蛋白质的分离纯化和表征

第
水化膜
7 章
+++
酸
碱
－－
－
－
源自文库
蛋
+
+碱
白
++
酸
－ －－
－
质
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质
的 脱水作用
分 离、 纯 化
++ +
+
+
+ ++
脱水作用 碱
脱水作用
－－
酸－
－
－
－－ －
和
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
表
溶液中蛋白质的聚沉
征
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2009.7.29
0
第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
第7章 蛋白质的分离、纯化和表征
主要介绍蛋白质的分离、纯化的一般原则和 方法
分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋 白质之间各种特性的差异，包括分子的大小 和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对 配体分子的特异生物学亲和力
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第 1.蛋白质的两性解离性质
7
章
蛋
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，
白 氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条
质 的
件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
分
离、
NH
+ 3
O H-
NH
+ 3
纯 Pr
化
COOH
Pr
H+
COO -
和
阳离子
兼性离子
表
pH<pI
pH=pI
双缩脲反应
180℃
蛋白质在碱性溶液中也 能与硫酸铜发生相同反应， 产生红紫色络合物
Cu2+ CuSO4
(硷性溶液)
红紫色络合物
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2. 蛋白质的胶体性质
第
7
章
蛋 * 蛋白质胶体稳定的因素
白 质
颗粒表面电荷
这些颗粒带有电荷
的
水化膜（0.3-0.5g/g Pr)
分
离、
纯
化
表面分布着大量极性氨基酸残基，对
和
水有很高的亲和性，通过水合作用在
表
蛋白质颗粒外面形成一层水化膜
征
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第
水化膜
7 章
+++
酸
碱
－－
－
－
测定范围：0.1～0.5mg/ml
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
6. 蛋白质主要呈色反应
双缩脲反应 酚试剂法 →蛋白质定量、定性 茚三酮反应 测定常用方法
考马斯亮蓝反应
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
章
蛋 变性的可逆性
白 质
可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可以恢复原状。 不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构不能恢复原状。
的 分 离、
蛋白质的变性作用如果不过于剧烈， 则是一种可逆过程
纯
化
胃蛋白酶加热至80℃－90℃时，变性、无消化蛋白质的
和
能力，失去溶解性。如将温度下降到37℃，就复性，又
蛋
+
+碱
白
++
酸
－ －－
－
质
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质
的 脱水作用
分 离、 纯 化
++ +
+
+
+ ++
脱水作用 碱
脱水作用
－－
酸－
－
－
－－ －
和
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
表
溶液中蛋白质胶体的稳定
征
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
3. 蛋白质的沉淀
如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点 状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜） ，蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。
沉淀: 不稳定的蛋白质从溶液中析出 结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强酸、强碱 凝固：沉淀结块，结块不溶于强酸强碱
尽量采用沉淀方式，保留蛋白质的活性
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
沉淀的蛋白质不一定变性
变性蛋白质不一定沉淀，但结絮、凝固是 变性深刻化体现
沉淀方法类别:
1、高浓度中性盐（盐析、盐溶）
2、酸硷（等电点沉淀）
3、有机溶剂沉淀
4、重金属盐类沉淀
变性沉淀
5、生物碱试剂和某些酸类沉淀
6、加热变性沉淀
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基 团解离出来的质子数与质子受体基团结合 的质子数相等时的pH称为等离子点 （isoionic point）
等离子点是蛋白质的一个特征常数
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
表
恢复溶解性和消化蛋白质的能力。但如变性时间加长，
征
条件加剧，变性程度加深，就成为不可逆变性。
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
5. 蛋白质的紫外吸收光谱
蛋白质在远紫外光 区 （ 200-230nm ） 有 较 大 的 吸 收 ， 在 280nm 有 一特征吸收峰，可利用 这一特性对蛋白质进行 定性定量鉴定。
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
一、蛋白质的重要性质 二、 蛋白质的分离纯化 三、蛋白质相对分子质量的测定 四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
一、蛋白质的重要性质
1、 两性解离性质及等电点 2、 蛋白质胶体性质 3、 蛋白质的沉淀 4、 蛋白质的变性与复性 5、 蛋白质的紫外吸收特性 6、 蛋白质的呈色反应
第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
4. 蛋白质变性与复性
某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构 状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理 活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性
结构
高级结 构破坏
功能
生理功 能丧失
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第 4. 蛋白质变性与复性
7
复性（renaturation）
O H-
NH 2
H+
Pr COO-
阴离子
pH>pI
征
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第 7 对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正 章 电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这 蛋 一pH称为蛋白质的等电点(pI)；
白
质
的 分 离、 纯
蛋白质等电点在一定程 度上决定于介质中离子
的组成
化
和
表
征
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电泳
沉淀
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
2.蛋白质的胶体性质
蛋白质是高分子化合物，由于分子量大，它在水 溶液中所形成的颗粒直径约为1－100nm。
胶体溶液具有布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、 不能透过半透膜以及具有吸附能力等特性
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