血清丙氨酸氨基转移酶活力的测定

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实验六-血清丙氨酸氨基转移酶的活力测定

（2）样品测定
取2支试管，标记，按下表依次加入试剂。
管号血清/mL 基质液/mL
2，4-二硝基苯肼/mL
基质液/mL NaOH溶液/mL
对照管 0.10 ——
混匀，37℃水浴30min 0.50
混匀，37℃水浴20min 0.50 5.00
混匀，室温放置10min
测定管 0.10 0.50
0.50
—— 5.00
在505nm波长下用对照管调零，读取测定管的吸光度值，对照标准曲线求得ALT相应的酶活力单位。
【临床意义】
肝细胞中ALT含量最丰富，，当肝脏疾病导致肝细胞损伤后， ALT即大量释放进入血液中，导致血清中ALT活性明显增高。故测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。 ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死；中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞；轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、
实验六
【实验目的】
掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理及操作；熟悉ALT标准曲线的绘制；熟悉酶活力概念；了解赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的评价
【实验原理】
赖氏法：
在37℃、pH7.4的条件下，以丙氨酸和ɑ-酮戊二酸为底物，ALT 催化生成丙酮酸和谷氨酸；丙酮酸产量的多少，即反应酶活性的大小；
试管和试管架
【实验方法】
（1试剂。
管号
空白管
1
2
3
4
5
丙酮酸标准液/mL
0
0.05 0.10
0.15
0.20
0.25
基质液/mL
0.50
0.45 0.40
0.35
0.30

血清丙氨酸氨基转移酶测定

血清丙氨酸氨基转移酶测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。

2 实验原理本试剂以国际临床化学会(IFCC)推荐方法为基础，所采用的反应原理与反应式如下。

⑴样本中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化丙氨酸的氨基转换至α-氧代戊二酸，生成丙酮酸和L谷氨酸。

⑵丙酮酸被试剂中的乳酸脱氢酶（LDH）还原为L-乳酸的同时还原型辅酶I（NADH+ H+）被氧化为辅酶I（NAD+），而使波长340nm处的吸光度值下降。

通过对波长340nm处吸光度值的下降速率进行监测，即可测得样本中丙氨酸氨基转移酶（ALT）的活性。

(3)样本中内源性丙酮酸的干扰，可由试剂中的乳酸脱氢酶（LDH）在测定的延迟时间内快速、完全地消除，不会对测定产生干扰。

ALTL-丙氨酸 + -酮戊二酸丙酮酸 + L-谷LDH（乳酸脱氢酶）氨酸丙酮酸+ NADH + H+L-乳酸 + NAD+ + H2O3 标本3.1病人准备：12小时禁食。

3.2 类型：血清。

3.3. 标本存放：3天内的活性损失：2～8℃保存：<10%；15～25℃保存：<17%；标本稳定性：-20℃保存至少可稳定4周。

3.4 标本运输：常温条件下保存运输。

3.5 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染的标本。

4 实验材料4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司ALT试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成试剂1 L丙氨酸 600mmol/L 乳酸脱氢酶＞1820U/L（R1）：NADH 0.26mmol/LTris缓冲液 80mmol/L试剂2（R2）：Tris缓冲液80mmol/L α氧代戊二酸36mmol/LEDTA 5.0mmol/4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。

4.1.3 试剂稳定性与贮存：在2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂盒自生产之日起有效期为12个月。

4.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。

实验1 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶

实验1 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶【实验目的】掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理和校准曲线的绘制。

熟悉丙氨酸氨基转移酶测定的临床应用。

了解固定时间法测定酶活性的特点与应用。

【原理】丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase ，ALT ，EC 2·6·1·2）催化L-丙氨酸与α-酮戊二酸间的氨基移换反应，生成α-丙酮酸和L-谷氨酸。

经30min 反应后，加入2,4-二硝基苯肼终止反应，并与反应液中的两种α-酮酸生成相应的2,4-二硝基苯腙（丙酮酸苯腙和α-酮戊二酸苯腙）。

在碱性条件下，两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在500nm~520nm 处差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的呈色强度约为α-酮戊二酸苯腙的3倍。

据此可以计算出丙酮酸的生成量。

谷氨酸丙酮酸酮戊二酸丙氨酸-+-−−→−-+-L L ALT αα二硝基苯腙，二硝基苯肼，酮酸碱性条件-−−−→−-+-4242α（红棕色，λ=505nm ）【试剂与器材】1．0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液称取KH 2PO 4 13.61g ，溶解于蒸馏水中，加水至1 000ml ，4℃保存。

2．0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液称取Na 2HPO 414.22g ，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml ，4℃保存。

3．0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4）取0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液420ml 和0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液80ml ，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。

加氯仿数滴，4℃保存。

4．基质缓冲液（200mmol/L 丙氨酸/2.0mmol/L α-酮戊二酸）精确称取DL-丙氨酸1.79g ，α-酮戊二酸29.2mg ，溶于0.1mol/L 磷酸盐缓冲液约50ml 中，用1mol/L NaOH 调pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100ml ，4℃～6℃保存，该溶液可稳定2周。

血清丙氨酸氨基转移酶测定

血清丙氨酸氨基转移酶测定1.实验原理国际临床化学学会(IFCC)推荐的紫外连续监测法。

ALTL-丙氨酸+ -酮戊二酸丙酮LDH（乳酸脱氢酶）酸+ L-谷氨酸丙酮酸+ NADH + H+L-乳酸+ NAD++ H2O 上述偶联反应中，NADH的氧化速率与`样品中ALT的活力成正比,在340nm处NADH呈现特性吸收峰，而NAD+则没有。

因此，可在340nm监测吸光度的下降速率（-△A/min）,计算出ALT的活性单位。

2. 标本：2.1 病人准备：12小时禁食。

2.2 类型：血清，肝素或EDTA血浆。

3. 标本存放：3天内的活性损失：2～8℃保存：<10%；15～25℃保存：<17%；标本稳定性：-20℃保存至少可稳定4周。

4. 标本运输：常温条件下保存运输。

5. 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染的标本。

6. 实验材料6.1 试剂欧泰克ALT测定试剂盒6.1.1 试剂组成Tris缓冲液pH 7.4 80mmol/LL-丙氨酸800mmol/LLDH（乳酸脱氢酶）≥1200U/La-酮戊二酸18mmol/LNADH 0.18mmol/L6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。

6.1.3 试剂稳定性与贮存：试剂保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。

试剂不可冰冻。

6.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。

6.1.5 注意事项：试剂中含叠氮钠（0.95g/L）为防腐剂。

不可入口！避免接触皮肤及粘膜。

应采取必要的预防措施使用试剂。

6.2 校准品：使用罗氏公司提供的校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品和质控品.SOP 文件。

6.3 质控品：具体参见生化检验校准品和质控品.SOP 文件。

7. 仪器：日立7060生化分析仪8. 操作步骤8.1 项目基本参数：参见生化检验日立7060生化分析仪项目测定参数.SOP文件8.2 仪器操作步骤：参见生化检验日立7060生化分析仪操作规程.SOP文件9. 检验结果的判断与分析10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定

横坐标作图，即得赖氏法测定ALT的标准曲线。
标本的测定（改良赖氏法）
❖ 取适量基质缓冲液和待测血清，37℃水浴预温5min。 ❖ 取干净试管2支标明管号，按下表所示操作。
（对照管） 0.10 ---
基质缓冲液
0.50
❖ 混匀，放置5min，在505nm处以蒸馏水调零，读取各管吸光
度。
❖ 以测定管A测-A对之值作为标本的吸光度值，在标准曲线查得相
反应总体积
样本体积比色杯光径
2020/3/23
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注意事项
1、尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确。
可不同程度的损害肝细胞，引起ALT的升高。
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器材：分光光度计、半自动生化分析仪、恒温水浴箱、微量进样
器、移液管等。
待测标本：血清
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标准曲线的绘制（改良赖氏法）
❖ 取干净试管5支标明管号，按下表所示操作。
加入物（ml）
0
1
2
3
4
0.1mol/L磷酸盐缓冲液 2.0mmol/L丙酮酸标准液
基质缓冲液 2,4二硝基苯肼溶液
0.4mol/L NaOH溶液
完全。加入NaOH溶液的方法和速度要一致，不同的
方法及速度也会导致吸光度读数的差异。
5、底物中的α-酮戊二酸和2，4-二硝基苯肼均为呈色物
质，称量必须很准确，每批试剂的空白管吸光度上下
波动不应超过0.015，如超出次范围，应检查试剂及

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活力测定

2014级12班1组201450557 陆丽霞血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活力测定实验原理：以丙氨酸和ɑ-酮戊二酸为底物，在血清丙氨酸氨基转移酶的作用下，生成丙酮酸和谷氨酸；丙酮酸产量的多少，即反应酶活性的大小,丙氨酸能与2，4-二硝基苯肼结合，生成丙酮酸二硝基苯腙。

丙酮酸二硝基苯腙在碱性溶液中呈现棕色，可用比色测定。

实验步骤：1.标准曲线绘制：⑴取6支试管并编号，按表4-16操作；表4-16 标准曲线的绘制试剂对照 1 2 3 4 52mmol/L丙酮酸标准液0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25底物溶液0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 PBS缓冲液0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀，37摄氏度水浴5分钟，然后各管加入2,4—二硝基苯肼2,4——二硝基苯肼0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5混匀，37摄氏度水浴20分钟，然后各管加入0.4mol/L NaOH0.4mol/L NaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0相当于ALT活力单位0 28 57 97 150 200A5200 0.059 0.107 0.167 0.208 0.249⑵将所得6支试管混匀，10min后以对照组调零，用520nm波长比色并读取吸光度；⑶以吸光度为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标，绘制标准曲线2．酶活性测定：⑴取2支试管，编号，按表4-17操作：表2 ALT活力测定试剂对照测定血清——0.1PBS缓冲液0.1 ——底物溶液0.5 0.5混匀，37摄氏度水浴30分钟，然后各管加入2,4——二硝基苯肼2,4—二硝基苯肼0.5 0.5混匀，37摄氏度水浴20分钟，然后各管加入0.4mol/L NaOH0.4mol/L NaOH 5.0 5.0A5200 0.122⑵用520nm波长比色，以对照管调零，读取测定管吸光度；实验结果:由标准曲线方程y=0.0014x，当A520=0.122，即y=0.122，故x=87那么测得ALT酶活力单位为87讨论：1．查资料得参考正常值为40单位以下，实验测得ALT酶活力单位为87，机体可能发生了肝病变。

血清丙氨酸氨基转移酶测定

血清丙氨酸氨基转移酶测定1.实验原理ALT丙氨酸+ α-酮戊二酸—————→谷氨酸 + 丙酮酸LDH丙酮酸 + NADH + H+ —————→乳酸 + NAD+在波长340nm处测定NADH降低速率，计算出ALT活力。

2. 标本：2.1 病人准备：新鲜血清，采血后应及时分离，避免溶血。

2.2 类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。

3. 标本存放：15～25℃保存可稳定2天；2～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。

4. 标本运输：冰冻条件下保存运输。

5. 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血等存运输的标本。

6. 实验材料6.1 试剂：亚太丙氨酸氨基转移酶试剂盒（H010 091014 试剂1＋试剂2）6.1.1 试剂组成6.1.3 试剂稳定性与贮存试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。

试剂有效期为12个月。

试剂必需避光保存。

试剂不可冰冻。

6.1.4 变质指示：当试剂空白吸光率A340nm(1.0cm)<1.0，或有混浊和可见颗粒时，请不要再使用。

6.1.5 注意事项：试剂请勿直接接触皮肤、眼睛，如有接触，请用大量清水清洗。

请勿吞服。

6.2 校准品：使用Cfas提供的专用校准品对自动分析仪进行校准，参见生化检验校准品和质控品.SOP文件6.3 质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件7. 仪器：奥林巴斯AU640生化分析仪8. 操作步骤8.1 项目基本参数：参见生化检验奥林巴斯AU640生化分析仪项目测定参数.SOP文件。

8.2仪器操作步骤：参见生化检验奥林巴斯AU640生化分析仪操作规程.SOP 文件。

9. 检验结果的判断与分析10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。

质控规则参见生化室室内质控操作规程.SOP文件。

11. 计算方法：以Cfas校准品校准仪器后，在病人结果可报告范围内，仪器直接报告可靠的检测结果无需手工计算，以U/L报告。

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活力测定5页

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活力测定5页一、实验目的1. 掌握测定血清ALT活力的方法和原理。

2. 熟悉ALT在肝脏功能监测中的重要性。

二、实验原理ALT是一种酶，分布在人体的细胞内，主要存在于肝脏、心肌、骨骼肌和肾脏等组织中。

正常情况下，ALT主要在肝脏中发挥作用。

当肝脏受到损伤时，ALT会释放到血液中，导致血液中ALT活力的升高。

因此，测定血清ALT活力是一种常用的肝功能检测方法。

本实验使用比色法测定血清ALT活力。

利用谷草-丙氨酸转移酶测定(AST)所产生的谷草酸，和血清ALT催化产生的丙酮酸反应，生成2,4-二硝基苯胺，其吸光度与丙酮酸的浓度成正比。

由此计算出血清ALT活力。

三、实验步骤1. 将标准品和待测血清样品准备好，室温恢复至20-25°C。

2. 取比色管，在无菌条件下加入以下试剂：2.5ml缓冲液pH7.5、0.25ml 10mmol/L 肌酸盐缓冲液、0.2ml5.5mmol/LNADH、0.2ml2mol/L丙酮酸、0.1ml3%的PEG，混匀。

3. 加入待测血清样品1ml，立即混匀。

4. 马上读测吸光度(Zero)。

5. 在37℃恒温箱中孵育10分钟。

6. 然后再读一次吸光度。

7. 加入ALT试剂，混匀，孵育60秒钟。

8. 反应结束后7分钟内，读取吸光度值，记录。

9. 将标准品同样操作，测定吸光度，计算样品中ALT活力的单位(L_0.9)四、实验注意事项1. 实验中的所有仪器、试剂、杯器等都要事先清洗干净，确保无污染。

2. 实验操作应在干燥、无尘、无异味的净化房间内进行。

3. 操作过程中要注意保持常温。

4. 实验中的吸光度必须在规定时间内完成测定，避免影响结果。

5. 测定前，必须保证血清样品无血浆外渗。

6. 测定期间谨慎操作，防止试剂泼溅，注意安全。

五、实验结果分析ALT活性测定值与肝损伤的程度有一定的相关性。

当ALT活性超过健康人参考范围时，说明肝脏功能出现异常，可能出现肝炎、脂肪肝等肝病状况。

丙氨酸氨基转移酶测定方法操作规程

丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定方法操作规程【产品名称】通用名称：丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒（IFCC法）【预期用途】该试剂盒采用IFCC法，用于体外定量测定人血清或肝素血浆中丙氨酸氨基转移酶的活力。

【检验原理】在ALT催化下，从丙氨酸转移到2个氨基到α-酮戊二酸上，生成产物谷氨酸和丙酮酸。

后者通过乳酸脱氢酶催化下转变成乳酸，在340nm波长条件下检测到NADH吸光度下降速率，与ALT的活力成比例。

L-ALT丙酮酸+ L-谷氨酸+LDH L-乳酸+NAD++H2O【主要组成成份】R1：Tris缓冲液150mmol/LL-丙氨酸750 mmol/L乳酸脱氢酶（LDH） 1200U/LNADH 0.4mmol/LR2：α-酮戊二酸90mmol/LNADH 0.9mmol/L*不同批号试剂盒各组分请勿混用。

【储存条件与有效期】未开启的试剂盒在2℃~8℃保存有效期为一年。

试剂开瓶后应避光保存，在2℃~8℃可稳定28天。

试剂不可冰冻。

【适用仪器】迈瑞BS系列全自动生化分析仪、日立7180型全自动生化分析仪、日立7060型全自动生化分析仪、日立7600P自动生化分析仪、奥林巴斯AU400型全自动生化分析仪、奥林巴斯AU2700型全自动生化分析仪、贝克曼库尔特AU680型全自动生化分析仪。

若需自动生化分析仪应用参数，请随时和公司联系。

建议用户在不同仪器上使用本产品时，根据实验室情况进行验证。

【样本要求】新鲜血清或肝素血浆样本，采集后及时测定，应避免污染。

【检验方法】试剂准备R1：即用液体试剂R2：即用液体试剂测定条件波长340nm温度37℃分析类型动力学法反应方向下降反应操作步骤* ΔA/min=ΔA/min样本管—ΔA/min空白管* 试剂和样本量可根据不同生化分析仪要求按比例适当增减。

校准校准品类型S1：生理盐水S2：迈瑞配套校准品推荐进行2点线性校准校准周期和要求（包括但不限于以下情况）更换试剂批号时仪器关键零部件更换时室内质控失效时质控每批样品检测时，建议使用迈瑞公司提供的配套质控品进行内部质量控制。

血清丙氨酸氨基转移酶

准确。
医学ppt
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实验试剂：
（1）ALT底物液【2 mmol/Lα-酮戊二酸 , 20 mmol/L丙
氨酸】
（2）pH=7.4的PBS
（3）丙酮酸标准液[2 mmol/L] （4）2,4二硝基苯肼
溶液【1 mmol/L]
(5) 0.4 mmol/L NaOH
制（作）
活力的测定标准曲线的
？
答：α-酮戊二酸因其量不多，加之对520nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，α-酮戊二酸对于结果影响不大，测定结果也比其他比色法（金氏法（King法
）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法））
体内，可引起高铁血红蛋白血症，出现
紫绀遇明火极易燃烧爆炸。干燥时
经震动、撞击会引起爆炸。燃烧时放出
有毒的刺激性烟雾。与氧化剂混合能形
成爆炸性混合物。【有害燃烧产物】
医学一pp氧t 化碳、二氧化碳、氮氧化物
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α-酮戊二酸也能与 2,4二硝基苯肼结合成相应的苯腙，在碱性条件下显色。对实验结果有何影响
卡氏测定ALT活力的原理
答：丙氨酸+ α-酮戊二酸 ALT 谷氨酸+丙酮酸丙酮酸+NADH 乳酸脱氢酶乳酸+NAD+
医学ppt
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小结：区别与联系
医学ppt
9
实验原理：
医学ppt
10
知识链接：
• 转氨基作用
是一种α-氨基酸的α-氨基转移到一种α-酮酸上的过程。转氨
基作用是氨基酸脱氨基作用的一种途径。其实可以看成是氨

血清丙氨酸氨基转

• 生成的丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应，生成丙
酮酸-2,4二硝基苯腙。此化合物在碱性溶液中呈
现棕色，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的
生成量，即ALT的活性高低呈正比关系。用比色
法测。
• 改良的穆氏法(Mohun)规定每毫升血清在
37℃(pH7.4)的条件下,与底物作用30分钟后, 每生成2.5μg丙酮酸为一个转氨酶活性单位。
定,如不能当日操作者,可于4℃冰箱中储存1~2 天。
4、吸光度与丙酮酸的标准线成抛物线,是因
为除丙酮酸与2.4二硝基苯肼在碱性溶液中能成腙外,α-酮戊二酸亦能与2.4二硝基苯肼产生苯腙.这是本实验方法的缺点.
血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）
活力的测定（改良穆氏法）
目的要求
1、掌握血清丙氨酸氨基转移酶活力测定的基本原理。
2、熟悉血清丙氨酸氨基转移酶活力测定的主要操作方法。 3、了解血清丙氨酸氨基转移酶活力测定的临床意义。
实验原理
• 血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）在37℃，
pH7.4的条件下，可催化底物中的丙氨酸和α-酮戊二酸反应，生成丙酮酸和谷氨酸：
操作步骤
1、取干燥试管两支，编号，按下表操作：
将溶液混匀，静置10min。在520nm波长下比色，用对照管调节零点，读取测定管的吸光度值。然后从标准曲线中查出其相应的丙酮酸含量（μg）
丙酮酸标准曲线
2、结果计算：按下列公式计算。
丙氨酸氨基转移酶活性（U/ml）= 标准曲线中查知的微克数/2.5 ×1/0.1
临床意义
• 肝细胞ALT含量最丰富，因此肝脏疾病致
肝细胞受损时，ALT大量释放入血，引起
血中ALT显著升高。测定ALT活性是检查肝

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定(改良赖氏法)

什么是改良赖氏法？
卡门法

赖氏法

丙酮酸+α-酮戊二酸谷氨酸+丙氨酸丙酮酸→NAD++乳酸在紫外分光光度法中，NADH在 340nm波长处的吸光度降低值与ALT 活性成正比。卡门氏酶单位：1ml血清（反应溶液总量为3ml）在340nm波长下，用内径喂1.0cm的比色皿，在25摄氏度， 1分钟内生成的丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下，使NADH+H+变成NAD+，光密度下降0.001为一个转氨酶活性单位。
临床意种组织中，但在肝细胞中含量最多，当肝脏有病变，特别是急性肝炎及肝细胞坏死是，血清中ALT活性显著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾病时，此酶活性也可或轻度增高。另外，其他脏器或组织的疾病，该酶活性也升高。
注意事项

1.不同血清对照管光密度基本相同，因此，同一批标本制作2~3个血清对照管求其平均值即可，亦可用空白管代替对照管。对超过正常的标本进行复查时，每份标本均应作对照管。 2.严重脂血症、黄疸或溶血的血清都能引起测定管OD值增加，因此，检查此类标本时，应做血清对照管。 3.赖氏法标准曲线只到97卡门氏单位，其线性关系良好。超过此活力的标本，应将血清稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。 4.ALT底物液与2，4-二硝基苯肼液配置要准确，每次测定时空白管的 OD值上下波动不应超过0.015.如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的问题。 5.除了丙酮酸与2，4-二硝基苯肼再碱性溶液中能成腙外，α -酮戊酸亦能与2，4-二硝基苯肼产生苯腙，两种苯腙的吸光度在520nm处有较大差异，因此超过一定范围时，该方法所绘制的标准曲线呈抛物线。
2.酶活性的测定：取试管2支，注明测定管及对照管，

生物化学实验2.血清丙氨酸氨基转移酶测定.专科

一、实验目的
1.掌握血清丙氨酸氨基转移酶测定的原理和方法
2.熟悉722G型可见光分光光度计的使用
二、实验原理
血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT），在37℃、pH7.4 的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。
在足量底物作用下，生成产物越多表明酶活力越大，酶浓度越高。一般以在一定时间内丙酮酸的生成量代表血清ALT活力的大小
三、试剂和仪器
(一）试剂 1、小牛血清 2、ALT底物液、2,4-二硝基苯肼溶液 0.4mol/L NaOH
(二）仪器 722G型可见光分光光度计、恒温水浴箱
四、操作步骤
1.标准曲线的绘制（不做）。 2.血清ALT活力测定取两支试管按下表操作：
试剂（ml）
测定管
对照管
血清
0.1
0.1
ALT底物液
实验二
血清丙氨酸氨基转移酶测定
血清丙氨酸氨基转移酶测定
丙氨酸氨基转移酶（ALT）是体内最重要的转氨酶之一，正常情况下，丙氨酸氨基转移酶主要存在于各组织细胞中（以肝细胞中含量最多，心肌细胞中次之），只有极少量释放入血，所以血清中此酶活力很低。当这些组织病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内的此类酶即可大量释放入血液中，使血清中该酶活力显著增高。因此在患各种肝炎急性病、药物中毒性干细胞坏死等疾病时，血清丙氨酸氨基转移酶活力明显增高。
•从标准曲线上查出酶活力单位。
本法正常值：0~30单位。
注意事项
• 加完试剂需要将试管内溶液混匀 • 注意水浴的温度及时间 • 分光光度计的正确使用
• 【临床意义】
• 肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。

实验4血清丙氨酸氨基转移酶测定

实验六血清丙氨酸氨基转移酶测定一实验目的(1)了解血清酶活性测定的基本方法(2)掌握血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定的临床意义二实验原理丙氨酸及α-酮戊二酸在ALT作用下，生成丙酮酸及谷氨酸，丙酮酸与２,４-二硝基苯肼作COOH COOH| |COOH C=O COOH H –C–NH2| | ALT | |HC-CH3 +CH2 C=O + CH2| | | |NH2CH2NH2CH2|| |COOH COOH丙氨酸α-酮戊二酸丙酮酸谷氨酸用,生成丙酮酸２,４-二硝基苯腙,在碱性溶液中呈红棕色。

于波长505nm 处读取吸光度值,计算酶活性。

三试剂与主要器材（1）0.1mol磷酸盐缓冲液（PH7.4）：将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml，0.1mol/L磷酸二氢钾80ml，混匀，即为PH7.4、0.1mol磷酸盐缓冲液，加氯仿数滴，4℃保存。

（2）ALT基质液：称DL-丙氨酸1.79g,α-酮戊二酸29.2mg,加磷酸盐缓冲液（PH7.4）约50ml煮沸溶解后，待冷，用1mol/LnaOH调整PH7.4（约加0.5ml）,缓冲液加到100ml,加氯仿数滴, 4℃保存。

该溶液可稳定2周。

（3）２,４-二硝基苯肼溶液：称取２,４-二硝基苯肼19.8mg,溶于10mol/L 盐酸10ml中,完全溶解后蒸馏水至100ml，置棕色瓶中，室温保存，若有结晶析出，应重新配置。

（4）2μmol/L丙酮酸标准溶液：精称纯丙酮酸钠22.0mg于100ml容量瓶内,加磷酸盐缓冲液（PH7.4）至刻度。

此液应新鲜配制，不能存放。

（5）0.4mol/LnaOH溶液：将16gNaOH溶液于蒸馏水中，加蒸馏水至1000ml,置塑料瓶内，可长期使用。

四实验方法（1）标准曲线的制作。

0 1 2 3 4丙酮酸标准液（ml） 0 0.05 0.10 0.15 0.20基质液（ml） 0.5 0.45 0.40 0.35 0.30磷酸盐缓冲液（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1相当于酶活性单位（卡门单位） 0 28 57 97 150各管加入2，4–二硝基苯肼0﹒5 ml，混匀，37℃水浴20 min后加入0﹒4 mol/L NaOH 5﹒0 ml，混匀。

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性的测定方法的改良

一
１．１器材
恒温水浴锅、７２００型分光光度计、刻度吸量管、滴管、试管、移液枪等。２．试剂（１）０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．４）：称取无水磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）２．１７６ｇ和磷酸氢二钾（Ｎａ２ＨＰＯ４）１１，９２８ｇ，加少量蒸馏水溶解后移至１０００ｍＬ容量瓶中，校正ｐＨ到７．４，然后加蒸馏水至刻度。贮存于冰箱中备用。（２）丙氨酸氨基转移酶底物液（ｐＨ７．４）：精确称取ＤＬ一丙氨酸１．７９ｇ和ｃ【－酮戊二酸２９．２ｍｇ于烧杯，加入０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液８０ｍｌ，煮沸溶解冷却，用１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液调节ｐＨ至７．４，再用０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液稀释到ｌＯＯｍＬ。充分混匀，冰箱保存，可保存一周（３）ｌｍｍｏｌ／Ｌ２，４．二硝基苯肼溶液：精确称取２，４．二硝基苯肼１９．８ｍｇ，用１０ｍｏｌ／Ｌ盐酸１０ｍＬ稀释至１００ｍＬ过滤后使用。
黧
２０１５ｉ
墨论Leabharlann 著血清丙氨酸氨基转移酶（ＬＴ）活性的测定方法的改良
杨卓轩赵丹清余孟飞谭越
（新乡医学院三全学院河南新乡４５３０００）
【中图分类号】Ｒ４４６．１１【文献标识码】Ａ【文章编号】１６３２ — ５２８１（２０１５）１０

实验1 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶

实验1 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶【实验目的】掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理和校准曲线的绘制。

熟悉丙氨酸氨基转移酶测定的临床应用。

了解固定时间法测定酶活性的特点与应用。

【原理】丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase ，ALT ，EC 2·6·1·2）催化L-丙氨酸与α-酮戊二酸间的氨基移换反应，生成α-丙酮酸和L-谷氨酸。

经30min 反应后，加入2,4-二硝基苯肼终止反应，并与反应液中的两种α-酮酸生成相应的2,4-二硝基苯腙（丙酮酸苯腙和α-酮戊二酸苯腙）。

在碱性条件下，两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在500nm~520nm 处差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的呈色强度约为α-酮戊二酸苯腙的3倍。

据此可以计算出丙酮酸的生成量。

2．0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液称取Na 2HPO 414.22g ，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml ，4℃保存。

3．0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4）取0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液420ml 和0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液80ml ，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。

加氯仿数滴，4℃保存。