常用分子生物学试剂的选择-中文-

3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
5’ … G-C-T-G-OH
OH-G-C-T-C … 5’
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 退火 4-7 ℃
OH P
5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
单功能 同源二聚体 Mg2+ 旋转对称序列
III 型
双功能 异源二聚体 ATP Mg2+ SAM
GAGCC
切割位点
距识别序列1kb处 随机性切割
识别序列内或附近 特异性切割
距识别序列下游 24-26bp处
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的命名
属名 种名 株名
Haemophilunitss influnitsenzae d 嗜血流感杆菌d株
用于分子克隆的工具酶
限制性核酸内切酶
DNA聚合酶
DNA连接酶
核酸酶
核酸修饰酶
如何选择最合适的限制性内切酶
限制性核酸内切酶的生物功能 影响限制性核酸内切酶活性的因素
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的生物功能
• 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵
• 识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链 • 细菌的限制与修饰作用
割位置不一致
可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的 Sunitsbset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶 的识别序列之中
酶切反应注意事项
价格昂贵的酶
决不能用水稀释,以免变性失活。
预先加入除酶以外的所有其他试剂。
取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。
使用无菌的新吸头。
少加水,使体积最小,•但保证酶液体积不超过总体积的10％,否
则酶液中的甘油会抑制酶活性。
常用内切酶的单位价格比较
产品名称 公司 N 规格 5000 2000 2500 1000 500 价格 280 120 260 280 120 单位价格 0.056 0.06 0.104 0.28 0.24
BamH I
T P N
Bgl II
T
P
N
500
500
228
310
PvunitsII 37 ℃ 5’ … G-C-T-C-A-G-OH 3’ … C-G-A-G-T-C-P P-C-T-G-G-A-G … 3’ OH-G-A-C-C-T-C … 5’
影响限制性核酸内切酶活性的因素
DNA样品的纯度：
蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等
措施： 加大酶的用量，1 mg DNA 用 10units 酶 加大反应总体积 延长反应时间
H i n d III
同一菌株中含多个不同的限制性核酸内切酶,表示在该菌株中发现这种酶的先后次序。
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶的基本特性
识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
0.456
0.62
Dpn I
T P N 200 5000 3000 5000 2000 400 500 384 280 120 156 310 200 741 1.9175 0.056 0.04 0.03 0.115 0.5 1.482
星号活性
在非标准反应条件下,也能切割一些与
其特异识别序列类似的序列。在酶的
名称右上角加一个星号(*)表示,•如
EcoRⅠ*。
必须采用规范的实验步骤,坚持应用推
荐的反应条件。
同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限
制酶可切割同一靶序列 同尾酶(isocaunitsdiners)：来源不同、识别序列 不同，•但产生相同粘性末端的酶。 远距离裂解酶(distant cleavage)：识别位点与切
影响限制性核酸内切酶活性的因素
核酸内切酶的缓冲液性质：
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值 等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特 异性，即所谓的Star activity现象
EcoR I在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘 油浓度超过5%（v/v）时，也可切割 5‘PunitsPunitsATPyPy3’或者5‘AATT3’
OH P
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PstI等产生的3’粘性末端
5’ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’
3’ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
PstI 37 ℃ 5’ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH 3’ … C-G-A-G-P P-G-G-A-G … 3’ OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
5’ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3’ … C G A C T T A A G C T C … 5’
EcoRI等产生的5’粘性末端
5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
EcoRI 37 ℃
退火 4-7 ℃
OH P
5’ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
OH P
PvunitsII等产生的平头末端
5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
影响限制性核酸内切酶活性的因素
DNA样品的甲基化程度：
大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤 N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但
BamH I、 Bgl II、Saunits3A I不受影响
大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’ 序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有 EcoR II等 哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基
• hsd R：编码限制性核酸内切酶 • hsd M：编码限制性甲基化酶 • hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的类型
主要特性
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列
I型
多功能 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM TGAN8TGCT AACN6GTGC
II 型