酶学第五章 酶的分离纯化与制剂

主讲教师：赵丹丹 第五章 酶的分离纯化与制剂 13
一、预处理和破细胞
4. 细胞破碎（cell disruption）
(6) 注意微生物的种类不同处理方法及难易程度也有差异。
霉菌：易处理 细菌：少量超声和溶菌酶；大量丙酮干粉法或自溶法；工业生产中， 细菌材料可以用细菌磨或挤榨器等处理。 酵母：由于其壁厚较难对付，过去多用自溶法，后来采用的办法有： ①细胞壁溶解酶处理法；②稀盐溶液振荡法；③冷热破壁法。
(4) 其他
破细胞时，某些亚细胞结构也往往受到损伤，这样就可能给抽提系统 带来各种不稳定因素。因此，有时在抽提液中还需要加入某些物质。 例如，为防止蛋白酶的破坏性水解作用可加入苯甲基磺酰氟 （PMSF），为防止氧化等因素的影响可加入半胱氨酸、惰性蛋白和 底物等。
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二、抽 提
4. 酶提取的注意事项 (2) 盐 大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，所以，抽提液一 般采用等渗盐溶液，最普通的有0.020～0.05mol/L的磷酸缓冲液， 0.15mol/L NaCl溶液等。 焦磷酸钠溶液和柠檬酸钠缓冲液，由于有助于切断酶和其他物质的联 系，并有整合某些金属的作用，因此用得也很多。 某些报道表明，少数情况下，如抽提霉菌脂肪酶，用水的效果亦佳， 这可能与低渗可破坏细胞结构有关。
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一、酶分离纯化的概述
3. 酶与一般蛋白质纯化过程相比独有的特点：
(1) 特定的一种酶在细胞Leabharlann Baidu的含量很少；
给纯化带来了麻烦
(2) 酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。
迅速找出纯化过程的关键
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二、防止酶变性失效
除了少数例外，所有操作都必须在低温条件下进行，特别是在有机 溶剂存在的情况下更应小心； 大多数酶在pH＜4或pH＞10的情况下不稳定，应控制整个系统不 要过酸、过碱，同时要避免在调整pH时产生局部酸碱过量； 酶和其他蛋白一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故 操作时要尽量减少泡沫形成； 重金属等能引起酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋 白水解酶的存在都能使酶分解破坏，所有这些必须高度重视。
3. 常用的浓缩的方法有以下几种
(1) 蒸发 (Evaporation)
① 减压蒸发浓缩法：效率低、费时间、要加热、产泡沫、易变性，不 能用于稳定性较差的酶。同时，蒸发过程还可能出现增色现象，影 响产品的质量 ② 超蒸发浓缩法：让暖空气流通过冷的酶溶液表面，或让暖空气流通 过装有酶液的透析袋使之加速蒸发，但此法效率不佳 ③ 薄膜蒸发浓缩：现在应用较多
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第二节 酶的抽提
抽提的要求是要将尽可能多的酶、 尽量少的杂质从原料引入溶液。
主要内容：预处理和破细胞
抽提
浓缩
一、预处理和破细胞
着手酶的提取前，通常应先对酶的原料进行适当的预处理 (Pretreatmention)。例如： (1) 动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织和血污等 ； (2) 油质种子最好先用乙醚等脱脂； (3) 种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染； (4) 对于微生物材料则应将菌体和发酵介质加以分离。 2. 在这些预处理后，尽可能以非常新鲜的状态直接应用; 否则，应将 完整材料立即冰冻保存。
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二、抽 提
5. 结合紧密的结酶
常以脂蛋白络合物形式存在。
有的在做成丙酮粉末以后就可抽出，有的则需要使用较强烈的手段， 用正丁醇等处理。正丁醇的特点是兼具高度的亲水性和亲脂性(特别 是磷脂)，能破坏酶与脂蛋白的连结使酶进入溶液。 近年来广泛采用的还有各种表面活性剂和去污剂，如胆酸盐、Triton、 Toween等，它们常用于抽提呼吸链系统的酶系。
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二、抽 提
4. 酶提取的注意事项 (1) pH 应考虑的是酶的酸碱稳定性，选择的pH不能超出酶的稳定范围。 从最佳的抽提效果而言，选择的pH最好远离目的酶的等电点。也就 是说，酶如果是酸性蛋白质，则宜用碱性溶液抽提，反之，碱性蛋白 质宜用酸性溶液。例如胰蛋白酶的抽提，通常选用0.125mol/L的硫酸， 这是因为除了考虑到酶的稳定性、溶解性外，这种抽提条件下溶入的 杂质也较少。 考虑到有利于切断酶和细胞内其他成分间可能有的联系，通常以选用 pH4～6为佳。
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三、浓 缩
抽提液和发酵液中酶的浓度一般都很低，所以在进行纯化 前往往须先加以浓缩 (Concentration)
作用：
(1) 每一步的回收率升高；
(2) 酶和蛋白质在浓溶液中的稳定性也往往较高。
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三、浓 缩
第五章 酶的分离纯化与制剂
主要内容：酶分离纯化的一般原则、酶的抽 提、酶的纯化原理与方法、酶的纯度与产量、 酶的纯度与产量、酶的剂型与保存
第一节 酶分离纯化的一般原则
预防蛋白质变性失效的方法与措施
主要内容：防止酶变性失效 选择有效的纯化方法 酶活性测定贯穿纯化过程的始终
一、酶分离纯化的概述
酶工业生产中属于下游技术！
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三、浓 缩
3. 常用的浓缩方法
(1) 蒸发
薄膜蒸发浓缩，即将待浓缩的酶溶液在高度真空条件下变成极薄的 液膜，并使之与大面积热空气接触，让其中的水分瞬时蒸发而达到 浓缩的目的。 薄膜蒸发浓缩器有三种形式：升膜、降膜和刮板。 对于较粘稠 的样品，后一种形式似乎更为适合，不过薄膜浓缩常会带来增色现 象。
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一、预处理和破细胞
3. 根据酶的分布可分为细胞内酶和细胞外酶。
(1) 细胞外酶在合成以后就直接分泌到介质中，因而没有破细胞问题；
(2) 细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，而且抽提效果往往和 酶在细胞内的分布位置、存在状态以及细胞破碎的程度有关。
‘‘周质酶”（periplasmic enzyme）通常只需将外层细胞壁或膜 破坏后就可释放；
最终目的（ 获得高度纯净的酶制剂 ）
整个工作包括三个基本环节： (1) 抽提（extraction）：是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液；
(2) 纯化（purification）：是将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从 包含杂质的溶液中分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去；
(3) 制剂（preparation）：是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。
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一、预处理和破细胞
4. 细胞破碎（cell disruption）
(2) ‘‘丙酮干粉’’（acetone powder）处理法 适用于微生物材料 一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低温条件下、加 入5～10倍预先冷至约-20℃的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后 低温干燥，研磨过筛 丙酮处理优点： ① 能有效地破坏细胞壁（膜）；② 有利于除去大量脂类物质，以免 它在以后的步骤产生干扰；③ 能使某些膜结合酶易于溶解；④ 丙酮 干粉含水量低，便于保存。 缺点：丙酮可能引起某些酶变性失效。
DTT, 巯基乙醇
EDTA, 柠檬酸 TritonX-100(聚乙二醇辛基苯 基醚, 中文名为曲拉通X-100 )
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二、抽 提
7. 新技术
“扩展床吸附层析”（expanded bed adsorption chromatography）
商品名：STREAMLINE 简化分离纯化工作，开发了一种将抽提液的分离和相继的纯化步骤结 合在一起的技术 通过这一技术人们可以直接从含有颗粒体的物料，如发酵液、细胞破 碎液中截获所需要的蛋白质或酶，移去颗粒成分，从而免除了离心、 过滤，甚至浓缩等繁复的下游（downstream）步骤。
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一、预处理和破细胞
4. 细胞破碎（cell disruption）
(3) 物理破碎法 ① 温度差破碎法 ② 压力差破碎法：高压冲击法；突然降压法；渗透压差法 ③ 超声波破碎法 (4) 化学破碎法 有机溶剂处理 表面活性剂处理
(5) 酶法破碎法 ① 外加酶处理 ② 自溶法(Autolysis) 所谓自溶，就是将浓的菌体悬液在适宜的温 度与pH条件下直接保温，或加甲苯、乙酸乙酯 以及其他溶剂一起保温一定时间，让菌体自溶 液化。 有人认为不是好方法，理由是： 第一，自溶液中成分十分复杂； 第二，有破坏目的酶的危险。
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典型的抽提液组成成分
0.15mol/L KCl 0.3mol/L 蔗糖
常见抽提液成分
KCl, NaCl, 蔗糖 各种缓冲液 甘油、DMSO(二甲基亚砜) PMSF(苯甲基磺酰氟)
作用
离子强度调节剂 pH缓冲剂 温度效应剂
蛋白酶抑制剂 抗氧化剂
重金属络合剂 增溶剂
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二、抽 提
4. 酶提取的注意事项
(3) 温度
通常，抽提温度多控制在0℃～4℃左右。如果待纯化的酶比较稳定， 则可以例外。 例如，胃蛋白酶就可在37℃条件下保温抽提。
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二、抽 提
4. 酶提取的注意事项
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四、酶活性测定贯穿纯化过程的始终
酶具有催化活性，通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的 抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据。 从原料开始，整个过程中每一步都要进行比活力与总活力的检测与 比较，这样，我们就能知道在某一步骤中可采用些什么方法与什么 条件，它们分别使酶的纯度提高了多少，回收了多少酶，从而决定 其取舍。
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二、抽 提
抽提方式 “普遍”抽提； 选择性抽提，即先后用不同溶剂进行选择性抽提。 由于大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱的水溶 液。但抽提液的具体组成和抽提条件的选择则取决于酶的溶解性、稳 定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。 3. 酶提取的主要方法 (1) 盐溶液提取 (2) 酸、碱溶液的提取 (3) 有机溶剂提取 1. (1) (2) 2.
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三、选择有效的纯化方法
酶纯化的最终目的是要将酶以外的一切杂质(包括其他酶)尽可能地 除去，因而，容许在不破坏待纯化的“目的酶”的限度内，使用各 种“激烈”手段。 由于酶和它作用的底物、它的抑制剂等具有高的亲和性，因此可应 用各种亲和分离法；而且，当这些物质存在时，酶的理化性质和稳 定性往往会发生一些有利的变化。这样又扩大了纯化方法与纯化条 件的选择范围。
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三、浓 缩
3. 常用的浓缩方法 (2) 超过滤（ultrafiltration） 在加压情况下，将待浓缩液通过一层只允许水分子和小分子选择性 透过的微孔滤膜，而将酶等大分子被滞留，从而达到浓缩目的的一 种技术。 优点： 没有破坏；没有相变化；保持原来的离子强度和pH；如果膜选择 适当，浓缩过程还可能同时进行粗分，成本也不高，故为人们所乐 用。 超过滤可用于小量样品，也可用于工业生产规模，现在已有各种超 过滤装置可供选择。
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二、抽 提
6. 抽提液
(1) 用量通常为原料量的1～5倍，有时为了提高抽提效果，要进行反复 抽提，这样，液量就可能大些。
(2) 抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成分一般可用离心法或压滤法除 去，植物原料的抽提液在冷室中放置过夜往往就会自动澄清。 某些情况下，在进行抽提液离心前，加入氢氧化铝凝胶或磷酸钙胶 等物质，常有助于除去悬浮的胶体物质。
“膜结合酶’’（membrane-binding enzyme）则往往还有一个切 断酶与颗粒体或膜的连结问题。
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一、预处理和破细胞
4. 细胞破碎（cell disruption）
(1) 机械破碎法 机械捣碎法，绞肉机、高速组织捣碎器 研磨法 匀浆法 高速捣碎器操作简便、破碎效果高，但易引起局部温度过高，导致酶 失效； 加石英砂研磨，特别是用玻璃粉或氧化铝代替石英砂时，要注意有时 也可能发生吸附变性。 在上述机械处理后，为了有利于下一步抽提，可进一步作成丙酮干粉， 或者进行反复冰冻溶解处理。