2.4.1 基因组文库的构建
怎样构建基因组文库
2
1
甲基化酶 人工接头I REI
人 工 接 头 II
REII 与载体相连 3 重 组 cDNA
ds-DNA合 成
与 SalI匹 配 接头相连
NotI酶 切
cDNA的定向插入
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA
ligase
NotI primer/adaptor SalI adaptor
P o ly A 3 1
51
GGG
M o d ifie d o lig o (d T ) P rim e r
F irst-stra n d sy n th e sis c o u p le d w ith (d C ) ta ilin g b y R T
51
GGG CCC
p o ly A
T e m p la te sw itc h in g a n d e x te n sio n b y R T
1) 当反转录酶合成到mRNA模板5’端后,它会在第一 链的3’端加上几个C; 2) 合成的寡核苷酸G与C配对； 3）反转录酶以新合成的cDNA为模板，继续合成第 二条cDNA链； 4）LD PCR—Long Distance PCR
S M A R T M eth o d
P o ly A + R N A
2. Okayama–Berg改进法
该法集中了常规方法和 Okayama–Berg法的优点,第 一条cDNA链合成用常规法， 但在3’-端加尾后，其余步 骤与Okayama–Berg法相同
UC19
1)Pst I 2)TdT+dGTP
GGGG GGGG
Sma I
CCCC
GGGG
生物工程导论
第一章绪论生物工程是生命科学和工程科学的交叉科学。
生物工程学科的任务是促进和实现生命科学的实验室研究成果向应用领域的转化。
1.1生物工程的学科基础以生物科学和生物技术为基础，结合化学工程、机械工程、控制工程、环境工程等工程学科，研究和发展利用生物体系或其中的一部分生产有益于社会的产品或达到一定社会目标的过程工程科学。
生物工程的研究对象包括活的生物体或它们的一部分。
生物工程的任务就是为细胞的生长和目标产物积累创造最好的条件，研究开发最适合的工艺路线和设备,实现工业化生产以满足社会需要.1。
2生物工程的研究领域生物工程的研究领域包括:基因工程、细胞工程、酶工程、微生物工程（发酵工程）及生物分离工程。
1.2.1基因工程DNA是遗传的物质基础，1967年第一个基因工程产品—-人胰岛素通过定位突变的方法使所表达的蛋白质产物的结构和功能发生变化,根据需要设计新的蛋白质氨基酸序列,已经发展成为一门新的交叉学科-—蛋白质工程。
1.2.2细胞工程细胞是构成包括人类、动物、植物和微生物在内的几乎所有生物的基本单元。
哺乳动物的干细胞(即未分化的细胞）也具有全能性和无限繁殖的能力。
发酵工程和生物分离技术的进步则是提高细胞培养工程和目标产物回收过程效率的可靠保障。
1。
2。
3酶工程几乎所有的酶都是蛋白质，酶又具有催化剂的功能,即能够降低化学反应的活化能、加快反应速率,在反应中不消耗，反应结束时恢复到原来的状态.酶工程是研究酶的分离、提纯及利用酶作为生物催化剂，实现化学转化,合成各种产物或达到人类所需社会目标的工程科学。
酶催化反应的特点是很高的效率和专一性1.2。
4发酵工程发酵工程已经泛指所有细胞(动物、植物、微生物及基因工程细胞）的大规模培养并获得目标产物的过程。
1.2。
5生物分离工程与其他分离过程类似,生物技术产品的分离方法也是根据被分离对象及主要杂质的物理化学性质设计分离提纯流程,但是生物技术产品的分离也具有其特殊性，主要表现：(1）目标产物的浓度低（2）目标产物和杂质的物理和化学性质十分接近，而且成分非常复杂(3)目标产物往往具有生物活性（4）在许多应用领域,生物技术产品有很高的纯度和安全性要求。
基因组文库构建
SI 酶 降 解 发 夹 结 构 末 端 转 移 酶 dGTP 末 端 转 移 酶 加 寡 聚 C CCC CCC GGG GGG 连 接
转 化 E .c o li 扩 增 以 质 粒 为 载 体 构 建 cD N A 文 库
四.大容量克隆载体
基因组作图中使用的高容量人工染色体克隆载体的比较。
载体 YAC( 酵母人工染色体 ) 系统 酵母着丝粒 , 复制起始 点和端粒 克隆容量 200kb ～2Mbp 评价 嵌合 发生 率高 ( 在 基因 组 中不相连的连续片段) ； 不稳定 (自发缺失 )； 很难与酵母染色体分离； 稳定，但在细菌外难以维 持
TTTTTT
TTTTTT AAAAAA
通 过 以 下 途 径 将 cDNA 插 入 载 体 a. 平 端 克 隆 b. 加 接 头 c. 进 一 步 进 行 同 聚：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或 包装后转染宿主细胞。 载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。 重组筛选： 插入载体—通过可见标记的插入失活(cI基 因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈； 现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。
(a) 随 机 六 碱 基 NNNNNN (c)发 夹 引 物
AAAAAAA mRNA (b)寡 聚 (dT)引 物 第 一 条 cDNA 的 合 成 An An Tn (d)同 聚 物 加 尾 反 应
第 二 条 cDNA 的 合 成 TTTTTT GGGGGG CCCCCC 加接头 1 TTTTTT GGGGGG AAAAAA CCCCCC 切除发夹 TTTTTT AAAAAA 加接头 2 TTTTTT AAAAAA 经酶切进行定向克隆 cDNA 克 隆
PAC(P1 人工染色体 ) BAC( 细菌人工染色体 ) MACs( 哺乳类人工染色 体)
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序1. 引言基因组文库构建是现代生物学研究中的重要步骤之一。
通过构建基因组文库，研究人员可以将生物体的基因组DNA进行分离、纯化和扩增，为后续的基因组测序和功能分析提供重要的材料。
本文将介绍一种常用的基因组文库构建程序，并探讨其在生物学研究中的应用和意义。
2. 基因组文库构建程序概述2.1 DNA提取在进行基因组文库构建之前，首先需要从生物体中提取DNA。
DNA提取方法可以根据不同生物体类型和样本来源进行选择，常见的方法包括酚/氯仿法、离心法、商用DNA提取试剂盒等。
2.2 DNA片段化DNA片段化是将长链DNA切割为较短片段的过程。
常用的片段化方法包括限制性内切酶切割、超声波处理、化学法等。
选择合适的片段化方法可以根据后续实验需求和测序平台要求来确定。
2.3 DNA末端修复和连接在片段化后，需要对DNA末端进行修复，并在修复后对连接适配体进行连接。
末端修复可以通过使用DNA聚合酶和DNA连接酶来完成。
连接适配体是一种含有特定序列的DNA片段，可以与测序平台上的引物配对，使得测序引物能够与待测DNA片段结合。
2.4 DNA片段扩增和纯化连接适配体后，需要对文库中的DNA片段进行扩增和纯化。
扩增方法通常使用聚合酶链式反应（PCR）进行，以获得足够数量的文库DNA。
纯化则是通过凝胶电泳、磁珠吸附等方法去除杂质和副产物，获得高质量的文库DNA。
2.5 文库验证和测序最后一步是对构建好的基因组文库进行验证和测序。
验证可以通过凝胶电泳、定量PCR等方法来确定构建文库中的DNA片段长度分布、纯度以及数量。
而测序则可以使用各种高通量测序平台进行，并根据实验目标选择合适的测序深度。
3. 基因组文库构建程序在生物学研究中的应用3.1 基因组结构分析基因组文库构建程序为研究基因组结构提供了重要工具。
通过对不同细胞类型或不同物种的基因组文库进行测序，可以揭示基因组的结构变异、拷贝数变异以及染色质重排等信息，为研究基因组结构与功能的关系提供重要线索。
基因文库的构建与使用
基因文库的构建与使用在生物科学领域，基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。
基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库，它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。
本文将详细介绍基因文库的构建与使用，包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。
一、基因文库的基本概念和作用基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库，它为我们提供了该生物基因组的全面信息。
构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。
基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。
二、构建基因文库的方法构建基因文库主要包括以下步骤：1、基因组文库的构建：首先需要获得该生物的基因组，然后将基因组进行分解，形成一系列重叠的DNA片段。
这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中，形成基因组文库。
2、表达文库的构建：为了筛选出具有特定功能的基因，还需要构建表达文库。
表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达，以便研究者们能够确定基因的功能。
在构建基因文库时，需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。
这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。
三、基因文库的使用方法使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。
以下是如何使用基因文库的一般步骤：1、选择相应的基因文库：首先需要选择包含所需基因的文库。
如果研究目标是寻找特定功能的基因，可以选择包含该功能基因的文库。
2、筛选候选基因：根据研究目标，可以在文库中进行筛查，挑选出可能具有所需功能的候选基因。
3、验证基因功能：通过实验验证挑选出的候选基因是否具有所需功能。
这可以通过表达和检测候选基因在细胞或整体生物中的功能来实现。
4、利用基因文库进行基因组编辑：基因文库也可以为基因组编辑提供资源和指导。
通过比对和分析基因文库中的序列，可以确定目标基因的精确位置和剪切位点，从而实现精准的基因组编辑。
基因组文库的构建和池化筛选
基因组文库的构建和池化筛选综述与专论?生物技术通报BloTECHNoLoGYBULLETIN201O年第5期基因组文库的构建和池化筛选陈献伟娜日苏朱超.王会'雷娜,高剑峰关伟军马月辉(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;2石河子大学生命科学学院,石河子832003;广西大学动物科学技术学院,南宁530004;山西农业大学,太谷030801)摘要:作为物种保护策略的重要部分,建立濒危畜禽的基因组文库,可有效保存濒危畜禽种质资源.BAC(bacterialartificialchromosome)文库具有高容量,遗传特性稳定和嵌合体少等优点,因而被用于畜禽基因组文库的构建.对BAC文库的构建方法和文库池化筛选系统作一综述.关键词:BAC栽体基因组文库池化筛选ConstructionandScreeningofGenomicLibrary ChenXianweitNaRisuZhuChaofWangHuifLeiNa?GaoJianfengGuanWeijunMaYuehui ('InstituteofBeijingAnimalScienceandV eterinary,CAAS,Beijing100193;CollegeofLife Science,ShiheziUniversity,Shihezi832003; CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530004;ShanxiA griculturalUniversity,raigu030801)Abstract:ConstructionofthegenomicLibraryofdomesticanimalasthebasiccompone ntofs peciesconservationstrategycan preserveendangeredanimalgermplasmresourcesefficiently.Beingcapableofinsertinglarg efragments,maintainingthestabilityofin—sertedDNAinE.coli,producingfewchimerismes,BAClibraryhavebeencontributedtorese archesofconstructionofgenomiclibrary. ThispaperdescribedtheconstructionmethodandscreeningsystemofBAClibrary. Keywords:BACvectorsGenomiclibraryPoolingScreening高分子量的DNA文库是基因组研究的基础,如重要经济性状基因的图位克隆,比较基因组研究,基因组测序及物理图谱的构建.BAC载体具有容量大,遗传特性稳定和嵌合体少等优点,非常适合于基因组文库的构建.1BAC文库的研究进展基因组文库是利用DNA重组技术将某种生物细胞的核DNA的全部或大部分片段随机地连接到克隆载体上,之后转移到适当的宿主细胞中,通过细胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集.基因组文库构建的关键取决于所使用的克隆载体.自Cohen等构建第一个质粒载体pSC101以来,相继出现了大量的克隆载体.克隆载体大致可分为噬菌体系列和人工染色体系列.前者主要包括质粒(plasmid),噬菌体(bacteriophage),柯斯质粒(cosmid,又称粘粒)等,其主要特点是载体在宿主细胞内能稳定遗传,易分离,转化效率高,但克隆容量有限,一般小于45kb.许多真核生物的基因庞大而复杂,难以克隆到这些载体中.后者主要有酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC),细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)以及可转化人工染色体(TransformationArtificialChromo—some,TAC)和哺乳动物人工染色体(mammalianarti—ficialchromosome,MAC)等,显着特点是载体的容载收稿日期:2009—12-29基金项目:国家科技支撑项目(2006BAD13BOB,2008BADB2B01),转基因重大专项(2008ZX08009-003),国家"863"计划项目(2006AA10Z1982007AA10Z170)作者简介:陈献伟,男,硕士,主要从事分子生物学研究工作;E.mail:****************通讯作者:关伟军,男,教授,博士生导师,主要从事动物细胞分子生物学方面研究工作;E—mail:********************.cn马月辉,男,研究员,博士生导师,主要从事动物遗传资源保护方面研究工作;E—mail:yuehui—**********12生物技术通报BiotechnologyBulletin2010年第5期能力大,约100—350kb.这些具有较大外源片段承受能力的人工染色体对于真核生物基因组文库的构建极为有利.近年来得到广泛应用的克隆载体主要是细菌人工染色体(BAC).细菌人工染色体是在大肠杆菌F一因子基础上发展而来的.F.因子的复制是严谨型的,在每个细胞中仅有1—2个拷贝,这样就减少了质粒所携带的外源片段发生重组的可能性,而且F.因子能携带的外源片段可达1mb,表明F一因子更适合于克隆大片段的DNA.BAC克隆体系的第一代载体pBAC108L(图1).pBAC108L能克隆的外源片段可达300kb,但它存在的一个问题是只有10%一50%的转化子是重组子.自从BAC载体问世以来,出现了许多目的在于增加易用性和用于特定系统和环境的修饰.pBeloBAC11和pBACe3.6是对pBAC108L进行修饰构建的载体,通常作为进一步修饰的基础载体(图2).pBeloBAC11代表了第二代的BAC克隆系统,也是应用非常广泛的一种BAC载体.其外源DNA片段的容量最大可至300kb以上,可应用于基因组文库的构建工作.主要特点是在pBAC108L的多克隆位点上增加了LacZ基因,可用于蓝白斑筛选.然而pBeloBAC11仍是低拷贝质粒.T7—?'_SP6SalINotIBHNotI卜口_[卜卜—)—EcoRV图1pBAC108L载体H/ndmBamHIrepE图2pBeloBACll载体Frengen等构建了pBACe3.6载体(图3).pBACe3.6是在pBAC108L的基础上构建的,但比pBeloBAC11修饰程度高.此外,它利用了不同于pBeloBAC11蓝白斑选择的另一选择机制,其多克隆位点位于蔗糖致死基因sacB上,这样重组克隆可以在含有蔗糖的培养基上进行阳性选择.OCM(R)mHIfl1lCIIf811c0RInO,SacIf2O)胁II(221PUC—LINKLI(766)LI(2012)ApaLI(2509)南R322NotI(2850)图3pBACe3.6载体1997年,Hamilton等"结合根癌农杆菌双元载体和BAC载体的特点,构建了一种"双元BAC载体(abinaryBAC)",即BIBAC.BIBAC作为第三代文库载体,不仅具有第二代载体的特征,而且有植物2010年第5期陈献伟等:基因组文库的构建和池化筛选转化的功能.BIBAC转化技术在双子叶植物中已经建立,Hamilton等'通过农杆菌介导的方法把克隆在BIBAC2中的完整的150kb大小的人类DNA片段转进了番茄和烟草.TAC(transforma.petentartificialchromosome)也是一种直接用于转化的人工载体.1999年,Liu等结合PAC载体和双元载体的特点,构建了植物可转化基因人工染色体TAC载体Pyltae7和Pyhac17.TAC载体能在大肠杆菌和根癌农杆菌中以单拷贝形式复制.目前,已有人和一些哺乳动物的基因组DNABAC文库建成,如猪",牛,大熊猫"和鲶鱼H等动物.通过BAC文库的构建,不仅长久而有效地保存动物基因遗传资源,而且,为进一步研究,开发和利用其与重要经济性状,生殖和遗传性疾病相关的功能基因,提供可靠的基因材料平台.2BAC文库的构建方法基因组DNA文库的构建流程相对简单,但其需要很多特殊的处理以及必要的仪器设备,成功的关键都体现在操作的细节上.BAC文库的构建过程包括以下几个步骤.2.1BAC载体的制备载体制备的好坏,直接关系到文库中空白载体的比例和文库的质量,载体的纯度越高,获得阳性克隆的概率越高,文库的质量也越好.采取酶切的同时进行彻底的脱磷处理,以减少或避免空白载体的比例,保证其符合建库要求.载体的制备主要包括BAC载体的大量提取和纯化,CsCL.EtBr密度梯度离心纯化得到的超螺旋质粒,BAC载体的后期处理(酶切和去磷酸化),载体脱磷效果检测,载体自连回收.2.2高分子量(HMW)DNA的制备由于构建BAC文库需要得到尽可能完整的大片段DNA,因此,首先要保证将细胞核包埋在琼脂糖凝胶块中的质量,即细胞核的质量和浓度,琼脂糖凝胶的浓度等.而且如果是组织样品,一般使用液氮将组织捣碎,并在整个研磨过程中使组织浸泡在液氮中,然后包埋在低熔点琼脂糖中形成"Plugs",以此来保护核DNA免受降解.2.3高分子量DNA的不完全消化高分子量DNA的不完全消化的目的使通过限制性内切酶的不完全消化,产生大量比较适合和集中的片段,一般通过脉冲场凝胶电泳进行两次片段选择'.DNA的分离一般有一次尺度选择和二次尺度选择(尺度选择即脉冲电泳),在脉冲场电泳条件下,由于不同分子量的DNA片段发生"共迁移",在大片段中混有很多小片段DNA,而这些小片段DNA 在连接过程中效率要明显高于大片段DNA,从而影响基因组文库的构建质量.二次尺度选择法得到的DNA连接转化效率较高,转化后插入的片段整齐度好,空载率低.为了获得纯度高,含量多的大片段,减少大片段的降解,同时又尽可能的去除小片段,采用二次尺度法进行大片段DNA的分离,按照部分酶切所确定的最佳酶用量,对基因组Plugs进行大量酶切,然后进行脉冲场电泳.2.4大片段DNA和载体的连接大片段DNA能否有效地连接到载体上,主要取决于插入片段与载体的比例,对于不同的生物采用的比例不同,大部分处于1:5—15(摩尔比)范围.2.5将连接产物转化入受体细胞对于转化大肠杆菌而言,电转化是目前使用最普遍的一种方法.研究表明,文库中载体的平均插入大小主要与转化效率相关.插入片度越大,转化效率越低;反之,越高.此外,转化条件也直接影响转化效率,插入片段大小及假阳性克隆的含量.2.6挑选阳性克隆,构建文库阳性克隆的分检有人工和使用机器手技术两种.一般通过lacZ的插入失活,显示蓝白斑的负同选择来筛选重组子,但是在基因组文库构建中常常发现有1%一10%左右的假阳性,用机器人操作时假阳性更高.现在又产生了正向选择的BAC载体pBACe3.6,pBAC/SACB¨,利用sacB的插入失活,产生的零背景可使机器人进行挑选重组子时不必进行菌落间的分辨,便于自动挑取收集.2.7文库的保存管理与质量检测文库构建完成后,还需要对文库进行评价,其质量的高低标准包括文库中克隆的数量,平均插入片l4生物技术通报BiotechnologyBulletin2010年第5期段的大小,克隆的稳定性,细胞器DNA的含量以及假阳性克隆的含量等.3BAC文库的池化和筛选基因组BAC文库有数万到数十万个克隆组成,因此建立高效的管理和筛选系统是必要的.筛选系统有PCR筛选系统和Southern杂交筛选系统两种.3.1PCR筛选系统建立PCR筛选系统需要对所有的克隆进行保存和池化.整个BAC文库由若干个超级池组成,每个超级池有10个384孔板组成.将一个超级池的行克隆,列克隆和每板的克隆分别合并成池,提取质粒DNA作为第二步PCR筛选的模板,同时将10个板的克隆合并提取DNA,即有了第一步筛选超级池的DNA.对BAC文库进行两步.3D筛选的过程:首先,用目的序列的PCR引物筛选文库的若干个超级池的DNA,得到阳性超级池号;之后用阳性超级池的板池,行池,列池的DNA进行第二步筛选,得到阳性的板池号,行池号,列池号;从冻存的文库中依照筛选结果得出的克隆地址,挑出阳性克隆,再次做PCR验证.Bonet等¨构建了野草莓的BAC文库,共有18432个克隆,存于48块384孔板中,压缩到48个96孔板中.他将每6块96孔板的克隆混在一起,共形成8个超级池.用70个分子标记进行PCR分析,以超级池质粒为模板通过PCR的方法确定含有目的片段的阳性单克隆.Wang等.构建了尖吻鲈的BAC文库,49152个克隆保存在128块384孔板中,由11个超级池构成,每个超级池分成48个96 孔板,对文库进行超级池,板池和行列池3步法筛选,用24个微卫星和15个EST对文库进行PCR筛选表明文库具有较好的基因组覆盖率.3.2HD杂交膜筛选系统一般材料BAC文库库容量都是数以万计,若同时对这些数目庞大的BAC进行分析,非常困难.常规BAC文库的研究一般都是以尼龙膜为载体,用机械手将整个文库顺序点到膜上.将膜在固体培养基上培养一段时间后进行菌落原位裂解,将DNA结合在膜上,再用特异性探针进行Southern杂交筛选阳性克隆.每张膜可容纳50000以上的克隆.一个库用6—7张膜就可以包括.杂交膜筛选缺点是Southern杂交要用到同位素,存在假阳性和污染,放射性元素对人和环境都会产生影响,成本也高.对于功能基因克隆的筛选,用PCR筛选系统得到的结果比从高密度杂交膜筛选系统得到的结果更为可靠,假阳性少,而且方法简单,快速.但是对于构建大区域的物理重叠群,高密度膜杂交筛选阳性克隆可以一次得到一个标记的所有重叠克隆,更有利于快速的构建BAC重叠群.4展望细菌人工染色体(BAC)具有容量大,易于分离和操作等特性,比其它载体系统构建的基因组文库有更高的覆盖率和稳定性.利用BAC文库容量大的特点,进行基因筛选,目的基因定位,表达调控等研究是BAC文库利用的发展方向.BAC文库将在动物基因资源保存,基因组学,后基因组学等研究中发挥重要的作用.参考文献[1]QuiniouSM,WaldbieserGC,DukeMV,eta1.Afirstgeneration BACbasedphysicalmapofthechannelcatfishgenome.JBMCGe? 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DNA文库的构建
真核生物mRNA的结构
2、提取RNA基本步骤
总步骤：裂解细胞、沉淀蛋白、去除DNA、质量分析等； 裂解细胞： 强离液剂：胍盐, SDS, N-laurylsarcosine
(sarcosyl), 尿素, 苯酚 ； 破坏质膜，保持细胞核或细 胞器的完整性 ：如Nonidet P-40 (NP-40)，研磨、蛋白 酶K、蜗牛酶(含纤维素酶、甘露聚糖酶、葡糖酸酶和几丁 质酶等，可破坏酵母菌细胞壁)、SDS等处理； 沉淀蛋白：SDS、β -巯基乙醇、氯仿、苯酚、盐酸胍、异 硫氰酸胍等； 沉淀RNA：乙醇、异丙醇、氯化锂等； RNA质量分析； 从总RNA中纯化分离mRNA； RNA的长期保存。
制备基因组DNA的常用试剂
破碎细胞（液氮研磨、匀浆、超声波破碎） 除去蛋白杂质：（蛋白酶K、SDS、 CTAB、苯
酚）； 除去RNA(RNase A) 除去黏多糖(CTAB); 沉淀DNA（乙醇、异丙醇）； 抑制DNase（EDTA，可以螯合Mg++等）； 脱盐（70%乙醇漂洗）。
关键是对付RNase：措施
为了保证mRNA的完整性，必须使用最新鲜的生物材料， 最好是培养的活细胞，或从活体即刻采集的样品进行制备， 或者置于液氮、超低温冰箱保存的样品；
DEPC处理配置溶液用水：用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯 ，一种很强的RNA酶抑制剂）浸泡处理和高压灭菌；
烘烤玻璃器皿：200-300℃烘烤4小时；塑料器皿：在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底清洗，灭菌，即可去除 RNase；
基因文库的构建
5. 重组 重组cDNA分子的转移和的建立 分子的转移和的建立选用载体为质粒，可直接转化 载体， 选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为 载体，则 ；若为λ载体 需进行体外包装、感染等。 需进行体外包装、感染等。
ds-DNA合成 与SalI匹配 接头相连 NotI酶切
cDNA的段或条件的某种细胞分 定义：
离到的全部mRNA经反转录成 cDNA后再重 经反转录成 离到的全部 后再重 组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。 组和增殖所性
常来自结构基因， 常来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信 且只代表那些正在表达的基因的遗传信息： 息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5% mRNA，80—85% rRNA，10—n(1―p) ln(1―f)
f为某一特定 为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部 为某一特定 （ ） cDNA (mRN1. 载体 载体DNA片段的制备 片段的制备 2. 多聚（A）RNA的分离与纯化 多聚（ ） 的分离与纯化 3. 双链 双链cDNA 的合成
2. 器官特异性
不同器官或组织的功能不一样， 不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的 表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所 表达就具有器官特异性. 代谢或发育特异性
处于不同代谢阶段（或发育阶段） 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结 构基因表达亦不相同
4. 不均匀性在同一个cDNA中，不同类型的cDNA分 中，不同类是大不相同的，尽管它们都是由单拷 贝基因转 贝基因均有相同的克隆数相较，这是两种文 库的另一差别。 库的另一差别。
NotI primer/adaptor
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase
SalI adaptor
基因文库的构建与使用
直接能源
生物体内的直接能源是ＡＴＰ，ＡＴＰ水
解时释放的能量直接用于各项生命活动。而其他形式 的能源物质中所贮存的能量都必须转移到ＡＴＰ中才 能用于各项生命活动。ＡＴＰ与ＡＤＰ之间的转化实现 能量的释放和储存，植物生成ＡＴＰ的途径有光合作用 和呼吸作用，而动物生成ＡＴＰ的途径只有呼吸作用。 １．２主要能源糖类、脂肪和蛋白质等有机物中都含 有大量的能量，这些有机物氧化分解后释放的能量转 移到ＡＴＰ中，用于各项生命活动。但是，生命活动所 利用的能量约７０％是由糖类提供的。所以，糖类是生 命活动的主要能源物质。 １。３储备能源 在生物体内长期贮存能量的物质是 脂肪。脂肪贮存能源的效率最高，１ ｇ脂肪所贮存的能 量是蛋白质和糖类的２倍多，所以在进化过程中，生物 体选择脂肪作为长期贮存能量的物质。 １．４辅助能源 在生物体内的高能磷酸化合物中除 了ＡＴＰ外，还有磷酸肌酸。但是磷酸肌酸中贮存的能 量并不能直接用于各项生命活动，必须转移到ＡＴＰ中 后才能被生命活动利用。反应方程式为：ＡＤＰ＋磷酸
１．１
肌酸Ｉ≯Ａ１＇Ｐ＋肌酸，这个反应进行的速度很快，特别
Ｂ擘
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
基因文库的构建
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体的寡核苷酸链为探针）
2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征）
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA1.制备mRNA凝胶阻滞法
DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于 在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊 的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点， 也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质定长度的DNA片段克隆到某种载体上发育时期所转录的mRNA 经逆转录形成的cDNA片段与某种载体ene pool)：某一生物群体所拥有的全部基因。
4. 筛选目的基因
原核细胞不可用来作为基因的表达系统 （无转录后加工）。
原核细胞基因库——只能用核酸探针杂 交筛选目反转录酶的作 用下将点：
1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸 纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显 示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性 酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）
溶菌、使DNA 暴露
简述基因组文库构建的基本步骤。
简述基因组文库构建的基本步骤。
答:
1、首先从含有目的基因的供体生物的细胞或组织中提纯获得高质量的基因组DNA。
2、用特定的限制性内切酶将含有目的基因的供体基因组DNA切割成许多片段。
3、用能产生互补粘性末端的限制性内切酶将载体(噬菌体)DNA切开并去除其中的填充片段。
4、用专一性强的DNA连接酶将供体DNA片段分别与载体DNA连接(供体DNA片段克隆到载体中)。
5、经包装繁殖而产生重组噬菌体克隆(DNA重组体)，建成供体基因组DNA文库成员。
6、当制备的克隆数多到足以把某种供体生物的全部基因都包含在内时，这些克隆的总体就称为该生物的基因文库。
7、有了基因文库，在分离带有目的基因的DNA重组体时就可以从文库中筛选而不必重复地进行全部操作。
第7章 基因文库的构建
cDNA 只能反映基因表达的转录及加工后的 mRNA 产物所携带的信息 , 也即 cDNA 序列只与 基因的编码序列有关 , 不能反映基因的内含 子 , 也不能反映基因的转录启动子和终止子 等,所以cDNA便于克隆及大量扩增,构建的文 库复杂性低 , 库中总的克隆数较少，则从中筛选
特异基因比较容易，但由于插入片段较 长，以后的分析比较困难。
因为基因组DNA片段是随机克隆的，所以基因组大小除以
克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值，从统计学的角
度分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率 只有50%。当克隆数增A数
细胞中某种mRNA的拷贝数
例如 某细胞的总mRNA数为500500个
如 获 得 丰 度 为 每 细 胞 3500 拷 贝 (14 拷 贝 ) 的 mRNA 基 因 , 应 构 建 的 文 库 的 最 小 值 为 500500/3500 (14) =143 (35750) ;
通常选质粒载体或噬菌体载体。
以 质 粒 为 载 体 构 建 文 库 示 意 图 cDNA
以 λ 噬 菌 体 作 载 体 构 建 cD织中,并 非所有的基因都表达,通常表达的基因 仅占基因总数的15%,产生出约15000种 不同的mRNA分子,因此在mRNA水平上分 离目的基因,可以大大地缩小搜寻目的 基因的范围,降低分离目的基因的难度.
真核生物mRNA分子的3`端有多聚腺核苷酸组成 的poly(A)尾巴，这种特性为分离纯化mRNA分子 提供了方便。
cDNA第一链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成cDNA构建时载体的选择：由于绝大多数真核生物的mRNA00) 个克隆子组成的cDNA文 库中应包含1个如此
panel基因检测原理
Panel基因检测原理详解1. 引言Panel基因检测是一种常用的遗传性疾病筛查方法，其基本原理是通过对特定基因或基因区域进行测序分析，以确定个体是否携带与特定疾病相关的突变。
本文将详细介绍Panel基因检测的原理。
2. Panel基因检测的流程Panel基因检测通常包含以下几个步骤：2.1 样本采集首先，需要从被检测个体中采集样本，通常使用血液、唾液或组织等来源。
样本采集后，需要进行DNA提取和纯化。
2.2 基因组库制备接下来，将提取到的DNA样本进行片段化处理，并在片段的末端添加适配体序列。
然后，将适配体连接到预设计好的探针上，形成文库。
2.3 捕获靶区文库制备完成后，使用探针捕获靶区。
这些探针通常是与目标基因或区域相关的寡核苷酸序列。
当探针与目标DNA序列互补时，会形成探针-DNA复合物。
2.4 高通量测序捕获到的靶区DNA会被进行高通量测序。
高通量测序技术可以同时对多个DNA片段进行测序，大大提高了测序效率和吞吐量。
2.5 数据分析最后，对测序得到的数据进行分析。
主要包括数据质控、比对到参考基因组、变异检测和解读等步骤。
在这些步骤中，需要使用相关的生物信息学工具和数据库来辅助分析。
3. Panel基因检测的原理详解Panel基因检测的原理涉及到文库构建、靶区捕获和高通量测序三个关键步骤。
下面将详细介绍每个步骤的原理。
3.1 文库构建文库构建是Panel基因检测的第一个关键步骤。
其目的是将DNA样本片段化，并添加适配体序列以便后续操作。
文库构建通常包括以下几个步骤：3.1.1 DNA片段化首先，将提取到的DNA样本通过超声波或限制性内切酶等方法进行片段化处理。
片段化后，得到一系列不同长度的DNA片段。
3.1.2 适配体连接接下来，将片段化后的DNA末端修复，并添加适配体序列。
适配体是一种含有特定序列的DNA片段，可以与后续步骤中使用的探针相互作用。
3.2 靶区捕获靶区捕获是Panel基因检测的第二个关键步骤。
第三章基因文库的构建
频率和6Kb
★
G
Chemically synthesized
oligonucleotide
★
Anneal
TCAGGCT
T
★
Wild-type
(1) (1) DNA polymerase + 4 dNTPs
(2) T4 DNA ligase + ATP
正链DNA的合成
按照体外
DNA重组技术,将待突变的DNA片
G
段插入到M13噬菌体上. 然后制备
平末端 连接
加接头造成 粘性末端
细菌转化
重组噬菌体 DNA转染
重组质粒 的转化
体外包装 进行转导
重组体 的鉴定
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切A，把 所得到的大量基因组DNA片段与载体连接， 然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。 是某个生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体。
SI核酸酶处理 Klenow 酶， 连接酶处理
16
一、缺失诱变 2、通过酶切图谱完成中间缺失
17
第三节：克隆DNA序列的体外诱变
二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序
列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的 相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征
由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按 设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在 异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。
(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe; (2) Isolate mutant
基因组DNA测序文库构建
基因组DNA测序文库构建1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。
对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。
对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。
2.用Qubit检测DNA样品浓度。
3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间，体积为130ul。
用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。
4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。
5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ulTE或Elution Buffer洗脱。
回收产物用Qubit测值。
6.修平和磷酸化100ul体系DNA 1ug5 X T4 polymerase buffer 20ulBSA (5mg/ml) 2ulATP (100mm) 1uldNTP（10mm）10ulT4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ulKlenow（10U/ul）1ulT4 PNK (10U/ ul) 1.5ul22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。
纯化后Qubit测值。
7.加‘A’100ul体系DNA 0.5-2.5ug10 X klenow buffer 10uldATP(10mm) 1-3ulKlenow(exon-)（5U/ul）1-3ul37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。
纯化后Qubit测值。
8.连接头200ul体系10 X T4 DNA ligase buffer 20ulPEG4000 30ulATP(100mm) 2ulDNA X接头 YT4 DNA ligase 1.5-2ul加水至 200ulDNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。
基因组快速建库技术
基因组快速建库技术【摘要】基因组快速建库技术是一种快速、高效地构建基因组文库的技术。
本文首先介绍了基因组快速建库技术的原理，包括DNA片段化、连接、转化等步骤。
接着探讨了该技术在基因组学、转录组学、蛋白质组学等领域的广泛应用，以及在快速筛选、分析基因功能等方面的优势。
对基因组快速建库技术的发展现状进行了分析，指出相关技术仍面临一些挑战，如样本处理、数据分析等。
展望了基因组快速建库技术未来的发展方向，包括提高建库速度、降低成本、完善数据处理等方面的努力。
通过本文的介绍，读者将更全面地了解基因组快速建库技术及其在基因研究领域的重要性和发展趋势。
【关键词】基因组快速建库技术、原理、应用领域、优势、发展现状、挑战、未来发展方向1. 引言1.1 基因组快速建库技术概述基因组快速建库技术是一种高效的生物技术手段，能够快速、准确地构建基因组文库，为基因组研究提供重要的支持。
通过基因组快速建库技术，研究人员可以将碎片化的基因组DNA片段按照一定的方法组装成文库，使得基因组的测序和分析工作更加方便和高效。
基因组快速建库技术的发展史悠久，经过不断的改进和创新，现在已经能够在短时间内完成大规模的基因组文库构建工作，为生物学研究和生物工程领域的发展提供了重要的技术支持。
基因组快速建库技术在基因组测序、基因克隆、功能基因组学等领域都有着广泛的应用。
值得一提的是，随着新一代测序技术的不断发展，基因组快速建库技术的应用前景也越来越广阔。
未来，基因组快速建库技术有望在精准医学、生物医药领域发挥更大的作用，推动基因组研究取得新的突破。
2. 正文2.1 基因组快速建库技术原理基因组快速建库技术的原理是利用高通量测序技术，通过将DNA 片段捕获和富集，然后连接到测序适配体系，最后进行测序生成大量序列数据。
这个过程可以分为几个步骤：1. DNA片段捕获：从样本中提取DNA，并将其通过特定的方法进行碎片化，得到DNA片段。
2. 富集：接着，使用特定的引物或探针，将感兴趣的DNA片段进行捕获和富集，排除无关的DNA片段。
BAC文库的构建
BAC文库构建技巧基因组DNA文库构建实验技巧基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。
通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。
一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。
研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。
二、处理基因组DNA根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。
不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。
比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre 的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。
构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。
需要注意：（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。
华大建库流程
华大建库流程详解华大基因（BGI）是全球领先的基因组学研究机构之一，拥有先进的高通量测序平台和丰富的经验，能够为科研机构、医疗机构、农业企业等客户提供高质量的基因组学数据。
华大建库流程是指将样本中的DNA或RNA提取、文库构建、测序和数据分析等步骤串联起来的一系列工作流程。
本文将详细介绍华大建库流程的步骤和流程。
1. 样本提取和质量检测华大建库流程的第一步是从样本中提取DNA或RNA，并进行质量检测。
样本可以是血液、组织、细胞、土壤、水体等。
提取DNA或RNA的方法根据样本的不同而有所区别，常用的方法有酚氯仿法、磁珠法、柱子法等。
提取的DNA或RNA样本需要进行质量检测，包括浓度检测和完整性检测。
常用的测量方法有紫外分光光度法和凝胶电泳法。
2. 文库构建文库构建是华大建库流程的核心步骤，它将提取的DNA或RNA样本转化为可以进行高通量测序的文库。
文库构建的具体步骤如下：2.1 DNA或RNA片段剪切首先，将提取的DNA或RNA样本通过酶切等方法剪切成适当的片段。
DNA片段的长度通常为200-800碱基对，而RNA片段的长度则根据实验的需要而定。
2.2 末端修复和连接将片段的末端进行修复，以使其适合连接测序引物。
修复的方法包括使用聚合酶填充末端和连接适配体。
适配体是一种含有特定序列的DNA片段，它可以与测序引物结合，并提供测序反应所需的序列。
2.3 PCR扩增通过PCR扩增来增加文库的数量。
PCR扩增的条件需要根据实验的要求进行优化，以保证文库的质量和数量。
2.4 文库纯化通过凝胶电泳或磁珠法等方法，将PCR产物中的目标文库分离出来，并去除杂质。
2.5 文库质检对纯化后的文库进行浓度检测和完整性检测，确保文库的质量符合要求。
3. 测序文库构建完成后，下一步是进行测序。
华大基因拥有世界领先的高通量测序平台，可以进行全基因组测序、转录组测序、外显子测序、甲基化测序等多种测序服务。
3.1 测序准备在进行测序之前，需要对文库进行一系列的处理，包括文库放大、文库纯化和文库浓度调整等。
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基因组文库的构建
LOGO
文库
含有某种生物全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。
如果文库的容量足够大，就能包含该物种的或改组织全部DNA或RNA（以cDNA的形式）的序列。
分为基因组文库和cDNA文库。
基因组文库
含有某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存在一个受体菌的群体之中，这个群体就是这种生物的基因组文库来自于某一物种的基因组，由于该物种所有组织中的基因组均相同，所以基因组文库具有种属特异性，但无组织特异性。
一个理想的基因组文库应该是在克隆群体中包含完整基因组的所有DNA序列，一般情况下一个完整的基因组文库所需的克隆总数应取决于外面基因组的大小以及切割片段的大小。
估算基因组文库大小的公式：
N = ln (1-P) ln (1-f)
N为基因组文库必需的克隆数目
P为文库中含目的基因DNA片段的出现概率f为插入片段的大小与全基因组大小的比值
举例
如果要使20kb 大小的基因DNA 片段出现概率达到99%，则构建大肠杆菌（4.6×106）和人类（3×109）的基因组文库应包含的克隆子经验值分别是：
ln( 1-0.99)
ln[1-(2×104/4.6×106)]N human = = 6.9 ×105
ln(1-0.99) ln[1-(2 ×104/3 ×109)]
N E.coli == 1.1 ×103
1、纯化基因组DNA
2、获得含基因组文库的DNA片段
3、与λ噬菌体克隆载体重组
（1）基因组DNA的纯化
真核生物的从细胞核中提取，用蛋白酶和梯度抽提的方法去除蛋白质、脂肪和不需要的大分子物质。
原核生物可直接从细胞中提取
（2）将DNA进行随机切割
方法一：物理学方法，如利用机械力和超声波等方法二：生物化学方法，如限制性核酸内切酶。
根据插入片段的大小，可以选择不同的载体来构建基因组文库载体 Plasmid phageλ cosmid YAC 插入片段(kb) 5 23 45 1000
构建基因组文库的步骤cos cos 左臂右臂 外源 DNA (~20-23 kb)cos
cos 外源 DNA (~20-23 kb)左臂右臂
人基因组DNA
用Sau3A部
分酶切成
20kb左右的
片段20kb左右带粘性末端的片段
λ噬菌体DNA
替换区
用Bam H1酶切
去除替换区
带粘性末端的λ载体臂
将人基因组DNA和λ载体臂混合，用DNA连接酶处理
重组成可以包装大小的λDNA
包装与体外噬菌体组装系统
含有人类基因组DNA的重组
病毒颗粒
BAC文库的构建NotI、SacI 脉冲场凝胶电泳得200Kb左右的大片段DNA
纯化后与载体连接 电转化，将连接产物导入大肠杆菌感受态细胞插有外源DNA片段的BAC载体在含有氯霉素的固体培养基中培养
每一个菌落为带有相同外源DNA片段的单克隆。