2.4.1 基因组文库的构建

基因组文库的构建

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文库

含有某种生物全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。如果文库的容量足够大，就能包含该物种的或改组织全部DNA或RNA（以cDNA的形式）的序列。分为基因组文库和cDNA文库。

基因组文库

含有某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存在一个受体菌的群体之中，这个群体就是这种生物的基因组文库来自于某一物种的基因组，由于该物种所有组织中的基因组均相同，所以基因组文库具有种属特异性，但无组织特异性。

一个理想的基因组文库应该是在克隆群体中包含完整基因组的所有DNA序列，一般情况下一个完整的基因组文库所需的克隆总数应取决于外面基因组的大小以及切割片段的大小。估算基因组文库大小的公式：

N = ln (1-P) ln (1-f)

N为基因组文库必需的克隆数目

P为文库中含目的基因DNA片段的出现概率f为插入片段的大小与全基因组大小的比值

举例

如果要使20kb 大小的基因DNA 片段出现概率达到99%，则构建大肠杆菌（4.6×106）和人类（3×109）的基因组文库应包含的克隆子经验值分别是：

ln( 1-0.99)

ln[1-(2×104/4.6×106)]N human = = 6.9 ×105

ln(1-0.99) ln[1-(2 ×104/3 ×109)]

N E.coli == 1.1 ×103

1、纯化基因组DNA

2、获得含基因组文库的DNA片段

3、与λ噬菌体克隆载体重组

（1）基因组DNA的纯化

真核生物的从细胞核中提取，用蛋白酶和梯度抽提的方法去除蛋白质、脂肪和不需要的大分子物质。

原核生物可直接从细胞中提取

（2）将DNA进行随机切割

方法一：物理学方法，如利用机械力和超声波等方法二：生物化学方法，如限制性核酸内切酶。

根据插入片段的大小，可以选择不同的载体来构建基因组文库载体 Plasmid phageλ cosmid YAC 插入片段(kb) 5 23 45 1000

构建基因组文库的步骤cos cos

左臂右臂 外源 DNA (~20-23 kb)cos

cos 外源 DNA (~20-23 kb)左臂右臂

人基因组DNA

用Sau3A部

分酶切成

20kb左右的

片段20kb左右带粘性末端的片段

λ噬菌体DNA

替换区

用Bam H1酶切

去除替换区

带粘性末端的λ载体臂

将人基因组DNA和λ载体臂混合，用DNA连接酶处理

重组成可以包装大小的λDNA

包装与体外噬菌体组装系统

含有人类基因组DNA的重组

病毒颗粒

BAC文库的构建NotI、SacI 脉冲场凝胶电泳得200Kb左右的大片段DNA

纯化后与载体连接 电转化，将连接产物导入大肠杆菌感受态细胞插有外源DNA片段的BAC载体在含有氯霉素的固体培养基中培养

每一个菌落为带有相同外源DNA片段的单克隆