基因操作的主要技术原理 【可编辑PPT】
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基因工程的主要技术及其原理PPT课件
核酸杂交及其应用示意图
Ⅰ.变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同DNA。A是杂化双 链
Ⅱ.突变体的鉴别。B代表天然DNA；C是B的缺失突变体；虚线 框内是已缺失的部分；D是显示从天然DNA链鼓出小泡
在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的 非常有用的技术称探针技术(Probe)。
探针技术在遗传性疾病诊断上已开始应用。 例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病
结果与分析
图2 PCR产物琼脂凝胶电泳图 (1、2、3、4为PCR产物，M为 DL2000Marker)
琼脂糖凝胶电泳装置
实验步骤
EB
90℃以上熔化，凝胶温度35-43 ℃
制胶
1
1、孔深
2 3
2、预留尺寸 3、梳子宽度 1+2= 胶的厚度
3
+
-
加缓冲液
拔梳子
最好在电泳槽中
+
-
点样
+
电泳
⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到 溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min60min。
⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微 漂洗。
⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上 防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的 DNA条带。
结果与分析
图2 基因组DNA1%琼脂凝胶电泳图
of mRNA transcript from a given gene
Smear of RNA transcripts
Undifferentiated + differentiation factor cells
核酸杂交技术是目前研究核酸结构、 功能常用手段之一，不仅可用来检验核 酸的缺失、插入，还可用来考察不同生 物种类在核酸分子中的共同序列和不同 序列以确定它们在进化中的关系，其主 要应用如下图所示 ：
基因操作原理01-PPT精品文档
这里所说的基因操作并不是一个法律概
念，除了包括基因克隆外，还包括基因
的表达，调控，检测等，与基因研究相 关的内容。
了解对基因的研究是如何实施的
二、本课程在学科发展中的地位
这门课以前叫“分子克隆I” 实验课为“分子克隆II”
利用分子生物学原理,为在分子或基因水 平的研究服务的学科
20世纪是生物学发展最为迅速的时期，1953年由于 认识了DNA的双螺旋结构，从而揭开了分子生物学 研究的热潮。 在整个生物学研究进程或研究层次来说，其发展过 程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平 同时由于遗传学的兴起与发展，DNA作为生命遗传 信息的物质基础被确定下来，从而导致分子生物学 的诞生。
基因克隆的技术路线
...GAATTC... EcoRI ...CTTAAG... ...G ...CTTAA AATTC... G...
基因克隆的技术路线
...GAATTC... EcoRI ...CTTAAG... ...G ...CTTAA AATTC... G...
酶切 连接
酶切
基因克隆的技术路线
２．基因及其产物的非共线性
interrupted gene, intron
３．基因的重叠与可变性
三、基因的基本结构组成
• 编码区 ORF • 启动子 promoter
• RBS
ribosomal binding site
• 终止区 terminator
• flanking sequence
• upstream / downstream • Cap/tail
...GAATTC... EcoRI ...CTTAAG... ...G连接
酶切
基因克隆的技术路线
基因工程的原理和技术ppt
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序列, 又可以怎样操作？
思考:能否根据氨基酸得序列获得人胰岛 素基因得碱基序列？
化 学 合 成 法
一、基因工程得基本操作步骤(技术物 材料
提取
DNA
限制酶
DNA 片段
DNA分子
导入
受体菌 构建 基因组群体单链 RNA (mRNA)
杂交 双链
单链 D
继续保持安静
一、基因工程得基本操作步骤(技术提取
DNA
限制酶
DNA 片段
形成重组 DNA分子
导入
录
因随受 体细胞 得繁殖
而复制
如果就是导入动物细胞
显微注射仪
用口径为1μm得DNA注射器,将大 量得目得基因片段注入到受精卵得 核内,然后把经过注射得受精卵移植 到另一只雌性动物得子宫内,使受精
。 卵发育为转基因动物
思考: 培育转基因动物时,受体 细胞能否采用动物体细 胞？试说明理由。一般 可以采用动物得什么细 胞？
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序 列,又可以怎样操作？
思考4:如果我们知道目得基因两端得部分 碱基序列,还可以怎样操作？
u 聚合酶链式反应(PCR技术)
Ø变性:双链DNA解链成 为单链DNA
Ø复性(退火):部分引物 与模板得单链DNA得 特定互补部位相配 对与结合
Ø延伸:以目得基因为 模板,合成互补得新 DNA链
农杆菌得Ti质粒T-DNA:(可转移得DNA)
可转移(也可以将目得基因转移)至受体细胞 中,并且整合到受体细胞染色体得DNA上。
农杆菌转化法
3、 转基因植物
农杆菌转化法
重组 DNA 分子
农杆菌 侵染 植物体细胞 (整合到细胞
思考:能否根据氨基酸得序列获得人胰岛 素基因得碱基序列？
化 学 合 成 法
一、基因工程得基本操作步骤(技术物 材料
提取
DNA
限制酶
DNA 片段
DNA分子
导入
受体菌 构建 基因组群体单链 RNA (mRNA)
杂交 双链
单链 D
继续保持安静
一、基因工程得基本操作步骤(技术提取
DNA
限制酶
DNA 片段
形成重组 DNA分子
导入
录
因随受 体细胞 得繁殖
而复制
如果就是导入动物细胞
显微注射仪
用口径为1μm得DNA注射器,将大 量得目得基因片段注入到受精卵得 核内,然后把经过注射得受精卵移植 到另一只雌性动物得子宫内,使受精
。 卵发育为转基因动物
思考: 培育转基因动物时,受体 细胞能否采用动物体细 胞？试说明理由。一般 可以采用动物得什么细 胞？
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序 列,又可以怎样操作？
思考4:如果我们知道目得基因两端得部分 碱基序列,还可以怎样操作？
u 聚合酶链式反应(PCR技术)
Ø变性:双链DNA解链成 为单链DNA
Ø复性(退火):部分引物 与模板得单链DNA得 特定互补部位相配 对与结合
Ø延伸:以目得基因为 模板,合成互补得新 DNA链
农杆菌得Ti质粒T-DNA:(可转移得DNA)
可转移(也可以将目得基因转移)至受体细胞 中,并且整合到受体细胞染色体得DNA上。
农杆菌转化法
3、 转基因植物
农杆菌转化法
重组 DNA 分子
农杆菌 侵染 植物体细胞 (整合到细胞
基因编辑技术和原理讲述 ppt课件
连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN
在基因组编辑中的应用。
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ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成 的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂 (DSB)。于是， 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末 端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位 点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变 或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。
端连接和同源重组修复 两条途径。
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• 1.非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度的修
复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生碱基随
机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现目的
基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ
机制会将其连入双链断裂DSB 位点，从而实现定点的
基因敲入。
录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形
成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点,
在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并
启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的
CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)
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基因编辑原理
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基因编辑技术的种类
目前主要有 3 种基因编辑技术， 分别为： 人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)
技术； 转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like
基因操作的主要技术原理
基因操作的主要技术原理1．核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。
某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。
在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。
将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。
在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。
DNA的脉冲电泳技术 :PFGE-Pulse-field gel electrophoresis2．核酸的分子杂交技术在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地"吸印" 转移到滤膜上的。
常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)；将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。
所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
3．细菌的转化所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。
这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。
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proteins ocDNA L-DNA
cccDNA RNAs
的作用
RNase的特点：
抗酸抗碱,具很广pH作用范围 抗高温严寒(0~65℃均具活性，100℃也
不能使之完全失活） 抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，
去除变性剂后又可恢复活性） 酶活性不需要辅助因子 存在范围广
0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖
50000~1000 20000~1000 6000~ 300
DNA RNA
4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
1000~ 100 500~ 25
50~ 1
DNA 蛋白质
核酸电泳的染色剂和指示剂
指示剂
在电泳过程中，常使用一种有颜色的标记 物以指示样品的迁移过程
一、核酸分离提取的原则
1. 保证核酸一级结构的完整性
2. 排除其它分子的污染 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的
有机溶剂和过高浓度的金属离子 将其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂
类分子的污染降到最低 排除其它核酸分子的污染
核酸提取的基本要求
尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减 少各种有害因素对核酸的破坏
沉淀DNA的最常用方法是在DNA溶液中加入1/10 体积的3M NaAc（或KAc）和2倍体积的乙醇， 放置15～30min，离心收集DNA沉淀，倒去上清 液，加入70%的乙醇洗涤沉淀，去除残余的盐， 再离心收集沉淀。
贮存
DNA：溶于TE中，放置于4℃、-20℃、-70℃
RNA： 溶于0.3M NaAc(pH5.2)或ddH2O中，-70℃ 长期保存可以沉淀形式贮存于乙醇中，-20℃
基因操作的主要技术原理
第一节 核酸的分离与纯化
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞 中都是以与蛋白质结合的方式存在的
真核生物95%DNA存在于细胞核内，5% 在细胞器
75%的RNA存在于细胞质，10%在核内， 15%在细胞器
rRNA（80～85%），tRNA及核内小分子 RNA（10～15%），mRNA（1～5%）
关键：如何使质粒DNA与宿主染色体 DNA分开
依据：质粒DNA比染色体DNA小得多， 在DNA提取过程中，染色体DNA断裂 成片段(线状)，而质粒DNA仍保持超 螺旋构型
变性法提取质粒DNA的原理
在变性条件（碱性或高温)下，线状染色体 DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然 互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼 此缠绕在一起。
第二节 凝胶电泳
一、核酸电泳的基本原理
核酸分子中的磷酸基团带负电荷， 在电场中将向正极移动，通过凝胶的分 子筛作用可以将不同大小和构型的核酸 分子分离，分子量小的DNA，具有较紧 密的构型，在凝胶中移动快；反之，分 子量大的DNA移动慢
琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力
凝胶类型及浓度 分辨DNA片段的大小范围（bp）
加入溶液II (0.2M NaOH, 1%SDS) 加入溶液III (3M NaAc pH4.8) 离心除去沉淀，得含质粒DNA的上清液
在强碱性环 境中暴露时 间过长， cccDNA可 发生不可逆 变性
苯酚抽提去除蛋白质
乙醇沉淀收集质粒DNA
三、染色体DNA的分离纯化
关键：尽可能地保持其高分子量
细菌 3300~4200kb 果蝇 1.65x105 kb 植物 2x105~1x108 kb 痘病毒 196 kb
解决办法：
外源RNase：高温（干热180℃，4hrs）， 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理所 有溶液（Tris·HCl除外）和器 皿，操作者带手套
内源RNase：高温抽提，强蛋白质变性剂， RNase抑制剂，蛋白酶K等
五、核酸的浓缩与贮存
沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其最大的优点是 通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液及重新调 节核酸在溶液中的浓度，可去除溶液中某些可溶 性的盐离子与杂质，在一定程度上纯化核酸
当变性条件恢复时，质粒DNA迅速复性恢复 天然构型，染色体DNA难以复性，交联形成不 溶性网状结构，与变性的蛋白质和RNA缠绕在 一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于 上清液中。
碱变性法提取质粒DNA的步骤
收集细胞沉淀
加入溶液I (50mM 葡萄糖, 25mMTris-HCl, 10mM EDTA, 4~5mg/mL 溶菌酶）
减少化学因素对核酸的降解（过酸、过碱） 减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力、
高温） 防止核酸的生物降解
提取核酸的一般程序:
破碎细胞 去除与核酸结合的蛋白质 及多糖等 去除其它核酸分子 沉 淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质 纯化核酸 核酸的质量评估（电泳、 D260/OD280，酶切）
二、质粒载体的分离与纯化
六、核酸的质量评估方法
核酸浓度的测定 ds-DNA：1 OD260≈50μg/ml ss-DNA&RNA：1 OD260≈40μg/ml 单链寡核苷酸：1 OD260≈20μg/ml
核酸纯度的测定
DNA：A260/A280=1.8 若＞1.8，说明RNA未除尽 ＜1.6，蛋白质或酚未除尽
RNA：A260/A280=2.0 ＜2.0，蛋白质或酚未除尽
琼脂糖凝胶浓度 溴酚蓝 二甲苯青蓝
0.6% 1% 1.4% 2% 1kb 0.6kb 0.2kb 0.15kb
酵母 15,000 kb
人
3x106 kb
天花病毒 288 kb
CsCl密度梯度离心
原理： CsCl介质密度为1.7g/cm3，超速离心后
形成1～1.9052 g/cm3的密度梯度 EB（溴化乙锭）可嵌入DNA两条链的碱
基对之间，并因此导致双螺旋结构发生 解旋反应
线性或开环DNA分子，因其具有游离的 末端而易于解旋，故可结合相当大量的 EB直到达到饱和
具有ccc结构的质粒DNA由于负超螺旋的 存在阻止DNA解链，因而只能结合很少 的EB
DNA分子中结合EB越多，其浮力密度越 小，因而形成不同的浮力密度得以区分
质粒
质粒DNA的分离纯化
氯化铯密度梯度离心法：
用含有EDTA的缓冲液 悬 加溶浮菌酶体裂解细菌细胞 壁 加CsCl和溴乙锭 超速离心过 夜 在紫外灯下吸取 c稀c释cD沉N淀A cccDNA