高效液相色谱法

☺流动相差别的区别
GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。
二、化学键合相色谱法（CBPC）
采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱 法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使 用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量 因子k值范围宽的样品。适用于种类繁多样品的分离。
键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利 用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子可成键 ,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类 （1）疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18。） 和苯基等 （2）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。 （3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺 基，季镀盐；作为阳离子交换基团的磺酸基等.
高效液相色谱法
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
第一节 液相色谱的柱效 第二节 高效液相色谱仪 第三节 高效液相色谱法的分类
概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效 液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：
（三）离子性键合相色谱法
当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合 各种离子交换基团，如一SO3H 一CH2NH2、－C00H、 一 CH2N （ CH3 ）等时，就形成了离子性键合相色谱的 固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子 交换色谱类同。 归纳键合相色谱的最大优点是：通过改变流动相的组成 和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性 和离子型）。此外，由于键合到载体上的基团不易流失 ，特别适用于梯度淋洗。据统计，在高效液相色谱法中 ，约有8O％的分离问题是用键合相色谱法解决。此法 的最大缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓 冲溶液作流动相的体系。
（二）正相键合相色谱法 此法是以极性的有机基团， CN 、 NH2 双羟基等键合在硅胶表面，作为固定相；而 以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入 适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腊等）为 流动相，分离极性化合物。此时，组分的分 配比 k 值随其极性的增加而增大，但随流动 相极性的增加而降低。 这种色谱方法主要用于分离异构体、极 性不同的化合物，特别适用于分离不同类型 的化合物。
（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相
这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水， 耐有机溶剂的优点。能在70℃以下，PH=2～8范 围内正常工作，应用较广泛.
（一）反相键合相色谱法
此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如硅 胶一C18H37、硅胶一苯基等；流动相是采用极性较强的 溶剂，如甲醇十、乙睛一水、水和无机盐的缓冲溶液等 。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物；若采用含一 定比例的甲醇或乙睛的水溶液为流动相，也可用于分离 极性化合物；若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则 可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等 。反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰 的优点。
五、附属系统
包括脱气、梯度洗脱、再循环、恒温、自动进样、 馏分收集以及处理装臵。 脱气的目的：防止流动相从高压柱内流出时，释放 出气泡进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检 测。通常用氦气鼓泡来驱除流动相中溶解的气体。 梯度洗脱：是在分离过程中通过逐渐改变流动相的 组成增加洗脱能力的一种方法。将两种或两种以上 不同性质但可以互溶的溶剂，随着时间改变而按一 定比例混合，以连续改变色谱柱中冲洗液的极性、 离子强度或pH等，从而改变被测组分的相对保留值 ，提高分离效率，加快分离速度。主要应用于分离 分配比k相差很大的复杂混合物。
二、进样系统
注射进样（高分子有机硅胶垫→进样室） 直接注射进样：操作简便，可获得较高柱效， GC 系统压力较小，可以 停流进样： HPLC系统压力太大，必须停泵进样（ 早期），操作不便，重现性差。 高压六通阀进样：不必停泵，六通阀（结构完全 与气相色谱中所采用的六通阀相同）。进样量的 可变范围大，耐高压，能在高压状态进样，易于 自动化；易造成谱峰柱前展宽。
第三节 高效液相色谱法的分类
－、液一液分配色谱法（LLPC）： 分离原理：基本与液-液萃取相同，都是根据物质在 两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的 分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进 行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组 分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种 复杂组分。 适用范围：适用于各种样品类型的分离和分析，无 论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子 型的和非离子型的化合物。 缺点：液体固定相容易流失，导致色谱柱上保留行 为的改变，并引起分离试样的污染，不能用于梯度 洗脱。
☺操作条件差别
GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
第一节 液相色谱的柱效
一、液相色谱的速率理论 ♣ 对液相色谱来说，速率方程与气相色谱速率方程基本 一致，主要区别在于传质阻力项。 ♣ 在液相色谱中，液体的粘度比气体要大得多，故组分 在流动相的扩散系数Dg比在气相色谱中要小105倍， 因此在液相色谱法中组分的纵向扩散较小，一般可以 忽略。对液相色谱来说，影响柱效的主要因素是传质 阻力项。 ♣ 在液相色谱法中可采用减小填料的孔穴深度、粒径， 采用低粘度及低流速流动相，适当提高柱温等方法来 降低板高提高柱效。
二、高压输液系统
组成：由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉 动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。 对高压泵的要求：密封性好，输出流量恒定，压 力充足、平稳，输出流动相的可调范围宽，便于 迅速更换溶剂及耐腐蚀等。 高压泵的分类： 恒流泵：在一定操作条件下，输出的流量保持恒定 ，而与色谱柱等引起的阻力变化无关。往复泵、 注射泵等。 恒压泵：能保持输出压力恒定，而流量随色谱系统 阻力的变化而变化，保留时间的重现性差。气动 放大泵。
高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大 优点在于： ☺高压 流动相为高压输送 ☺高速 在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍 。 ☺高效 柱效可达30000塔板/米以上。 ☺高灵敏度 采用高灵敏度检测器。 ☺高自动化。
高效液相色谱法与气相色谱法
☺分析对象的区别：
GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品 ；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检 测， 占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介 质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制， 对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及 高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机 物的80% ☺由于液体的扩散性比气体的小，因此溶质在液相 中的传质速率慢，柱外效应显著；而在GC中柱外区 域扩张可以忽略不计。
（一）反相键合相色谱法
关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓疏溶 剂作用理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相 看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛” ，这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用极性溶剂 为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一 方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷 基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面 ，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使 它离开固定相，并减小其保留作用。显然，两种作用 力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。
键合固定相的制备
（l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相,它是最先用 于液相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生酯 化反应： ≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20 由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具 有良好的传质特性 , 但这些酯化过的硅胶填料易 水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的 流动相。现已淘汰。 （2）≡Si－C或Si一N共价键合固定相 共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸 酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时 ，必须限制PH在4～8范围内.
流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动 相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶 ，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根 据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为 正相分配色谱和反相分配色谱。如果采用流动相的 极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适 用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先 流出，极性大的后流出。如果采用流动相的极性大 于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非 极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相 反。
第二节 高效液相色谱仪
一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系 统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装臵： 如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。 其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶 剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流 出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的 流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先 后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记 录下来，由此得到液相色谱图。
高效液相色谱仪基本装臵检源自器进样阀 色谱柱流动相
高压泵
注入样品液
流出液
色谱处理机
一、流动相储器和溶剂处理系统
流动相储器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成 ，容量为0.5到2 L，用来贮存足够数量、符 合要求的流动相。常装有溶剂脱气装臵以脱 去氧、氮等。 脱气方法： 1.搅拌下真空或超声波脱气； 2.通入氦或氮等惰性气体带出溶解在溶剂中的 空气。