细菌分离培养及药敏试验方法及步骤

细菌分离培养方法及操作步骤无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基,37℃恒温培养24 h,观察其生长特性。目前细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法与实验动物分离法。

平板划线接种法

这就是目前临床上最常用的分离接种方法。它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落(有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌),以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。具体操作:

1、右手持接种环,在酒精灯上火焰灭菌;

图1 病料采集图2 接种环灭菌

2、待接种环冷却后,挑取被检料少许,左手持琼脂平板,以食指为

支点,用拇指与无名指将平皿揭开一空隙。大约20℃时,迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。

3、在涂布处来回移动作曲线形划线接种。(注意:划线时,以腕力使接种环在琼脂平板表面划动,尽量不要划破培养基,划的线条要密,但不能重复旧线,以免培养物形成菌

苔。)

图3 平板划线接种法

4、划线完毕,合上平皿盖,将琼脂平板倒置,放入37℃温箱内培养

18－24小时。

注意:分离培养用的平板培养基应表面干燥,可于临用前置37℃孵育箱内30分钟,这样表面即干燥有利于分离培养,又使培养基预温,对培养某些较娇弱的细菌有利。

细菌药敏试验方法操作步骤药敏试验就是抗菌药使用以前必不可少的一个基本环节,一个正确的药敏结果能够科学的指导养殖户用药,减少抗菌素使用的盲目性,从而减少养殖户损失。在临床实际生产中具备重要意义。

1、在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式; 用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后,找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。

图4 接种环划线

2、以无菌操作将灭菌的不锈钢小管(外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米,管的两端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培养基上打孔,将孔中的培养基用针头挑出,并以火焰封底,使培养基能充分的与平皿融合(以防药液渗漏,影响结果)。

3、添加药物:按不同药液加样,样品加至满而不溢为止。将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后,观察效果。

图5 添加药物

药敏试验结果:

图6 药敏试验结果

影响药敏结果的因素:

1、培养基:应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时,厚度合适,约56mm,不可太薄,一般90mm直径的培养皿,倾注培养基1820m为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质,如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性,胞腺密啶核苷与对氨苯甲酸(PABA)能拮抗磷胺药与TMP的活性

2、细菌接种量:细菌接种量应恒定,如太多,抑菌圈变小,能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

3、药物浓度:药物的浓度与总量直接影响抑菌试验的结果,需精硫配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

4、培养时间:一般培养温度与时间为37℃8-18小时,有些抗菌药扩散慢如多粘菌素,可将已放好抗菌药的平板培养基,先置4℃泳箱内

2-4小时,使抗菌药预扩散,然后再放37℃温箱中培养,可以推迟细菌的生长,而得到较大的抑菌圈。温培养箱中培养18-24h后备用。