蛋白质的分离纯化和表征
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第三章蛋白质分离纯化与表征
超滤
• 超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对 称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大 分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分 子溶液的浓缩，不同种类分子的纯化以及溶剂 交换等。超滤法是一种温和的、非变性的物理 分离方法。
超滤离心管
切向流超滤器
离心技术
• 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物 样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用， 使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等） 以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速 度取决于颗粒的质量、大小和密度。 • 密度梯度离心技术是利用每种蛋白质颗粒沉降到与自 身密度相等的密度梯度时即停止不前，最后各种蛋白 质在离心管中被分离成各自的区带。 • 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。
1. 抗体
• 抗体的制备
免疫荧光技术
• 免疫荧光技术是是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏 感性和直观性结合起来的一种方法。其基本原理为： • 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待 检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一 定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助 荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或 抗体。
原理：依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间 的相互作用来分离。配体通常指的是能与另一 个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分 子、基团、离子或原子。但在亲和层析中，配 体是通过共价键先与基质结合。配体可以是酶 结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别 靶蛋白的抗体，也可以是受体、核酸、细胞器 等。 亲和层析是分离效率最高的分离方法。
高效液相层析（HPLC）
• 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏 度高，分析速度快，重复性好，定量精度高， 应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强 极性、热稳定性差的化合物。 • 其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量 小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相 消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向 生物化学和药物分析及制备型倾斜。
生物化学课件 第7章 - 蛋白质分离纯化和表征(9-21)
思考题 2012年厦门大学生物化学
5. 一多肽有侧链羧基30个（pk1=4.3），咪唑基15个(pk2 =
6.0) ，氨基10个（pk3=10）。两端羧基，氨基的pk分别为
COOH = 3.5 和 NH3+ = 9.5。求该蛋白的PI值
+26
分析：
pk1=4.3
30 × COOH
+25
NH3+ pk1=9.5
当一种氨基酸的净电荷用q=pI-pH表达时，若q为正值，则 该氨基酸带正电荷；若q为负值，则该氨基酸带负电荷。
q值的正与负和该氨基酸所带电荷的种类是一致的。如 果采用q=pH-pI来表达，则会出现相反的结果，即q为负值时， 氨基酸带正电荷；q为正值时，氨基酸带负电荷。因此，用 pI-pH更好。
思考题
第7章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的理化性质 P291
（一）蛋白质的酸碱电离
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基 侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带 负电荷或正电荷的基团。
当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子 的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
试剂的酸根离子结合而产生沉淀。
生物碱试剂和某些酸类沉淀
实例分析
实例分析：在啤酒生产工艺中有麦芽汁加啤酒 花煮沸的工序，其目的之一就是借酒花中的单 宁类物质怀变性蛋白质或盐形成沉淀，使麦芽 汁得以澄清，从而防止成品啤酒产生蛋白质混 浊。
“ 柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的 柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的 蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”
4蛋白质的分离纯化和表征
超过滤（ultrafiltration）
滤膜 抽气 离心 滤膜ensity gradient）
生物大分子及颗粒的沉降不仅 决定于它的大小，而且也取决于 它的密度。颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大 的颗粒沉降的快，并且每种蛋白 质颗粒沉降到与自身密度相等的 介质密度梯度时，即停止不前， 最后各自在离心管中被分离成独 立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分 步收集。常用的介质有蔗糖、氯 化铯等。
多肽链主链骨架中的若干肽段，通过氢键，形成有规则 的构象，这称为二级结构。
α-螺旋 β-折叠 无规线团
在二级结构的基础上，多肽链间通过氨基酸残基侧链的 相互作用而进行盘旋和折叠，因而产生的特定的三维空间结 构，这称为三级结构，也称为蛋白质的亚基。 各个亚基在低聚蛋白中的空间排布及相互作用，称为蛋 白质的四级结构。
（一）根据分子大小不同的纯化方法
• ◇ 1.透析和超滤 • ◇ 2.密度梯度离心 • ◇ 3.凝胶过滤
1.透析和超滤
透析是利用蛋白质等大分子 不能通过半透膜的性质，使蛋白 质和其它小分子物质如无机盐单 糖等分开。常用的半透膜： 半透膜袋 蛋白质溶液 透析液 磁棒
玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane
3.有机溶剂分级分离
• （1）有机溶剂可以使蛋白质沉淀
酮、乙酸乙酯等。 • （2）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。 • （3）有分级分离现象 • （4）要求对有机溶剂低温预冷。
主要有乙醇、丙
4.温度对蛋白质溶解度的影响
• 在一定温度范围内，约0-40℃之间，大部分球状 蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，
滴加样品
离 心 管
蔗糖浓度
蔗糖密度梯度
第7章蛋白质的分离纯化和表征
第7章蛋白质的分离纯化和表征第七章蛋白质的分离、纯化和表征第一节蛋白质的酸碱性质每个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。
等电点应通过等电点聚焦和其他方法来确定。
第二节蛋白质分子的大小和形状首先，根据化学成分确定最低相对分子质量假设只有一种微量组分，在测量其百分含量后，可以用比例公式计算出最低相对分子质量。
如果测量两种痕量组分的百分比含量，并且通过比例公式计算的最低相对分子质量不同，则可以计算两种最低相对分子质量的近似值的最小公倍数。
实施例:纯酶含有1.65%亮氨酸(MR 131)和2.48%异亮氨酸(MR 131), 以找到最低的相对分子质量。
解决方案:根据Leu 的百分比，最低Mr x1: x1 = (100'131)/1.65 = 7939.4。
最低X2先生:X2 = (100 ' 131)/2.48 = 528是3艮据lie的百分比含量计算的。
由于X1 和X2 数之间的巨大差异，建议该酶包含一个以上的Leu 和l i e 。
为了估计Leu 和lie 的数量，首先计算:X1/X2=7939.4/5282.3 〜1.5 .该酶含有的任何氨基酸的数量应为整数，表明该酶至少含有2个Leu 和3个Ile ,其最小相对分子质量为7939.4 ‘2=15878.8或5282.3 3=15846.9二、渗透压法测定相对分子质量三、沉降分析法测定相对分子质量基本原则:(a)离心力(Fc)当粒子(生物大分子或细胞器)在高速旋转下受到离心力时，离心力“ FC由以下公式定义:f = m a = m w 2ra-粒子旋转加速度，m-沉降粒子的有效质量，w粒子旋转角速度，r- 粒子旋转半径(cm)。
②相对离心力(RCF) 由于各种离心机转子的半径或离心管到转轴中心的距离不同，离心力也不同。
因此，文献中常用相对离心力”或数X g来表示离心力。
只要RCF 值不变，样品在不同的离心机上可以获得相同的结果。
第七章蛋白质的分离纯化和表征
第二节 蛋白质的分子大小与形状 （略）
第三节
蛋白质的胶体性质与沉淀、变性
一、蛋白质的胶体性质
由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性
蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水
有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面 形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋 白质溶液是相当稳定的亲水胶体。
2、引起蛋白质变性的因素有：
①.物理因素 热（60~100℃）、紫外线、X射线、超声波、 高压、表面张力，以及剧烈的振荡、研磨、搅拌 等；
②.化学因素
化学因素又称为变性剂，包括：酸、碱、有 机溶剂（如乙醇、丙酮等）、尿素、盐酸胍、重 金属盐、三氯醋酸、苦味酸、磷钨酸以及去污剂 等。
3、变性表现及变性机理
pI是蛋白质的一个特征常数。
蛋白质两性解离性质和等电点
Pr
NH3
+
+ +
OHH+
Pr
NH3 COO-
+
+ OH+ H+
Pr
NH2 COO-
COOH
pH< pI
净电荷为正
pH = pI
净电荷=0
pH > pI
净电荷为负
当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负
电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此
去除上述变性剂 可使蛋白质回复 原态而恢复活性 是为复性
并非所有蛋白质 均可顺利复性 恢复原来活性
5、变性的利用和预防
在医疗上，高温高压蒸煮手术器械，紫外线照 射手术室，75％酒精消毒手术部位的皮肤，使病菌、 病毒的蛋白质发生变性，失去致病作用，达到消毒 杀菌，防止伤口被感染的目的。
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征.
第七章蛋白质的分离、纯化和表征7.1 本章主要内容1）蛋白质的酸碱性质2）蛋白质分子的大小和形状3）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀4）蛋白质分离纯化方法7.2 教学目的和要求：通过本章学习，使学生掌握蛋白质的物理化学性质，在此基础上对现实生活中的现象给出合理的解释，同时为后续知识的学习打下基础。
7.3 重点难点1.蛋白质分离纯化方法2.蛋白质物理化学性质及应用7.4 教学方法与手段讲授与交流互动相结合，采用多媒体教学。
7.5 授课内容一、蛋白质的酸碱性质蛋白质也是一类两性电解质，能和酸、碱发生作用。
在蛋白质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数N端-NH2和C端-COOH。
天然球状蛋白质的可解离基团大部分可被滴定，而某些天然蛋白质中有一部分可解离基因由于埋藏在分子内部或参与氢键形成而不能解离。
1.等电点和等离子点（中性盐Ca2+、Mg2+、cl、HPO42++）等电点：以兼性离子形式存在的蛋白质的pH 值。
在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。
蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。
等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出的质子数与质子受体结合的质子数相等时的pH值称等离子点，是每种蛋白质的特征常数。
2.蛋白质的电泳分离3.离子交换层析分离蛋白质二、蛋白质的大小与形状测分子量的方法：1.化学组成法2.凝胶过滤法3.SDS-PAGE法4.沉降分析法5.渗透压法三、胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。
蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对极性，离子化基因数量越多，溶解度越大。
1.稳定蛋白质胶体溶液的主要因素（1）蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀。
第6章 蛋白质的分离、纯化和表征
蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两 方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相 对稳定的。
蛋白质胶体性质的Βιβλιοθήκη 用由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因 此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分 子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等
第6章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
• pI通常在 6.0 左右
蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使 某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为 两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴 极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电 点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
蛋白质混合样
凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量
凝胶过滤.swf
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system）
由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直 径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围 的大小，因而具有胶体溶液的通性。
蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：
透析.swf
二.蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、 相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子 处于等电点状态或失去水化层（消除相同电 荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳 定并将产生沉淀。
• 蛋白质沉淀定义：
蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其 稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白 质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就 会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋 白质的沉淀作用。
（二）SDS－PAGE测定相对分子质量
蛋白质胶体性质的Βιβλιοθήκη 用由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因 此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分 子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等
第6章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
• pI通常在 6.0 左右
蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使 某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为 两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴 极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电 点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
蛋白质混合样
凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量
凝胶过滤.swf
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system）
由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直 径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围 的大小，因而具有胶体溶液的通性。
蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：
透析.swf
二.蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、 相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子 处于等电点状态或失去水化层（消除相同电 荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳 定并将产生沉淀。
• 蛋白质沉淀定义：
蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其 稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白 质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就 会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋 白质的沉淀作用。
（二）SDS－PAGE测定相对分子质量
第五节蛋白质的分离纯化和表征
核糖核酸酶的变性与复性
• 蛋白质分子相互聚集而从溶液中
析出的现象称为沉淀。
• 变性后的蛋白质由于疏水基团的 暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质 不一定都是变性后的蛋白质。
• 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质 一定发生变性。
二、蛋白质的分离与纯化
（一）盐析与有机溶剂沉淀： 1. 盐析：
• 在某些物理或化学因素的作用下，蛋白
质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的 断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和 生物学性质的改变，称为蛋白质的变性。
•引起蛋白质变性的因素有：
① 物理因素：高温、高压、 紫外线、电离辐射、超声波 等；
② 化学因素：强酸、强碱、 有机溶剂、重金属盐等。
• 变性蛋白质的性质改变：
电泳
盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。 （一）盐析与有机溶剂沉淀： 越是痛苦的事情，越爱小题大作。 如变性程度浅，蛋白质分子的构象未被严重破坏； 变性蛋白质的性质改变： ③ 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。 ③ 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。 蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。 利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。 在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质 的改变，称为蛋白质的变性。 付出了不一定有回报，但不付出永远没有回报。 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。
• 沉淀原理是： • ① 脱水作用； • ② 使水的介电常数降低，蛋白质
溶解度降低。
（二）电泳：
• 带电粒子在电场中移动的现象称为 电泳。
• 蛋白质分子在溶液中可带净的负电 荷或带净的正电荷，故可在电场中 发生移动。不同的蛋白质分子所带 电荷量不同，且分子大小也不同， 故在电场中的移动速度也不同，据 此可互相分离。
第7章蛋白质的分离、纯化和表征
In contrast, the larger molecules have only the liquid surrounding the beads accessible to them, and thus move through the column faster, emerging out of the bottom (eluting洗脱) first.
分子的大小和形状 酸碱性质 溶解度 吸附性质 对配体分子的特异生物学亲和力
Protein Purification and Characterization
The aim of protein purification is to isolate one particular protein from all the others in the starting material, exploits利用: Solubility Size Charge Hydrophobicity or/and specific binding affinity of the protein of interest
Small/more negatively-charged proteins migrate further through the gel than larger/less negatively-charged proteins
7.3 蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀
Protein colloid character and deposition
用来确定Mr。
7.2.4 沉降分析法测定相对分子质量
蛋白质溶液在电场中受到强大的离心力作用时，如果 蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。
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测定范围：0.1～0.5mg/ml
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
6. 蛋白质主要呈色反应
双缩脲反应 酚试剂法 →蛋白质定量、定性 茚三酮反应 测定常用方法
考马斯亮蓝反应
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
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第 1.蛋白质的两性解离性质
7
章
蛋
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，
白 氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条
质 的
件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
分
离、
NH
+ 3
O H-
NH
+ 3
纯 Pr
化
COOH
Pr
H+
COO -
和
阳离子
兼性离子
表
pH<pI
pH=pI
第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
沉淀的蛋白质不一定变性
变性蛋白质不一定沉淀，但结絮、凝固是 变性深刻化体现
沉淀方法类别:
1、高浓度中性盐（盐析、盐溶）
2、酸硷（等电点沉淀）
3、有机溶剂沉淀
4、重金属盐类沉淀
变性沉淀
5、生物碱试剂和某些酸类沉淀
6、加热变性沉淀
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O H-
NH 2
H+
Pr COO-
阴离子
pH>pI
征
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第 7 对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正 章 电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这 蛋 一pH称为蛋白质的等电点(pI)；
白
质
的 分 离、 纯
蛋白质等电点在一定程 度上决定于介质中离子
的组成
化
和
表
征
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
4. 蛋白质变性与复性
某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构 状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理 活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性
结构
高级结 构破坏
功能
生理功 能丧失
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第 4. 蛋白质变性与复性
7
复性（renaturation）
2. 蛋白质的胶体性质
第
7
章
蛋 * 蛋白质胶体稳定的因素
白 质
颗粒表面电荷
这些颗粒带有电荷
的
水化膜（0.3-0.5g/g Pr)
分
离、
纯
化
表面分布着大量极性氨基酸残基，对
和
水有很高的亲和性，通过水合作用在
表
蛋白质颗粒外面形成一层水化膜
征
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第
水化膜
7 章
+++
酸
碱
－－
－
－
第
水化膜
7 章
+++
酸
碱
－－
－
－
蛋
+
+碱
白
++
酸
－ －－
－
质
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质
的 脱水作用
分 离、 纯 化
++ +
+
+
+ ++
脱水作用 碱
脱水作用
－－
酸－
－
－
－－ －
和
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
表
溶液中蛋白质的聚沉
征
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蛋
+
+碱
白
++
酸
－ －－
－
质
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质
的 脱水作用
分 离、 纯 化
++ +
+
+
+ ++
脱水作用 碱
脱水作用
－－
酸－
－
－
－－ －
和
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
表
溶液中蛋白质胶体的稳定
征
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
双缩脲反应
180℃
蛋白质在碱性溶液中也 能与硫酸铜发生相同反应， 产生红紫色络合物
Cu2+ CuSO4
(硷性溶液)
红紫色络合物
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3. 蛋白质的沉淀
如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点 状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜） ，蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。
沉淀: 不稳定的蛋白质从溶液中析出 结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强酸、强碱 凝固：沉淀结块，结块不溶于强酸强碱
尽量采用沉淀方式，保留蛋白质的活性
YOUR SITE HERE章Βιβλιοθήκη 蛋 变性的可逆性白 质
可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可以恢复原状。 不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构不能恢复原状。
的 分 离、
蛋白质的变性作用如果不过于剧烈， 则是一种可逆过程
纯
化
胃蛋白酶加热至80℃－90℃时，变性、无消化蛋白质的
和
能力，失去溶解性。如将温度下降到37℃，就复性，又
第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基 团解离出来的质子数与质子受体基团结合 的质子数相等时的pH称为等离子点 （isoionic point）
等离子点是蛋白质的一个特征常数
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
表
恢复溶解性和消化蛋白质的能力。但如变性时间加长，
征
条件加剧，变性程度加深，就成为不可逆变性。
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
5. 蛋白质的紫外吸收光谱
蛋白质在远紫外光 区 （ 200-230nm ） 有 较 大 的 吸 收 ， 在 280nm 有 一特征吸收峰，可利用 这一特性对蛋白质进行 定性定量鉴定。
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
一、蛋白质的重要性质 二、 蛋白质的分离纯化 三、蛋白质相对分子质量的测定 四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
一、蛋白质的重要性质
1、 两性解离性质及等电点 2、 蛋白质胶体性质 3、 蛋白质的沉淀 4、 蛋白质的变性与复性 5、 蛋白质的紫外吸收特性 6、 蛋白质的呈色反应
2009.7.29
0
第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
第7章 蛋白质的分离、纯化和表征
主要介绍蛋白质的分离、纯化的一般原则和 方法
分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋 白质之间各种特性的差异，包括分子的大小 和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对 配体分子的特异生物学亲和力
电泳
沉淀
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
2.蛋白质的胶体性质
蛋白质是高分子化合物，由于分子量大，它在水 溶液中所形成的颗粒直径约为1－100nm。
胶体溶液具有布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、 不能透过半透膜以及具有吸附能力等特性
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
6. 蛋白质主要呈色反应
双缩脲反应 酚试剂法 →蛋白质定量、定性 茚三酮反应 测定常用方法
考马斯亮蓝反应
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
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第 1.蛋白质的两性解离性质
7
章
蛋
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，
白 氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条
质 的
件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
分
离、
NH
+ 3
O H-
NH
+ 3
纯 Pr
化
COOH
Pr
H+
COO -
和
阳离子
兼性离子
表
pH<pI
pH=pI
第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
沉淀的蛋白质不一定变性
变性蛋白质不一定沉淀，但结絮、凝固是 变性深刻化体现
沉淀方法类别:
1、高浓度中性盐（盐析、盐溶）
2、酸硷（等电点沉淀）
3、有机溶剂沉淀
4、重金属盐类沉淀
变性沉淀
5、生物碱试剂和某些酸类沉淀
6、加热变性沉淀
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O H-
NH 2
H+
Pr COO-
阴离子
pH>pI
征
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第 7 对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正 章 电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这 蛋 一pH称为蛋白质的等电点(pI)；
白
质
的 分 离、 纯
蛋白质等电点在一定程 度上决定于介质中离子
的组成
化
和
表
征
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
4. 蛋白质变性与复性
某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构 状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理 活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性
结构
高级结 构破坏
功能
生理功 能丧失
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第 4. 蛋白质变性与复性
7
复性（renaturation）
2. 蛋白质的胶体性质
第
7
章
蛋 * 蛋白质胶体稳定的因素
白 质
颗粒表面电荷
这些颗粒带有电荷
的
水化膜（0.3-0.5g/g Pr)
分
离、
纯
化
表面分布着大量极性氨基酸残基，对
和
水有很高的亲和性，通过水合作用在
表
蛋白质颗粒外面形成一层水化膜
征
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第
水化膜
7 章
+++
酸
碱
－－
－
－
第
水化膜
7 章
+++
酸
碱
－－
－
－
蛋
+
+碱
白
++
酸
－ －－
－
质
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质
的 脱水作用
分 离、 纯 化
++ +
+
+
+ ++
脱水作用 碱
脱水作用
－－
酸－
－
－
－－ －
和
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
表
溶液中蛋白质的聚沉
征
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蛋
+
+碱
白
++
酸
－ －－
－
质
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质
的 脱水作用
分 离、 纯 化
++ +
+
+
+ ++
脱水作用 碱
脱水作用
－－
酸－
－
－
－－ －
和
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
表
溶液中蛋白质胶体的稳定
征
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
双缩脲反应
180℃
蛋白质在碱性溶液中也 能与硫酸铜发生相同反应， 产生红紫色络合物
Cu2+ CuSO4
(硷性溶液)
红紫色络合物
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3. 蛋白质的沉淀
如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点 状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜） ，蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。
沉淀: 不稳定的蛋白质从溶液中析出 结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强酸、强碱 凝固：沉淀结块，结块不溶于强酸强碱
尽量采用沉淀方式，保留蛋白质的活性
YOUR SITE HERE章Βιβλιοθήκη 蛋 变性的可逆性白 质
可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可以恢复原状。 不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构不能恢复原状。
的 分 离、
蛋白质的变性作用如果不过于剧烈， 则是一种可逆过程
纯
化
胃蛋白酶加热至80℃－90℃时，变性、无消化蛋白质的
和
能力，失去溶解性。如将温度下降到37℃，就复性，又
第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基 团解离出来的质子数与质子受体基团结合 的质子数相等时的pH称为等离子点 （isoionic point）
等离子点是蛋白质的一个特征常数
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
表
恢复溶解性和消化蛋白质的能力。但如变性时间加长，
征
条件加剧，变性程度加深，就成为不可逆变性。
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
5. 蛋白质的紫外吸收光谱
蛋白质在远紫外光 区 （ 200-230nm ） 有 较 大 的 吸 收 ， 在 280nm 有 一特征吸收峰，可利用 这一特性对蛋白质进行 定性定量鉴定。
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
一、蛋白质的重要性质 二、 蛋白质的分离纯化 三、蛋白质相对分子质量的测定 四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
一、蛋白质的重要性质
1、 两性解离性质及等电点 2、 蛋白质胶体性质 3、 蛋白质的沉淀 4、 蛋白质的变性与复性 5、 蛋白质的紫外吸收特性 6、 蛋白质的呈色反应
2009.7.29
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
第7章 蛋白质的分离、纯化和表征
主要介绍蛋白质的分离、纯化的一般原则和 方法
分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋 白质之间各种特性的差异，包括分子的大小 和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对 配体分子的特异生物学亲和力
电泳
沉淀
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
2.蛋白质的胶体性质
蛋白质是高分子化合物，由于分子量大，它在水 溶液中所形成的颗粒直径约为1－100nm。
胶体溶液具有布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、 不能透过半透膜以及具有吸附能力等特性
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