细菌分离培养及药敏试验方法及步骤
大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案
鸡致病性大肠杆菌的分离培养及药敏实验实验基本步骤：样品→肝、脾触片革兰氏染色镜检→普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板分离培养→革兰氏染色镜检、生化实验鉴定→普通肉汤培养基增殖培养→药敏实验。
1 病料采集1.1 准备材料：试管、载玻片、手术刀、手术剪、结扎绳、记号笔、冰块、泡沫箱、口罩、手套（该灭菌的都进行高压蒸汽灭菌）、冰箱。
1.2 取材部位：血液、肝脏、脾脏、肠内容物，若有鸡胚感染则去鸡胚及卵黄物。
1.3 操作方法：将病死鸡浸泡在消毒剂溶液中，打开腹腔，无菌采集肝脏、脾脏放于事先准备好的灭菌试管内，将带有肠内容物的肠管两端结扎放于灭菌是试管内。
将有明显病变的脏器入肝、脾进行触片，做好标记。
都贴上标签，标示采集样品，来源地，采集时间，采集人。
将装有病料的试管放在放有冰袋的泡沫箱中，及时返回实验室，置于4℃冰箱待检。
2 菌的分离培养及鉴定2.1 准备材料：光学显微镜、革兰氏染色液、载玻片、手术刀、接种环、平皿、恒温箱、高压锅、摇床、酒精灯、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化发酵管，蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL pH7.4），葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、VP指示剂、超净台。
培养基：A. 普通琼脂培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、蒸馏水1000ml，ph7.3±0.1），B. 麦康凯琼脂培养基（蛋白胨20g、牛胆盐5g、氯化钠5g、琼脂15g，乳糖10g、结晶紫0.001g、中性红0.025g，ph7.2±0.2。
），C. 营养肉汤培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、蒸馏水1000ml，ph7.2±0.2）。
2．2 样品触片镜检涂片镜检：取触片,进行革兰氏染色镜检。
2.2.1在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1min，水洗。
2.2.2 加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。
鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验
１ ． ２ ． ７ 动物试验
将纯 培养的细菌接种 一 ｆＳ ｍｌ 营 养肉汤。
置 于３ ７ ℃培养２ ４ ｈ 。取２ ０ 只小 白 鼠，雌雄各 半 随机 分为
２ Ｎ ，试 验组 小 白鼠为１ ４ 只 ，腹腔 注射菌 液０ ． １ ｍｌ ／ 只 ；对 照组小 自鼠６ 只 ，注 射Ｄ Ｈ值为７ ． ６ 的生理盐水０ ． １ ｍｌ ／ 只 ，４ ｈ
关键词 鸡 白痢 沙 门氏 分离 鉴定 药敏 试验
中图分类号 ：￥ ８ ５ ２ ． ６ １
文 献标识码 ：Ａ
文章编号：１ ０ ０ ７ ． １ ７ ３ ３ （ ２ ０ １ ４ ） ０ １ － ０ ０ ｔ ２ ． ０ ３
酵管和 其他 生化反 应管 中 ，置 于３ ７ ＂ Ｃ温箱培养 ，每 曰观 察 ；采 用 沙 门 氏菌 诊 断 ｍ清 对 分 离 菌株 进 行ｊ ｆ 【 Ｌ 清 型鉴
取肺 组织进 行真 菌分 离培养 来分 离到任何 真菌 ；于
盲肠 内榆查到异刺线虫７ 条 ，ｆ肠道榆 查到绦虫ｌ 条 ，除此 之外 ，末见其他寄生虫和虫卵。 ３ ． ３ 分离菌株培养特性
特 征 。将细 菌 纯 培 养物 接 种 于 ｊ 糖 铁 琼 脂 ，３ ７ ＂ Ｃ培 养
２ ４ ｈ。
所。
养物分别用灭菌生理盐水冲洗 ，稀释 成浓度 为３ ｘ ｌ Ｏｔ ｅ ｆ ｕ ／ ｍｌ
的荫 液 ，吸取稀释 菌液 均匀涂 布 于普通平板 。室温 放置
５ ａｉ ｒ ｎ 后 ，分别 贴上 符 种药 敏 纸片 ，３ ７ ＂ Ｃ条件 下培 养 １ ６ ～
１ ８ ｈ ，观 察 并 测 量 抑 菌 环 大 小 。
细菌的分离、培养和鉴定
生化鉴定管
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养 基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴动化微生物鉴 Expression： 定和药敏分析系统
分子生物学技术
分子生物学鉴定目前比较流行的主要是核 酸检测技术, 酸检测技术, 包括基因测序、指纹图谱技术、 基因探针技术、聚合酶链反应( PCR)、 基因探针技术、聚合酶链反应( PCR)、GC 含量测定等。 PCR和核酸杂交单独或结合在仪器已经形成 PCR和核酸杂交单独或结合在仪器已经形成 比较经典的核酸检测技术, 比较经典的核酸检测技术, 目前这两者已经 得到了较大范围的推广和应用
具体操作： 具体操作：
• 取病料，将体表的泥沙等杂物用清水冲洗干净 取病料， • 取干净托盘，将病料置于托盘中 取干净托盘， • 托盘置于工作台上，接种前准备好酒精灯、接种 托盘置于工作台上，接种前准备好酒精灯、
环、酒精棉球、解剖刀、剪刀、镊子等。事先作 酒精棉球、解剖刀、剪刀、镊子等。 好准备工作， 好准备工作，把所用的物品器械摆好 • 解剖病料，将接种环烧红冷却后接触病变部位， 解剖病料，将接种环烧红冷却后接触病变部位， 平板划线。如体表创伤溃烂部位，病变内脏。 平板划线。如体表创伤溃烂部位，病变内脏。腹 水可直接涂布平板 • 平板置于28℃ 恒温培养箱培养24h，观察细菌生 平板置于28℃ 恒温培养箱培养24h， 长状况 注意： （注意：操作台在使用前后都需要用酒精棉球擦拭 台面，保持操作台的整洁） 台面，
鱼的解剖结构：
2）无菌操作
无菌操作是指在环境中一切有生命活动的微生物的 营养细胞及其芽孢或孢子都不存在的状态。微生物 研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作 对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须 经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情 况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、 器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事 先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸 30min，玻璃器皿可高压灭菌也可干热灭菌，胶皮 30min，玻璃器皿可高压灭菌也可干热灭菌，胶皮 塞、培养基等则要高压灭菌。
幼鹅感染鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及药敏试验
幼鹅感染鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及药敏试验一、引言鸭疫是一种由鸭疫里默氏杆菌引起的急性传染病，主要发生在水禽中，特别是对于幼鸭来说更为致命。
鸭疫病症主要表现为高热、抑郁、呼吸急促、鸭群死亡率极高，对农业生产造成了严重的危害。
对鸭疫病原菌的分离鉴定及药敏试验成为显得尤为重要。
二、分离鉴定1. 样品采集从患有鸭疫的幼鹅体内取样，如肺、脾、肝等内脏组织进行采集。
将样品放入无菌离心管中，冷链运输至实验室。
2. 细菌分离将取样的组织进行匀浆处理，然后用无菌梳子在无菌平板上均匀涂布。
置于37℃培养箱中培养24-48小时，直至出现细菌克隆。
3. 形态特征观察观察克隆菌落的形态特征，里默氏杆菌在培养基上呈现为小、灰白色，透明且呈环形的菌落，细菌呈杆状。
4. 生理生化特性鉴定将分离的细菌进行革兰氏染色，鉴定其为革兰氏阴性菌；进行氧化酶试验、嗜碱性酸加索试验等生化鉴定来确认细菌的特性。
5. 分子生物学鉴定利用PCR技术进行DNA提取和扩增，选择里默氏杆菌特异的引物进行扩增，最后通过测序鉴定其属于里默氏杆菌。
三、药敏试验1. 抗生素选取常见供试的抗生素包括庆大霉素、环丙沙星、卡那霉素、氨苄青霉素、头孢他啶、磺胺类药物等。
2. 药敏试验操作将分离的里默氏杆菌接种于固体培养基上，然后将不同抗生素的药片均匀涂布在培养基上，培养一段时间后观察对抗生素的敏感性。
3. 敏感性判定观察各药片周围是否有抑菌圈，并计算出抑菌圈直径，根据国家卫生部门颁发的药物抗菌圈直径标准来判断药敏性。
4. 结果判定根据药敏试验的结果，选择对里默氏杆菌具有良好疗效的抗生素进行治疗。
四、结语对幼鹅感染鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及药敏试验是鉴定病原体和确定治疗方案的重要手段。
合理的抗生素治疗可以有效控制鸭疫病的传播，保障畜禽养殖业的顺利进行。
希望通过不懈的努力，能够及时发现并有效治疗鸭疫病，保障水禽养殖业的健康发展。
医院常规细菌培养-V1
医院常规细菌培养-V1
正文：
医院常规细菌培养
细菌培养是一种基本的临床检验方法，可帮助医生检测和诊断疾病。
医院常规细菌培养是指在医院中常规使用的一种培养细菌的方法。
一、概述
医院常规细菌培养是指在医院中对尿、血、粪便、喉拭子、胸水、脑脊液等生物样本进行的细菌培养。
通过对这些样本进行培养并分离、鉴定细菌，医生可以获得很多关于病原菌的信息，如类型、数量、毒力等，从而指导临床治疗。
二、操作流程
医院常规细菌培养的基本操作流程如下：
1. 检体采集：根据需要采集相应的生物样本，将检体放入稀释液中。
2. 稀释液稀释：将检体和稀释液按照一定比例混合并稀释，以后续培养步骤为基础。
3. 原液培养：取出一定量的稀释液用于接种。
将稀释液平铺于培养基平板上，经过恒温培养箱孵育，检查是否有细菌生长。
4. 鉴定细菌：对培养出的菌进行鉴定，包括形态学、生化变化、毒力
等方面。
5. 药敏试验：对所分离的细菌进行药敏试验，以指导治疗。
三、注意事项
医院常规细菌培养需要注意以下事项：
1. 无菌操作：检测生物样本和进行培养和鉴定过程中需要维护无菌操作，以避免细菌交叉感染。
2. 培养基选择：培养基选择要根据不同的检测目的和检测物质特性选择适合的培养基。
3. 培养参数控制：包括温度、湿度、时间等参数的严格控制可以确保检测结果准确可靠。
4. 严格按操作规程执行：对于操作中出现的异常情况要及时处理，并对操作日志进行详细记录。
以上就是关于医院常规细菌培养的概述、操作流程、注意事项等内容的介绍。
医院常规细菌培养可以为医生提供重要的细菌学信息，以指导临床治疗。
药敏试验的原理
药敏试验的原理药敏试验原理药敏试验是一种用于确定细菌的抗生素敏感性的检测方法，主要用于指导临床上的抗菌治疗，以提高治疗效果和避免抗生素的滥用。
药敏试验的原理是通过将不同种类的抗生素与细菌进行反应，观察细菌的生长情况，来确定其对抗生素的敏感性或耐药性。
具体步骤包括以下几个方面：1. 培养细菌药敏试验前需要先从患者的样本中分离出目标细菌，并在培养基上进行培养，使其生长到所需的数量。
通常使用的培养基包括莫乃基、大肠杆菌平板以及血琼脂等。
2. 制备药物药敏试验所使用的药物通常是常见的抗生素，如青霉素、头孢菌素、氨基糖苷类等。
这些药物需要提前配置好，以确保其浓度的准确性和稳定性。
3. 稀释药物将药物稀释成不同的浓度，这些浓度范围从最小浓度开始，逐渐递增至最大浓度，通常会制备8个不同的浓度。
4. 加入细菌将药物加入到已经培养好的细菌中，让其在固定时间内进行吸收。
可以采用不同的方案，如将药物加到固定体积的培养基中，或是通过切开莫米德瓶，在其中加入药物溶液来进行。
5. 观察细菌的生长情况将稀释好的药物加入细菌中后，将其分配到不同的培养基上，通常使用微量进针或是延伸半硬质琼脂板法进行。
然后，将培养基放到恒温箱中进行培养，观察细菌的生长情况和形态。
6. 解读结果并进行分析根据细菌的生长情况来判断其对抗生素的敏感性或耐药性。
根据不同的药物浓度、细菌生长情况和形态，可以简单地确定细菌对药物的敏感性或耐药性。
药敏试验不仅可以指导临床上的抗菌治疗，而且可以在重要疾病爆发时，对于了解不同城市/城镇之间的细菌耐药率变化有帮助。
在药敏试验中，测定细菌对某种药物的敏感性或耐药性的方法有许多种，目前中国临床上主要采用两种常规药敏试验：纸片扩散法和微量进针法。
纸片扩散法纸片扩散法是一种常见的药敏试验方法，主要用于检测各种抗生素对细菌的敏感性。
该方法将已经稀释好的药物加在一个标准莫莫尼格琼脂板上，然后在细菌感染区域中放置一张含有药物的纸片，在培养室中孵化。
药敏实验的操作规程
药敏实验的操作规程
《药敏实验操作规程》
一、实验目的
本实验旨在测试不同药物对细菌的药敏性，为临床用药提供参考。
二、实验材料
1. 不同种类的药物
2. 革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌培养基
3. 培养皿、消毒酒精、移液器、离心机等常规实验器材
三、实验步骤
1. 将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌分别分装于培养皿中，均匀涂布于培养基表面。
2. 在分装有不同药物的培养皿上分别滴加一定量的药物液体，确保液体能够均匀覆盖培养基表面。
3. 将处理好的培养皿置于恒温培养箱中，设置合适的温度和时间，培养细菌。
4. 观察培养皿上不同区域的细菌生长情况，记录并比较各种药物对细菌的影响。
四、实验注意事项
1. 操作过程需注意无菌操作，避免外界污染。
2. 按照实验要求使用药物，注意用药量和涂布均匀性。
3. 实验完成后，将培养皿和实验用具进行正确处理，避免对环境造成污染。
五、实验结论
通过对培养皿上不同区域的细菌生长情况观察和分析比较，得出不同药物对细菌的药敏性，并据此提供临床用药建议。
六、实验意义
药敏实验的结果对临床治疗中的抗菌药物选择，以及对细菌感染病症的诊断和预防具有重要的指导意义。
以上为《药敏实验操作规程》，希望实验者严格按照规程操作，确保实验结果的准确性和可靠性。
药敏试验实验报告
微生物实验报告：
1.抑制或杀死微生物的一些物理，化学和生物因素，抑菌和杀菌原理。
2.掌握物理，化学和生物因素的抑菌，杀菌试验方法。
3.了解细菌的形态特征和染色特征。
4.目的了解常见培养基，选择性培养基和血平板上细菌的菌落特征。
5.掌握细菌分离和株系培养的方法。
6.掌握细菌的主要生化反应。
7.掌握细菌密线画法和细菌K-B药敏盘法。
细菌革兰氏染色，显微镜检查，观察和记录细菌的形态和特征1.1实验原理：染色原理：G +细菌和1.2实验步骤：1.2.1。
准备：1涂片：在干净的载玻片上滴半滴生理盐水，使用无菌操作技术在平板上放一些细菌菌落，将其与生理盐水混合，均匀分布约1cm2，自然干燥。
固定：用酒精灯火焰将载有细菌膜的载玻片来回移动三遍，使膜牢固地粘附在载玻片表面上；1.2.2染色：取一滴或两滴结晶紫覆盖在玻片表面，轻轻摇动，保持30英寸〜40英寸，用水冲洗，不要直接清洗涂片区域；覆盖膜表面，轻轻摇动，保持30英寸〜40英寸，并用细流水冲洗；脱色：在膜表面滴下95％的酒精，轻轻摇动，局部几乎无色，1.2.3显微镜检查：在油镜下，将半滴洗发精油加到涂片区域（100次）目镜）。
实验原理：四区标记法是用接种环使平板培养基表面上的混合微生物或同一微生物种群的不同细胞获得更独立的分布，然后在培养和培养后产生菌落。
再生产。
一些单个菌落不能从单个细胞繁殖，因此必须反复分离以获得纯种。
原理是将微生物样品在固体培养基表面上逐点稀释以达到分离的目的。
猪链球菌的分离鉴定及药敏试验
2017年第2期（总第241期） 试验研究1猪链球菌的分离鉴定及药敏试验宋子杰 孙鑫鹏 王 妍 韩先杰* （青岛农业大学动物科技学院 山东 青岛 266109）摘要 为了确定某猪场仔猪死亡的主要病原菌，分析该病原菌的耐药性，本试验对病死猪进行剖检，并从肺脏、脾脏中分离到一株细菌，随后进行分离菌形态观察、生化试验、细菌16S rRNA 基因测序与药敏试验。
结果表明该株分离菌为革兰氏阳性链状球菌，生化试验结果与链球菌的生化试验结果大致相符；细菌的16S rRNA 基因序列经Blast 同源性比较，与猪链球菌(GenBank CP007497.1)同源性为99%；药敏试验结果表明该株分离菌对氟喹诺酮类、β-内酰胺类多种药物敏感。
细菌分离鉴定和药敏试验的结果为猪场发生该病时药物治疗提供参考依据。
关键词 猪链球菌 分离鉴定 药敏试验中图分类号：S855.1+1 文献标识码：A 文章编号：1007-1733(2017)02-0001-02猪链球菌病是由多种不同群的链球菌引起不同临诊类型的传染病的总称，临床上引起猪链球菌病的主要是猪链球菌[1-3]。
2016年8月，青岛某猪场65日龄左右的仔猪突然发生死亡。
经调查后发现，病猪生前的精神状态、食欲无明显异常。
现场对部分病死猪进行尸体剖检，病死猪的解剖病变大致相同，主要表现为心包积液、混有黄色胶冻样渗出物；肺部肿胀、淤血；肝脏肿胀、淤血；脾脏明显肿大、淤血，颜色呈蓝紫色。
发病已持续20d 左右，造成5头仔猪死亡，给养殖场造成较大的经济损失。
为探明病因，进一步做好该病的防治工作，本文对病死仔猪进行了病原菌分离鉴定与药敏试验，以期为猪场用药治疗该病提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 病料来源 青岛市某猪场送检的病死仔猪，无菌采集病变明显的肺脏、肝脏。
1.1.2 主要试剂 PCR 试剂(10×PCR Buffer 、dNTPs 、Ex Taq 酶)、DL2000 DNA Marker 购自宝生物工程(大连)有限公司；脑心浸液培养基购自青岛海博生物技术有限公司；通用型柱式基因组提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；药敏纸片、细菌微量发酵管购自杭州滨和微生物试剂有限公司；绵羊鲜血琼脂平板(80ml/L)为青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室自制。
细菌培养与药敏试验解读
细菌培养
无菌体液
无菌体液是指除血液、骨髓和脑脊液外的羊膜液、 后穹隆穿刺液、透析液、心包液、腹膜穿刺液和滑 膜液。
留取标本时，为防止无菌体液凝固，在无菌容器 内预先加入灭菌肝素0.5mg（可抗凝5ml标本），再 注入各种穿刺液，轻轻混合。
（非脓性的无菌体液、脑脊液，最好用血培养瓶增菌 培养）
细菌培养
2. 直肠拭子：无菌拭子插入肛门 2-4 cm，在肛门括约 肌处柔和地旋转拭子，可在拭子上明显见到粪便， 立即送到细菌室，患者不能自行采集；
除婴儿患者外，不推荐用拭子做常规性病原菌培 养。
细菌培养
眼、耳、鼻、喉标本 耳、鼻、咽部的细菌感染病原菌一般来源 于口腔。口腔中既有需氧菌也有厌氧菌，故其 周围组织器官的感染不仅考虑是需氧菌，也须 检查厌氧菌； 采集耳、鼻、咽拭子时易被正常菌群污染， 应在采集标本时注意。
但绝不可冷冻，宁可在室温中保存。 4. 采集足够量标本，标本不足可能产生假阴性结果。
细菌培养
标本的运送要求
1、常规性细菌学检验，要及时送到细菌室， 延 迟运送影响病原菌检出。
2、如疑似对低温敏感的淋病奈瑟菌、脑膜炎奈 瑟菌、流感嗜血杆菌感染标本应立即处理。 如：脑脊液、生殖道、眼睛、内耳标本，并
且绝不可以冷藏。
耐万古霉素肠球菌感染防治专家共识：*
几个问题的解读
1、涂片镜检结果与培养结果不吻合？
细菌培养
脑脊液 1、CSF采集后，置于无菌试管中，培养标本绝不能冷
藏，每种检验需要最小量：细菌培养≧1ml，真菌 ≧2ml，抗酸杆≧2ml。 2、CSF的收集：第一管做细菌培养，第二管做生化或 免疫学检查，第三管做常规检查。
细菌培养
尿液
1、最好留取早晨清洁中段尿 清晨起床后用肥皂水清洗会阴部，女性用手分开
猪大肠杆菌病病原鉴定及药敏试验
猪大肠杆菌病病原鉴定及药敏试验猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的肠道传染病，主要表现为仔猪黄白痢和水肿病。
随着养猪业规模化发展，该病呈上升趋势，致使仔猪成活率和断乳窝重降低，严重影响了养猪业的发展。
由于致病性大肠杆菌存在广泛的耐药性，而且血清型多，抗原复杂，给防治带来了极大的困难。
针对某猪场提供的腹泻严重的仔猪黄白痢病料，我们进行了细菌分离鉴定和药敏试验，以期为仔猪大肠杆菌病的有效防治提供一些技术参考资料。
1、具体方法（1）病原菌的分离培养：无菌采集具有黄痢、白痢症状的仔猪粪便，接种于麦康凯培养基上，37℃温箱中培养24 小时。
挑取红色中等大小光滑菌落，接种于普通肉汤增菌，置37℃温箱培养16～18小时，然后将培养物分别划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板进行细菌培养，24 小时后挑取平板上可疑菌落抹片染色镜检，后将疑似菌落少许再接种于普通肉汤，供以后试验用。
（2）生化试验：糖发酵、M．R、硫化氢、V-P、吲哚试验等。
③药敏试验：利用庆大霉素、丁胺卡那霉素、头孢噻肟、链霉素、环丙沙星、恩若沙星、红霉素等8种药物按常规纸片法进行。
2、观察结果（1）病原菌的形态：观察到6个疑似菌株在麦康凯琼脂培养16 小时后均为红色菌落，在伊红美蓝琼脂上培养16小时后均为紫黑色带金属光泽的中等大小圆形菌落，革兰氏染色镜检均为革兰氏阴性中等大小杆菌。
（2）生化鉴定：分离的6株细菌都能发酵葡萄糖、麦芽糖和乳糖，并产酸产气；部分菌株不分解蔗糖，不产生硫化氢，吲哚和甲基红试验(M．R)均为阳性，V-P试验为阴性，由此可判定分离菌株为大肠杆菌。
（3）药敏试验：所有分离菌均对丁胺卡那霉素、头孢噻肟、恩若沙星敏感，而对其他药物产生了不同程度的耐药性。
3、结论分析从猪场分离的6株细菌，经培养特性、形态及生化试验试验鉴定，表明均为致病性大肠杆菌。
药敏试验结果表明6株大肠杆菌对丁胺卡那霉素、头孢噻肟、恩若沙星敏感，而对其他药物产生了不同程度的耐药性。
细菌培养和药敏
我院常规细菌培养和药敏实验培养，就是将收集到的标本放在特制的培养基里，使细菌生长、繁殖，然后，通过它的生长特点判断细菌的种类，从而选择适当的抗菌药物治疗。
但是，抗菌药物的杀菌作用并不是一成不变的。
许多细菌在繁殖、传播的过程中能产生耐药性，使原本有效的药物变为无效。
所以，只了解到细菌的种类是不够的，必须作药物敏感试验，通过药敏试验，可以观察到哪种抗菌药物对该致病菌有较好的杀灭作用，也可观察到该致病菌对哪种抗生素有了抗药性。
1.痰培养的临床意义人体的肺部或支气管发生细菌性感染时，痰液量明显增加，痰液细菌培养，分离出病原菌，有助于对下呼吸道感染性疾病的诊断和治疗。
了解在治疗基础疾病长期应用广谱抗生素、激素、细胞毒药物继发霉菌性肺炎的发病情况。
指导临床根据痰培养及药敏结果决定使用抗生素，可有效防止抗生素滥用、错用的情况。
痰液培养常见的致病菌：革兰阳性菌：有肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、放线菌、奴卡菌、白喉棒状杆菌等。
革兰阴性菌：卡他布兰汉菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌、假单胞菌、军团菌等。
培养分离出一些真菌，有助于真菌性感染的诊断。
做病毒分离：可分离到某些病毒，如分离到禽流感病毒H5N1，甲型H1N1，有较大的临床意义。
2．粪便培养的临床意义正常人的肠道中栖居的微生物种类和数量繁多，组成了对人类健康极为重要的体内微生态环境——微生态菌膜屏障，参与营养、消化、吸收及清洁肠道、维护健康的作用。
当致病菌和病毒在肠道内繁殖，就会引起腹痛、腹泻。
对粪便进行细菌培养，可以从肠道大量细菌中分离出引起腹痛、腹泻的病原菌，以便及时进行治疗。
粪便中常见的肠道致病菌：革兰阳性菌：有金黄色葡萄球菌、厌氧链球菌、产气荚膜梭菌、难辨梭菌等。
革兰阴性菌：有伤寒及其他沙门菌、痢疾志贺杆菌、致病性大肠杆菌、弧菌属、产气单胞菌、邻单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌、弯曲菌等。
3．尿液培养（计数）的临床意义尿液培养检查的意义在于监测人体泌尿系统(包括肾、膀胱、尿道)是否健康、无菌。
分枝杆菌分离培养和药敏试验
总
43.5
19.7
42.6
15.3
51.0
21.2
29.1Байду номын сангаас
13.1
23.2
7.9
26.9
8.8
45.0
12.6
22.2
5.3
8
分枝杆菌种类
分枝杆菌(Mycobaterium)迄今报道有100多个 种。《伯杰系统细菌学手册》将分枝杆菌军菌 种划分为两大类：缓慢生长分枝杆菌与快速生 长分枝杆菌。在营养丰富的培养基上，接种很 稀的新鲜培养物，在适宜的培养温度下，7天 以上肉眼可见单个菌落，称为缓慢生长分枝杆 菌，其代表菌种是结核分枝杆菌 (M.tuberculosis).在上述条件下，7天以内肉眼 可见单个菌落，成为快速生长分枝杆菌。
分离培养的注意事项
选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分进行 培养阳性率较高。
从加入前处理液到接种的时间不得多于20分钟. 涡旋振荡、离心、倾倒上清液、接种时容易产
生气溶胶，应注意使用安全仪器，正确操作。 发现培养基上菌落生长需经抗酸染色确认后方
可报告阳性。
32
分离培养的优点
敏感性较直接涂片法高，理论上10~100条菌/ 毫升可检出阳性；
胸腹水,支气管灌洗液标本 参照痰标本 处理办法.
22
去污染处理(其他标本)
脑脊液 无菌操作收集的脑脊液,置冰箱或室温 24h,待薄膜形成后将薄膜接种到L-J培养基;或 将脑脊液 在无菌操作环境中3000r/min离心30 min,取沉淀直接接种到L-J培养基.非无菌操作 采集的脑脊液标本,离心后的沉淀进行碱处理 [与等倍量4%氢氧化钠（NaOH)混合,处理 10~15min]后接种于酸性L-J培养基
细菌分离培养及药敏试验方法及步骤
细菌分离培养方法及操作步骤无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基，37℃恒温培养24 h，观察其生长特性。
目前细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法和实验动物分离法。
平板划线接种法这是目前临床上最常用的分离接种方法。
它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落（有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌），以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。
具体操作：1、右手持接种环，在酒精灯上火焰灭菌；图1 病料采集图2 接种环灭菌2、待接种环冷却后，挑取被检料少许，左手持琼脂平板，以食指为支点，用拇指和无名指将平皿揭开一空隙。
大约20℃时，迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。
3、在涂布处来回移动作曲线形划线接种。
（注意：划线时，以腕力使接种环在琼脂平板表面划动，尽量不要划破培养基，划的线条要密，但不能重复旧线，以免培养物形成菌苔。
）图3 平板划线接种法4、划线完毕，合上平皿盖，将琼脂平板倒置，放入37℃温箱内培养18－24小时。
注意：分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样表面即干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱的细菌有利。
细菌药敏试验方法操作步骤药敏试验是抗菌药使用以前必不可少的一个基本环节，一个正确的药敏结果能够科学的指导养殖户用药，减少抗菌素使用的盲目性，从而减少养殖户损失。
在临床实际生产中具备重要意义。
1、在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。
具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。
然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。
图4 接种环划线2、以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。
大肠埃希氏菌的分离鉴定与药敏试验
大肠埃希氏菌的分离鉴定与药敏试验作者：张鑫来源：《当代畜禽养殖业》 2019年第2期张鑫浙江省湖州市安吉县天荒坪镇畜牧兽医站 313300摘要：大肠埃希氏菌通常被称作大肠杆菌，外文名称（学名）Escherichia coli。
它属于细菌界，变形菌门，V-变形菌纲，肠杆菌目，肠杆菌科，埃希氏菌属，大肠杆菌种。
大肠杆菌主要寄生于人和动物的大肠内，约占肠道菌的1%。
是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。
该菌常引起动物严重腹泻和败血症。
关键词：大肠埃希氏菌；分离鉴定；药敏试验近年来随着集约化养鸡业的迅速发展，大肠杆菌病的流行日趋严重，其不仅使患病的鸡群生长发育受阻，饲料转化率下降，死淘率及屠宰废弃率增加，而且种鸡及产蛋鸡的蛋品质下降，孵化率降低，以及治疗费用增加等等，给养鸡户造成了极大的经济损失。
1 大肠埃希氏菌的主要特点大肠埃希氏菌属于原核生物，具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核，有拟核。
细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。
大肠埃希氏菌属于异养兼性厌氧型。
大肠埃希氏菌和人体在不致病的情况下可认为是互利共生，在致病的情况下可认为是寄生。
大肠埃希氏菌遇到伊红美蓝，菌落呈深紫色，并有金属光泽。
2 大肠埃希氏菌导致的疾病（1）鸡大肠杆菌病引起的急性败血症。
各种日龄的鸡均可发病，病鸡腹泻或呼吸困难。
剖检心脏和肝脏，表面覆盖一层容易剥离的白色纤维素膜(肝周炎、心包炎)，肉鸡大肠杆菌病还容易继发肉鸡腹水症。
（2）雏鸡脐炎。
该病一般是由大肠杆菌和其他细菌混合感染引起，主要发生于刚出壳的雏鸡，多数在出壳后2~3日内死亡。
病雏虚弱，常堆挤在一起，水样腹泻，腹部膨大，脐孔未闭合，呈蓝黑色，有刺激性恶臭味，死亡率在l0%以上。
（3）气囊炎。
病鸡表现为咳嗽和呼吸困难，呈地方性流行，病死率5%~20%，有时可达50%。
还有鸡大肠杆菌病引起的肠炎、蛋鸡输卵管炎、卵黄性腹膜炎、脑炎和全眼球炎等。
掌握液培养和药敏试验的操作要点
掌握液培养和药敏试验的操作要点液体培养和药敏试验是微生物学和临床药学中常用的实验技术，用于分离、培养和检测微生物的敏感性。
下面将介绍液体培养和药敏试验的操作要点。
一、液体培养操作要点1. 准备培养基和试管：选择合适的培养基，按照配方准备培养基溶液，加热煮沸并灭菌。
准备试管或培养瓶，要保持干净并灭菌处理。
2. 移植菌种：选择适当的菌株或微生物，用无菌环或无菌吸管将菌种接种到试管中的培养基上。
注意无菌操作，避免污染。
3. 培养条件：放置接种好的试管或培养瓶在恒温培养箱或恒温振荡培养箱中进行培养。
根据不同的微生物和实验要求，设置合适的培养温度、pH值和培养时间。
4. 培养过程中的观察和记录：定期观察培养物的颜色、透明度、沉淀物形成等变化，并记录相关观察结果。
同时注意照顾好培养物，避免震荡或摇晃过大。
5. 液体培养的保存与传代：若需要保存菌种，可将培养物从液体培养中分装到无菌的培养基或冷冻保存液中，并进行适当的保存条件。
若需传代，将培养物分装到新的培养基中再次培养。
二、药敏试验操作要点1. 准备药敏试验板：根据实验需求选择合适的药敏试验板，根据说明书或药敏试验方案，用吸管将试验板上的培养基均匀涂布。
2. 菌液制备：根据标准的方法，用无菌吸管或环取菌液，保证操作无菌并经标准化调整菌落悬浮液的浓度。
3. 涂布并做斑点扩散法：用无菌棉签或吸管头，将菌液均匀涂布于试验板上的培养基上，采用斑点扩散法，即在培养基上滴加一定浓度的抗生素溶液。
4. 药敏试验的培养条件：将涂好菌液和抗生素溶液的试验板，放置在恒温培养箱中进行培养。
根据不同的菌株和抗生素，设置合适的培养温度、时间。
5. 结果的判读与记录：观察试验板上菌落的生长情况，根据规定的标准对菌落的直径、抑菌圈的直径进行测量，并根据标准结果判定细菌的敏感性。
6. 实验结果的分析和报告：根据药敏试验的结果，判断细菌对不同抗生素的敏感程度。
结合临床实际情况，制定个体化的治疗方案，并进行相关记录和报告。
抗生素药敏实验的原理
抗生素药敏实验的原理
抗生素药敏实验的原理是通过将目标细菌分离培养，然后将其分成不同的培养皿或培养管，分别加入不同种类的抗生素或抗生素浓度，观察细菌在不同抗生素条件下的生长情况，从而确定该细菌对不同抗生素的敏感性。
抗生素药敏实验一般使用两种主要的方法：离散扩散法和浓度梯度法。
1. 离散扩散法：在无菌平板上均匀涂抹目标细菌，将含有已知抗生素浓度的药敏纸片放置于平板上，培养一段时间后观察纸片周围菌落生长的情况。
如果纸片周围没有菌落生长，说明该细菌对该抗生素产生敏感性，反之则说明该细菌对该抗生素产生耐药性。
2. 浓度梯度法：在无菌培养液中加入一系列浓度递增的抗生素溶液，然后接种目标细菌。
培养一段时间后，观察菌落生长情况，可以确定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。
MIC是指抗生素能抑制细菌生长但无法杀死细菌的最低浓度，而MBC是指抗生素能杀死细菌的最低浓度。
这些实验可以帮助医生选择最有效的抗生素治疗感染，以及监测细菌对抗生素的耐药性发展。
微生物检验学之细菌的培养与分离技术
细菌的培养与分离技术一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌L型的检查一、基本条件（一）细菌实验室中华人民共和国卫士行业标准中的微生物和生物医学实验室生物安全通过准则。
1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。
且室内禁用风扇，避免细菌的播散。
2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面1m处，每天开始工作前照射20min。
3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。
同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等，应安装冲眼器。
4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗1次。
5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。
同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。
6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。
同时室内应设置必要的消防设备。
7.细菌室必须安装生物安全柜，工作人员应在柜内处理标本及病原微生物。
（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。
1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。
2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。
3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。
4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。
5.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。
（三）基本设备和器具细菌实验室内必须具备的设备和器具有：用于细菌培养的温箱、CO2培养箱、厌氧培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计；细菌检验操作时用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
药敏实验流程
药敏试验1.目标提供细菌对抗菌药品敏感试验标准采集和操作方法，选择敏感药品用于临床。
2.范围适适用于试验室分离菌及常见菌抗菌药品敏感试验。
3.采样对接人服务教授针对病死猪进行解剖依据临床症状采集对应病料。
4.设备和材料无菌剪刀、无菌手术刀、无菌试管、无菌生理盐水、无菌平皿、三角烧瓶、酒精灯、接种环、打火机、75%酒精棉球、一次性手套、营养琼脂培养基、M-H琼脂培养基或特殊培养基、0.5标准麦氏比浊管、药敏纸片、待测病料、记号笔、眼科镊子、2ml或5ml一次性注射器、试管架、超净工作台、恒温培养箱、带刻度直尺。
5.采样及送样操作采集：病料新鲜度→无菌操作采样→有目标进行采样→确保组织完整性→独立存放到封口袋中并做好标识。
运输：采集好病料放入保温箱（泡沫纸箱+冰袋）中，冷藏即可，不可冷冻。
常见细菌分离采样部位病名样品链球菌脑、腹腔积液葡萄球菌/大肠杆菌肝脏、心脏、肺脏、脾脏、肾脏霉菌肺脏副猪嗜血杆菌脑、呼吸道分泌物、胸腹腔积液5.1样品标识要求有样品编号、样品名称、样品起源、样品数量、初步诊结果抽样日期及周龄、检测项目等内容。
5.2采样数量猪通常采集3-5头，6.细菌分离在无菌操作条件下，将待测病料（含有经典临床症状部分）用平板划线分离法接种于一般营养琼脂培养基或特殊培养基上（血琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、BP琼脂等），于37℃±1℃恒温培养箱中培养18-24h后备用。
细菌在培养基上生长特点细菌培养基菌落形态金黄色葡萄球菌一般琼脂培养基可见形成凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，不透明菌落7.药敏试验操作步骤7.1制作待检菌液在超净工作台内挑取培养18-24h一般营养琼脂平板上菌落，悬于含3ml无菌生理盐水试管中。
混匀后和比浊管比浊，调整浊度至0.5麦氏标准（相当于1-2*10 cfu/ml）。
7.2接种细菌在超净工作台内用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多出菌液，均匀涂抹整个平板表面，最终沿平板内缘涂抹一周（用接种环密集划线法也能够）。
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细菌分离培养方法及操作步骤无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基,37℃恒温培养24 h,观察其生长特性。
目前细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法与实验动物分离法。
平板划线接种法
这就是目前临床上最常用的分离接种方法。
它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落(有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌),以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。
具体操作:
1、右手持接种环,在酒精灯上火焰灭菌;
图1 病料采集图2 接种环灭菌
2、待接种环冷却后,挑取被检料少许,左手持琼脂平板,以食指为
支点,用拇指与无名指将平皿揭开一空隙。
大约20℃时,迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。
3、在涂布处来回移动作曲线形划线接种。
(注意:划线时,以腕力使接种环在琼脂平板表面划动,尽量不要划破培养基,划的线条要密,但不能重复旧线,以免培养物形成菌
苔。
)
图3 平板划线接种法
4、划线完毕,合上平皿盖,将琼脂平板倒置,放入37℃温箱内培养
18－24小时。
注意:分离培养用的平板培养基应表面干燥,可于临用前置37℃孵育箱内30分钟,这样表面即干燥有利于分离培养,又使培养基预温,对培养某些较娇弱的细菌有利。
细菌药敏试验方法操作步骤药敏试验就是抗菌药使用以前必不可少的一个基本环节,一个正确的药敏结果能够科学的指导养殖户用药,减少抗菌素使用的盲目性,从而减少养殖户损失。
在临床实际生产中具备重要意义。
1、在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。
具体方式; 用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。
然后,找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。
图4 接种环划线
2、以无菌操作将灭菌的不锈钢小管(外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米,管的两端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培养基上打孔,将孔中的培养基用针头挑出,并以火焰封底,使培养基能充分的与平皿融合(以防药液渗漏,影响结果)。
3、添加药物:按不同药液加样,样品加至满而不溢为止。
将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后,观察效果。
图5 添加药物
药敏试验结果:
图6 药敏试验结果
影响药敏结果的因素:
1、培养基:应根据试验菌的营养需要进行配制。
倾注平板时,厚度合适,约56mm,不可太薄,一般90mm直径的培养皿,倾注培养基1820m为宜。
培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质,如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性,胞腺密啶核苷与对氨苯甲酸(PABA)能拮抗磷胺药与TMP的活性
2、细菌接种量:细菌接种量应恒定,如太多,抑菌圈变小,能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
3、药物浓度:药物的浓度与总量直接影响抑菌试验的结果,需精硫配制。
商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
4、培养时间:一般培养温度与时间为37℃8-18小时,有些抗菌药扩散慢如多粘菌素,可将已放好抗菌药的平板培养基,先置4℃泳箱内
2-4小时,使抗菌药预扩散,然后再放37℃温箱中培养,可以推迟细菌的生长,而得到较大的抑菌圈。
温培养箱中培养18-24h后备用。