酶工程 第五章

第四节 酶蛋白侧链基团修饰
酶蛋白侧链基团修饰一般采用化学手段，故属于化学 修饰法。所采用的各种小分子化合物称为侧链基团修饰剂。 不同的侧链基团所使用的修饰剂各不相同，可根据需要加 以选择。现将几种常用的小分子侧链基因修饰剂介绍如下：
一、氨基修饰剂
凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化台物，称为 氨基修饰剂。主要的有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、亚硝酸、乙亚腔甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二 酸酐等。这些修饰剂作用于酶蛋白侧键上的氨基或产生脱 氨基作用，或与氨是共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原 有的副链改变，从而改变酶蛋白的构象。
第—节 金属离子置换修饰
用于酶分子修饰的金属离子，往往是二价金属离子。例如 Ca 2 , Mg 2 , Mn2 , Zn2 , Co 2 , Cu 2 , Fe2 等等。金属离子置换修饰法只适用于本来 在结构中含有金属离子的酶。 在离子置换修饰的过程中，首先要加入一定量的乙二胺四乙酸 (EDTA)等金属螯合物到酶液中，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯 合物，此时酶成为无活性状态。通过透析或超滤、分于筛层析等方法， 可将EDTA-金属螯合物从酶液中分离除去。然后用不同的金属离子加到 酶液中，酶蛋白与金属离子结合。根据离子种类的不同，经离子置换 后的酶将会出现不同的特性。有些修饰酶活性比原来酶的活性降低， 甚至完全无活性；有些修饰酶的活性比原酶活性提高；有些修饰酶的 稳定性比原酶增加等。所以只要选择到适宜的金属离子作修饰剂，去 置换原来的金属离子，就有可能提高酶活力，增加酶稳定性。
第二节
大分子结合修饰
二、通过修饰增加酶的稳定性
各种酶在保存或使用一段时间以后，由于受到各种因 素的影响，原来完整的空间结构将会逐渐受到破坏，致使 酶活力逐步降低，最后完全丧失其催化功能。可见酶的稳 定性较低是普遍存在、有待提高的问题。 酶的稳定性可用其半衰期来表示。酶的半衰期是指酶 的活力降低到原来活力一半时所经过的时间。不同的酶有 不同的半衰期。有的酶半衰期长，说明其稳定性好，而稳 定性差的酶其半衰期则短。有些作为药物使用的酶，进入 体内后由于受机体各种因素的影响，往往稳定性差，半衰 期短。例如，对治疗血栓有显著疗效的尿激酶，在人体内 半衰期只有2～20min；有多种疗效的超氧物歧化酶，在 人体内半衰期仅为6min左右等等。为此，如何增加酶的稳 定性，延长酶的有效作用时间，是酶工程的一大重要课题。
第二节
大分子结合修饰
为了使酶的稳定性增加，必须设法使酶的空间结构稳 定，特别要使酶活性中心的构象得到保护。采用其他大分 子与酶合，形成复合物，就可起到保护酶的天然构象的作 用，从而增加酶的稳定性。 可以与酶结合的大分子很多。归纳起来，可分为不溶 于水和溶于水两大类。用不溶于水的大分子与酶结合制成 固定化酶后，酶的稳定性可显著增加。而用可溶于水的大 分子与酶结合进行酶分子修饰，可在酶的外围形成保护层， 使酶的空间构象免受其他因素的影响，从而增加酶的稳定 性，延长其半衷期。现以超氧物歧化酶(SOD)为例说明如 下：
三、胍基修饰剂
精氨酸含有胍基。胍基可与二羰基化合物缩合生成稳 定的杂环。所以二羰基化合物，如环已二酮、乙二醛、苯 乙二醛等，都可以用作胍基修饰剂。经过胍基修饰后的酶 蛋白，其空间构象将有所改变
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
Biblioteka Baidu四、巯基修饰剂
蛋白质的半胱氨酸残基侧锭中含有巯基。巯基在许多 酶中充当活性中心的催化基团，巯基可与另一巯基形成二 硫键，对维持酶的结构稳定性起重要作用。若经修饰，使 酶蛋白侧链的巯基发生改变，将对酶的特性或功能起显著 影响。 常用的巯基修饰剂有：二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫 酸盐、硼氢化钠等还原剂以及各种酰化剂、烷基化剂等。
第三节 肽链有限水解修饰
有些酶蛋白原来不显示酶活性或酶活力不高，利用某 些具有高度专一性的蛋白酶对它进行肽链有限水解修饰， 除去一部分肽段或若干个氨基酸残基，就可使其空间构象 发生某些精细的改变有利于活性中心与底物结合并形成准 确的催化部位，从而显示出酶的催化活性或提高酶活力。 例如：胰蛋白酶原不显示酶活性，用蛋白酶进行修饰，使 该酶原水解除去一个六肽，即可显示出胰蛋白酶的催化活 性；天门冬氨酸酶通过胰蛋白酶进行修饰，从其羧基末端 水解切除10多个氨基酸残基的肽段，可使天门冬氨酸酶的 活力提高4～5倍以上。
第三节 肽链有限水解修饰
有些酶原来具有抗原性，这除了酶的结构特点以外，还由于酶是 大分子。蛋白质的抗原性与其分子大小有关，大分子的外源蛋白往往 出现较强的抗原性；而小分子的蛋白质或肽段，其抗原住较低或者无 抗原性。所以，若将酶分子经肽链有限水解，其分子量减小，就会在 保持其酶活力的前提下，使酶的抗原性显著降低，甚至消失。例如： 将木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，使其全部肽链的三分之 二被水解除去，该酶的酶活力保持不变，而其抗原性大大降低。又如： 酵母的烯醇化酶经有限水解除去由150个氨基酸组成的肽段后，酶活 力仍可保持，抗原性却显著降低。 对酶进行肽链有限水解，通常使用专一性较强的蛋白酶或肽酶为 修饰剂。此外也可采用其他方法使肽链部分水解，达到修饰目的。例 如，枯草杆菌中性蛋白酶，先用EDTA处理，再经纯水或稀盐缓冲液透 析，可使该酶部分水解，得到仍有蛋白酶活性的小分子肽段，用作消 炎剂使用时，不产生抗原性，表现出良好的治疗效果。
酶工程
第五章 酶分子修饰
第—节 金属离子置换修饰
通过改变酶分于中所含的金属离子，使酶的特性 和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。简称 为离子置换法。 有些酶含有金属离子。而且金属离子往往是酶活 性中心的组成部分，对酶的催化功能起重要作用。例 Ca 2 ，谷氨酸脱氢酶的 Fe2 ，过氧 如：α -淀粉酶的 2 化氢酶中的 Zn 等等。 若从酶分子结构中除去其所含的金属离子，酶往 往会失活，若重新加入原有的金属离子，酶可以恢复 原有活性，若加进不同的金属离子，则可使酶呈现不 同的特性。有的可使酶活性降低，甚至失活；有的却 可使酶的活力提高并增加酶的稳定性。
第二节 大分子结合修饰
酶大多数是从动物、植物或微生物中获得的蛋白质。 对于人体来说是一种外源蛋白。当酶非经口(如注射)进入 人体后，往往会成为一种抗原，刺激体内产生抗体。当这 种酶再次注射进体内时，抗体就会与作为抗原的酶特异地 结合，而使酶失去其催化功能。所以药用酶的抗原性问题 是影响酶在体内发挥其功能的重要问题之一。 抗体与抗原之间的特异结合是由于它们之间特定的分 子结构所引起的。若抗体或抗原的特定结构改变，它们之 间就不再特异地结合。故此采用酶分子修饰方法使酶的结 构产生某些改变，就有可能降低甚至消除其抗原性。 利用水溶性大分子对酶进行修饰，是降低甚至消除酶 的抗原性的有效方法之一。例如，精氨酸酶经聚乙二醇 (PEG)结合修饰后，其抗原性显著降低；用聚乙二醇对色 氨酸酶进行修饰，可完全消除该酶的抗原性；聚乙二醇结 合修饰后的L-天门冬酰胺酶，其抗原性可完全消除。
第二节 大分子结合修饰
超氧物歧化酶SOD，属氧化还原酶类。SOD广泛存在于 生物体内。它可以催化超氧负离子(O2-)进行氧化还原反 应。反应时，一个超氧负离子被还原为双氧水，同时另一 个超氧负离子氧化为氧气。其反应方程式如下：
第二节 大分子结合修饰
由于SOD能消除体内的超重负离子，所以受到医药界 的极大关注。实验证明，外源SOD具有保护DNA、蛋白质和 细胞膜的作用，使它们免遭超氧负离子的破坏。对治疗类 风湿性关节炎、白内障、膀胱炎、皮肤炎、红斑狼疮等疾 病疗效较好，对辐射有防护作用。同时，不管用何种给药 方式，均没有发现任何副作用。由此可见，SOD是一种很 有前途的药用酶。然而，超氧物歧化酶在体内稳定性差， 当采用静脉注射方式给药时，SOD在体内的半衰期只有6～ 30min，这大大影响其使用效果。 用水溶性大分子结合法修饰超氧物歧化酶，可使其在 体内的稳定性显著提高，半衰期可延长70～300多倍。并 可明显抑制注射时出现的局部刺激反应。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
二、羧基修饰剂
可与酶蛋白侧链上的羧基反应的小分子化合物称为羧 基修饰剂。羧基修饰剂可使羧基酯化、酰基化或结合生成 其他物质，改变酶蛋白的空间构象，从而改变酶的某些特 性与功能。最早用来修饰蛋白质侧链羧基的修饰剂是乙醇 -盐酸试剂，它可使羧基产生酯化作用。此外，水溶性的 碳化二亚胺、异恶唑盐等也可选择性地对羧基进行修饰。
第二节
大分子结合修饰
一、通过修饰提高酶活力
酶的催化能力受诸多因素的影响。本质上是由其特定 的空间结构，特别是由其活性中心的特定构象所决定的。 水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后，可使酶的 空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和底物 结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力得以提高。 例如：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可 使该酶的活力提高到原有的活力的2.25倍；用右旋糖酐修 饰胰凝乳蛋白酶，当每分子酶与11分子右旋糖酐结合时， 修饰酶的活力达到原有的活力的5.1倍；每分子胰蛋白酶 用11分子的右旋糖肝修饰后，酶活力可提高30％等。
第二节 大分子结合修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某 些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分 子结合修饰法。简称为大分子结合法。 通常使用的水溶性大分子修饰剂有：有旋糖酐、聚乙 二醇、肝素、蔗糖聚合物(Ficoll)、聚氨基酸等。这些大 分子在使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分 子以共价键结合。对酶分子进行修饰。例如：右旋糖酐先 经高碘酸(HIO4)活化，然后与酶分于的氨基共价结合。
第三节 肽链有限水解修饰
酶的催化功能主要决定于酶的活性中心的构象，活性 中心部位的肽段对酶的催化作用是必不可少的，而活性中 心以外的肽段起到维持酶的空间构象的作用。 酶蛋白的肽链被水解以后，将可能出现以下3种情况 中的一种。若肽链水解后引起酶活性中心的破坏，则酶将 失去其催化功能；若将肽链的一部分水解后，仍可维持其 活性中心的完整构象，则酶的活力仍可保持或损失不多； 若肽链的一部分水解除去以后，有利于活性中心与底物的 结合并且形成准确的催化部位的话，则酶可显示出其催化 功能或使酶活力提高。在后两种情况下，肽链的水解在限 定的肽键上进行，称为肽链有限水解。 利用肽链的有限水解，使酶的空间结构发生某些精细 的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限 水解修饰。
第二节 大分子结合修饰
此外，修饰酶的热稳定性可显著提高，并具有较强的 抗蛋白酶水解、抗酸碱以及抗氧化的能力。例如：L-天门 冬酰胺酶用聚丙氨酸结合修饰后，其对热的稳定性大大提 高；木瓜蛋白酶与右旋糖酐结合，显著增强其抗酸碱和抗 氧化能力。
三、通过修饰降低或消除抗原性
当外源蛋白非经口进入人或动物体内后，体内血清中 就可能出现与此外源蛋白特异结合的物质。这些物质称为 抗体。 能引起体内产生抗体的物质称为抗原。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
酶蛋白侧链基团就是指组成蛋白质的氨基酸残基上的 功能团。这些功能基团主要有氨基、羧基、巯基、咪唑基、 吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等。这些基团可组 成各种副键，对于蛋白质空间结构的形成和稳定起着重要 作用。如果这些功能基团发生改变，就会引起副键的改变， 使空间结构发生某些改变，从而引起酶的特性和功能的改 变。 酶蛋白侧链基团的修饰可以使用各种小分子物质，也 可使用各种大分子物质。其中使用水溶性大分子与侧链基 团结合的属大分子结合修饰，已在本章第二节阐述。使用 不溶性大分子与酶侧链基团结合的属于结合固定化方法， 将在下一章介绍。本节主要介绍各种小分子化合物与酶蛋 白侧极基团相互作用的修饰方法。
第二节
大分子结合修饰
第二节
大分子结合修饰
由于酶的结构各不相同，所以不同的酶所结合的修饰 剂的种类和数量也有所差别，修饰后酶的特性和功能的改 变情况也不一样。必须通过试验确定最佳的修饰剂的种类 和浓度。操作时需根据所要求的分子比例控制好酶和修饰 剂的浓度，并控制好温度、pH值和反应时间等修饰条件， 以便获得理想的修饰效果。 大分子结合修饰品是目前应用最广的酶分子修饰方法。 经过此法修饰的酶可显著提高酶活力，增加稳定性或降低 抗原性。