基因操作的主要技术原理 【可编辑PPT】

加入溶液II (0.2M NaOH, 1%SDS) 加入溶液III (3M NaAc pH4.8) 离心除去沉淀，得含质粒DNA的上清液
在强碱性环 境中暴露时 间过长， cccDNA可 发生不可逆 变性
苯酚抽提去除蛋白质
乙醇沉淀收集质粒DNA
三、染色体DNA的分离纯化
关键：尽可能地保持其高分子量
细菌 3300~4200kb 果蝇 1.65x105 kb 植物 2x105~1x108 kb 痘病毒 196 kb
沉淀DNA的最常用方法是在DNA溶液中加入1/10 体积的3M NaAc（或KAc）和2倍体积的乙醇， 放置15～30min，离心收集DNA沉淀，倒去上清 液，加入70%的乙醇洗涤沉淀，去除残余的盐， 再离心收集沉淀。
贮存
DNA：溶于TE中，放置于4℃、-20℃、-70℃
RNA： 溶于0.3M NaAc(pH5.2)或ddH2O中，-70℃ 长期保存可以沉淀形式贮存于乙醇中，-20℃
六、核酸的质量评估方法
核酸浓度的测定 ds-DNA：1 OD260≈50μg/ml ss-DNA&RNA：1 OD260≈40μg/ml 单链寡核苷酸：1 OD260≈20μg/ml
核酸纯度的测定
DNA：A260/A280=1.8 若＞1.8，说明RNA未除尽 ＜1.6，蛋白质或酚未除尽
RNA：A260/A280=2.0 ＜2.0，蛋白质或酚未除尽
琼脂糖凝胶浓度 溴酚蓝 二甲苯青蓝
0.6% 1% 1.4% 2% 1kb 0.6kb 0.2kb 0.15kb
0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖
50000~1000 20000~1000 6000~ 300
DNA RNA
4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
1000~ 100 500~ 25
50~ 1
DNA 蛋白质
核酸电泳的染色剂和指示剂
指示剂
在电泳过程中，常使用一种有颜色的标记 物以指示样品Leabharlann Baidu迁移过程
关键：如何使质粒DNA与宿主染色体 DNA分开
依据：质粒DNA比染色体DNA小得多， 在DNA提取过程中，染色体DNA断裂 成片段(线状)，而质粒DNA仍保持超 螺旋构型
变性法提取质粒DNA的原理
在变性条件（碱性或高温)下，线状染色体 DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然 互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼 此缠绕在一起。
基因操作的主要技术原理
第一节 核酸的分离与纯化
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞 中都是以与蛋白质结合的方式存在的
真核生物95%DNA存在于细胞核内，5% 在细胞器
75%的RNA存在于细胞质，10%在核内， 15%在细胞器
rRNA（80～85%），tRNA及核内小分子 RNA（10～15%），mRNA（1～5%）
一、核酸分离提取的原则
1. 保证核酸一级结构的完整性
2. 排除其它分子的污染 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的
有机溶剂和过高浓度的金属离子 将其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂
类分子的污染降到最低 排除其它核酸分子的污染
核酸提取的基本要求
尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减 少各种有害因素对核酸的破坏
解决办法：
外源RNase：高温（干热180℃，4hrs）， 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理所 有溶液（Tris·HCl除外）和器 皿，操作者带手套
内源RNase：高温抽提，强蛋白质变性剂， RNase抑制剂，蛋白酶K等
五、核酸的浓缩与贮存
沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其最大的优点是 通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液及重新调 节核酸在溶液中的浓度，可去除溶液中某些可溶 性的盐离子与杂质，在一定程度上纯化核酸
酵母 15,000 kb
人
3x106 kb
天花病毒 288 kb
CsCl密度梯度离心
原理： CsCl介质密度为1.7g/cm3，超速离心后
形成1～1.9052 g/cm3的密度梯度 EB（溴化乙锭）可嵌入DNA两条链的碱
基对之间，并因此导致双螺旋结构发生 解旋反应
线性或开环DNA分子，因其具有游离的 末端而易于解旋，故可结合相当大量的 EB直到达到饱和
第二节 凝胶电泳
一、核酸电泳的基本原理
核酸分子中的磷酸基团带负电荷， 在电场中将向正极移动，通过凝胶的分 子筛作用可以将不同大小和构型的核酸 分子分离，分子量小的DNA，具有较紧 密的构型，在凝胶中移动快；反之，分 子量大的DNA移动慢
琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力
凝胶类型及浓度 分辨DNA片段的大小范围（bp）
当变性条件恢复时，质粒DNA迅速复性恢复 天然构型，染色体DNA难以复性，交联形成不 溶性网状结构，与变性的蛋白质和RNA缠绕在 一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于 上清液中。
碱变性法提取质粒DNA的步骤
收集细胞沉淀
加入溶液I (50mM 葡萄糖, 25mMTris-HCl, 10mM EDTA, 4~5mg/mL 溶菌酶）
具有ccc结构的质粒DNA由于负超螺旋的 存在阻止DNA解链，因而只能结合很少 的EB
DNA分子中结合EB越多，其浮力密度越 小，因而形成不同的浮力密度得以区分
质粒
质粒DNA的分离纯化
氯化铯密度梯度离心法：
用含有EDTA的缓冲液 悬 加溶浮菌酶体裂解细菌细胞 壁 加CsCl和溴乙锭 超速离心过 夜 在紫外灯下吸取 c稀c释cD沉N淀A cccDNA
proteins ocDNA L-DNA
cccDNA RNAs
四、RNA的分离与纯化
关键： 防止内外源RNase的作用
RNase的特点：
抗酸抗碱,具很广pH作用范围 抗高温严寒(0~65℃均具活性，100℃也
不能使之完全失活） 抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，
去除变性剂后又可恢复活性） 酶活性不需要辅助因子 存在范围广
减少化学因素对核酸的降解（过酸、过碱） 减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力、
高温） 防止核酸的生物降解
提取核酸的一般程序:
破碎细胞 去除与核酸结合的蛋白质 及多糖等 去除其它核酸分子 沉 淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质 纯化核酸 核酸的质量评估（电泳、 D260/OD280，酶切）
二、质粒载体的分离与纯化