
橡 胶 包 埋 板