用微生物挑战性试验评价化妆品防腐剂效果_林惠芬

从本次采用的一次加菌法和三次加菌法评价 8 种防腐体系防腐效果的结果看, 三次加菌法具有的优 点是对产品通过测试判别更为严格, 以及对通过产品 可区分出防腐效果优良( W) 和尚可( M ) , 但三次加菌 法在实验室操作上比一次加菌法更麻烦, 且周期长。 从本实验结果看, 一次加菌法在化妆品行业中有其推 广价值, 如最终结果( 28 天时判断有效或无效) , 再结 合 加 菌 后 14 天 产 品 含 菌 量 是 否 小 于 加 菌 量 的
0. 1% , 可预计该防腐体系防腐效果的优良与否。
参考文献 1 Daniel K . Brannan; Cosm et ic preser vat ion. Cosm et ics & Toilet ries ,
1996( 111): 69～83 2 张延, 谢京燕译 . 化妆品的防腐 . 日用化学工业译丛, 1994( 4 ) : 29
分析与检测
3 讨论 在化妆品工业中, 由于化妆品具有一些特殊原
因, 如原料易污染、产品中的营养成份、配方和生产的 复杂性、安全性对防腐剂使用的限制及其它问题, 化 妆品防腐剂的研究, 包括防腐剂的品种、使用剂量及 合理配伍等, 一直是十分重要的研究领域。而研究手 段, 以最终都是对产品进行直接地防腐效果评价最为 客观和重要, 如微生物挑战性实验。
涤剂协会) 推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品 30g , 每隔 2 周加菌一次( 即实验的第 1、3 和 5 周) , 每 次加细菌量为 1×106～1×107 个/ g 样品和霉菌 1× 105 个/ g～1×106 个/ g 样品。在加菌后的 0 天、7 天 和 14 天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方 法同前。此方法可将受检样品分为三类:
防腐体系 第一次加菌
编号 7 天后 14 天后
( 加菌量)
3. 6×106
1
7. 5×104 6. 5×104
2
7. 3×104 2. 5×104
3
1. 1×105 1. 5×105
4
1. 0×105 1. 0×105
5
2. 0×104 5. 0×102
6
5. 9×104 5. 1×104
7
5. 2×104 3. 5×104
第4期 1999 年 8 月
分析与检测
日 用 化 学 工 业
China Surfactant Det ergent & Cosm et ics
分析与检测
用微生物挑战性试验评价化妆品防腐剂效果
林惠芬 李 斌 方惠英 ( 上海凤凰日用化学有限公司, 上海市日用化学工业研究所, 上海市, 200062)
摘要 微生物挑战性试验是目前评价防 腐剂效果的最为广泛和经典的检测方法。我们利用此方 法对几种防腐剂 的防腐效果进行了研究, 为指导实际使用提供了依据。
3. 3×103
0
9. 0×102
5. 8×104 1. 0×105 4. 4×104
7. 2×104 4. 5×104 2. 0×104
5. 0×104 1. 0×103 1. 0×103
表 4 重复三次 加霉菌的微生物挑战试验结果 ( 菌落数/ g 样品)
防腐体系 第一次加菌
编号 7 天后 14 天后
～31 3 Linda B. Sedlew icz: Liquid parabens : t he next gen erat ion of
( 3) 防腐效果差( P) , 即三次加菌后, 在每次加 菌后的第 7 天或 14 天时, 存活菌量 > 1000 个/ g 或 mL 样品( 不通过测试) 。 2 结果
受试样品一次加菌和 3 次加菌后, 在检测时间内 细菌和霉菌的抗腐能力见表 1～4。根据两种方法评 判标准, 将 8 种防腐体系的防腐效果评判列于表 5。 从结果看, 两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本 一致, 三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区 别: 防腐优良( W: Well pr eser vative) 和防腐尚可( M : M ar ginal preserv at ive) 。此外, 在一次加菌后 1～2 周 内能将样品中含菌量降低至加入菌量的 0. 1% , 可通 过 3 次加菌实验, 如防腐体系 5 和 8 对细菌的防腐 力; 但若大于 0. 1% , 即使在以后的测试时间内有逐 渐下降至 0 的趋势, 可能亦很难通过 3 次加菌实验, 如防腐体系 7 对细菌的防腐力。
检测时间( 加菌后天数)
7
8. 5×105 1. 5×105 1. 0×105 2. 0×105 2. 0×104 1. 4×105 5. 2×104 3. 7×104 1. 0×106 1. 0×105
14
2. 2×105 1. 0×105 1. 8×105 7. 0×104 5. 0×102 5. 5×105 3. 4×104
( 加菌量)
3. 2×105
1
0
0
2
0
0
3
0
0
4
0
0
5
0
0
6
2. 6×104 5. 2×104
7
0
0
8
0
0
第二次加菌
第三次加菌
7 天后 14 天后 14 天后
3. 95×105
3. 9×105
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
wk.baidu.com
0
0
0
5. 1×104 3. 0×104 4. 6×104
1. 0×102
0
0
2. 0×102
1. 2. 1 受试用微生物 测试用细菌和霉菌均由上海工业微生物研究所
提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆 菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括: 黑曲霉、黄曲 霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊 叶芽枝霉、球毛壳 霉、绿色木霉。
实验 前, 将各 菌种 接种于 合适 的培 养基中, 于 37℃( 细菌) 或 28℃( 霉菌) 下培养。细菌培养在 2 天 后, 霉菌培养在 5 天后, 挑选适量菌落于灭菌的生理 盐水中, 制成一定浓度的混合细菌( 1×108 个/ mL ) 或 混合霉菌悬液( 1×107 个/ mL ) , 置于 4℃贮放备用。 1. 2. 2 一次加菌的 28 天微生物挑战试验
0
0
表 5 两种微生物挑 战性实验对受试防腐体系效果评判
防腐 体系 编号
1 2
3
4
5
6
7
8
一次加菌微生物挑战性实验
抗细菌
抗霉菌
无效
有效
无效
有效
无效
有效
无效
有效
有效
有效
无效
无效
有效
有效
有效
有效
三次加菌微生物挑战性实验
抗细菌
抗霉菌
P
W
P
W
P
W
P
W
W
W
P
P
P
W
M
W
第4期 1999 年 8 月
林惠芬等: 用微生物挑战性试验评价化妆品防腐剂效果
表 1 28 天微生物( 细菌) 挑战性试验结果( 菌落数/ g 样品)
防腐体系
编号
1 2 3 4 5 6 7 8 空白 空白
0
4. 1×105 1. 9×105 3. 0×105 1. 1×105 1. 7×106 3. 0×106 1. 6×106 3. 7×106 2. 7×107 1. 0×106
此方法参照美国药典( 第 21 版) 上微生物挑战性 试验检测防腐剂效果的方法。称取各受试样品 30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含 菌量分别为 5×106 个细菌和 3×105 个霉菌。然后充 分混匀, 置于 28℃下。在接菌的 0、7、14、21 和 28 天 取样分析: 准确称取 3g 样品, 加到含有玻璃小珠的灭 菌锥形瓶内, 加入 27m L 灭菌生理盐水, 充分震荡混 匀, 此悬液为 1∶10 稀释液; 然后再用灭菌生理盐水 按 10 倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌 量, 细菌培养是 37℃下 24h～48h, 霉菌培养为 28℃ 下 3～5 天。此实验用以评判防腐剂的有效与否。评 判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106 细菌和 1 ×105 霉菌) 后, 在第 14 天存活菌量减少至不高于起 始浓度的 0. 1% , 以后逐渐减少, 在 28 天为 0。符合标 准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效 ( 不通过测试) 。
第一作者简介: 林惠芬, 女, 1953 年生, 1976 年毕业于上海医科大学, 医学博士, 基础研究室主任, 上海市金沙江路 1275 号
·43·
分析与检测
日 用 化 学 工 业
1999 年第 4 期
1. 2. 3 重复 3 次加菌的微生物挑战试验 此方法参照国际 CT F A( 国际化妆品、香精和洗
·44·
表 2 28 天微生物( 霉 菌) 挑战性试验结果( 菌落数/ g 产品)
防腐体系
编号
0
1
1. 3×105
2
1. 0×105
3
1. 6×105
4
1. 1×105
5
1. 4×105
6
3. 8×105
7
2. 5×105
8 空白 空白
1. 0×105 2. 4×106 1. 0×105
检测时间( 加菌后天数)
微生物挑战性实验在人为加菌方面, 有一次性或 多次加菌。为探讨和开展这方面的工作并提供一些经
验, 我们尝试了两种加菌方法的微生物挑战性实验, 对几种防腐剂体系的防腐力进行了研究。
1 材料与方法 1. 1 化妆品中常用的防腐体系[ 6]
选择了 8 种化妆品中常用的防腐体系按常规方 法加入膏霜内, 同时设 2 个对照膏霜( 不含任何防腐 剂) 。防腐体系 1 是 0. 1% 国产菌霉克星; 体系 2 是 0. 1% 国产菌霉克星、0. 2% 尼泊金甲酯、0. 1% 尼泊金 丙 酯; 体 系 3 是 0. 04% 国 产 CY-1; 体 系 5 是 国产 CY-1、0. 2% 尼泊 金甲酯、0. 1% 尼泊金 丙酯; 体 系 5 是传统的尼泊金甲酯和丙酯与极美Ⅱ配伍; 防腐体系 6、7 和 8 是含同种防腐剂, 体系 6 为低 浓度, 体系 7 是高浓度, 体系 8 是高浓度与其它防腐剂配伍。 1. 2 微生物挑战性实验
8
3. 5×104 2. 2×104
第二次加菌
第三次加菌
7 天后 14 天后 14 天后
5. 6×106
2. 1×106
1. 1×105 6. 3×104 3. 2×104
1. 0×105 7. 5×104 3. 3×104
1. 8×105 6. 7×104 6. 8×104
6. 4×104 5. 3×104 3. 5×104
0 2. 0×106 1. 2×105
21 5. 0×104 1. 0×105 6. 0×105 3. 0×105
0 3. 7×105 1. 0×103
0 1. 2×106 1. 7×105
28 5. 0×104 1. 0×105 1. 0×105 7. 0×104
0 6. 6×105
0 0 4. 1×106 2. 4×106
7
14
21
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1. 7×103 3. 7×103 2. 2×104
0
0
0
0
0
0
5. 0×106 2. 1×106 2. 5×106 5. 0×104 6. 0×104 1. 2×105
28 0 0 0 0 0 5. 4×104 0 0 3. 2×106 2. 8×106
表 3 重复三次 加细菌的微生物挑战试验结果 ( 菌落数/ g 样品)
关键词 微生物挑战性试验 化妆品防 腐 评价
防腐剂是化妆品工业中非常重要的部分[ 1, 2] 。随
着化妆品种类和剂型的繁多, 及高科技生物原料应用 的增加, 许多化妆品公司都在积极研究防腐剂问题 ( 包括其品种和使用浓度) , 并不断建立新的防腐体 系。在评价防腐剂的实际效果中, 应用最为广泛和经 典 的 研 究 手 段 是 微 生 物 挑 战 性 试 验 ( m icrobial challeng e t est ing ) [ 3～6] 。这种测试方法是根据化妆品 生产和消费者使用中可能存在的污染( 一次污染和二 次污染) , 人为地将一定量的微生物( 细菌和霉菌) 加 入到产品中, 然后间隔一定时间分析该产品中防腐剂 对微生物的作用, 按检测期间加菌产品的含菌量来评 判防腐剂的防腐效果与否或大小, 这种方法在评价防 腐剂防腐效果上有很高的参考价值。
( 1) 防腐效果优良( W) , 即三次加菌后, 在每次 加菌后的第 7 天或 14 天时, 存活菌量减少至不高于 起始浓度的 0. 01% ( 即≤100 个/ g 或 mL 样品, 通过 测试) 。
( 2) 防腐效果尚可( M ) , 即三次加菌后, 在每次 加菌后的第 7 天或 14 天时, 存活菌量减少至不高于 起始浓度的 0. 1% , ( 即≤ 1000 个/ g 或 mL 样品, 通 过测试) 。