紫外可见分光光度法-2015

光栅色散后的光谱与棱镜不同，光栅的光谱是由 紫到红，各谱线间距离相等，是均匀分布的连续 光谱。
光栅光谱是多级光谱，各级重叠，相互干扰，需 用滤光片滤去高级序光谱。


2. 准直镜 以狭缝为焦点的聚光镜。将进入单色器的 发散光变成平行光，又用作聚光镜，将色 散后的平行单色光聚集于出口狭缝。一般 用镀铝的抛物柱面反射镜作为准直镜。

分子的紫外光谱有两个特征：
吸收带的波长决定于分子激发态和基态的 能级。 若两个能级相距小，则跃迁所需的能量低， 吸收带的波长长。但能级相差大时，跃迁 能高，吸收带波长短。 吸收强度，一般认为吸收强度决定于从基 态跃迁到某一能级的几率或吸光分子的多 少。分子吸光系数可以表示为

ε=kpα k为一常数，其级数为1020， p为几率 α为分子横切面积。分子中吸收光子的有 关电子跃迁部分的面积。面积大，容易被 击中，强度大。

1.色散元件 使各种不同波长的平行光有互不相同的 投射方向（或偏转角），是单色器中最重 要的。 棱镜 光栅

棱镜 棱镜的色散作用由于棱镜材料对不同波长的光有 不同的折光率，因此可从混合光中所包含的各个 波长从长波长到短波长依次分散成为一个连续光 谱。棱镜分光得到的光谱按波长排列是疏密不均 的长波长密，短波长疏，即光距与各条波长是非 线形的

常用溶剂的极限吸收波长
溶剂 乙腈 环己烷 水 甲醇 乙醇 异丙醇 三氯甲烷 乙酸乙酯 DMSO 吡啶 波长（nm） 190 198 200 202 205 203 245 254 265 305
吸收强度
当光经过均匀的透明介质时，一部分在介 质的表面分散或反射，一部分为介质所吸 收，只有一部分可透过介质，故透过光的 强度减弱。 反射光在测定中可用空白校正而忽略不计。 一个透明介质所吸收的能量和照射光的强 度无关，与吸收光子的物质的浓度和介质 的厚度有关。

分子的吸收光谱分为三类
转动：只涉及分子转动能级的改变，能级 间距离很小，吸收光子的波长长，频率低。 能级相差10-3~10-2kcal/mol，单纯的转动光 谱发生在远红外区和微波区 振动：振动光谱反映分子转动和振动能级 改变，引起这种改变的光子能量比第一种 高，两个振动能级相距0.1~10kcal/mol，产 生于波长较短，频率较高的近红外区，主 要在1~30µ的波长区。 电子光谱：吸收光子后使电子跃迁，产生 电子能级的改变，即为电子光谱。能量为 20~300 kcal/mol。

电子光谱位于紫外区和可见区，其波长和能量 的关系
波长(nm) 波数(cm-1) 能量 (kcal/mol)
180 200 300 400 55555 50000 30000 25000 159 143 95 72
紫外区与可见区
真空紫外区 远紫外区 短紫外区 近紫外区 紫色 蓝色 绿色 黄色 橙色 红色 波长(nm) 10~185 185~200 200~300 300~380 380~400 400~500 500~580 580~600 600~620 620~780

分子轨道可以认为是当两个原子靠近而结 合成分子时，两个原子的原子轨道的s电子 就可以线性组合生成两个分子轨道。其中 一个分子轨道具有低能量称为成键轨道σ 。 另一个分子轨道具有高能量称为反键轨道 σ* 。

同样两个原子的π 轨道平行地重叠起来， 组成两个分子轨道时，该分子轨道称π轨道 和π*反键轨道。 π键的电子重叠比σ键的电子重叠少，键 能弱，跃迁所需的能量低。
紫外可见分光光度法 与荧光分光光度法
药物研究所分析室 马辰 2015.3.27
紫外可见分光光度法
1、紫外光谱与 分子结构的关系 2、紫外可见分光光度计 3、定量测定基本原理 4、定性与定量方法 5、光电比色法
吸收光谱的来源
所有原子和分子均能吸收电磁波，其对吸 收的波长有选择性。这种现象的产生主要 是因为原子和分子的能量具有量子化特征 在正常状态下的原子或分子处于一定能级 即基态，经光激发后，随激发光子能量的 大小，其能级提高一级或数级，即分子由 基态跃迁到激发态。 当以某一范围的光波连续照射分子或原子 时，有些波长的光被吸收，产生被吸收谱 线所组成的吸收光谱

紫外吸收光谱反映分子吸收能量后所产 生的电子跃迁，反映分子的电子结构特征， 为物质结构的研究提供重要信息，分子的 紫外光谱吸收带的波长和强度是化合物的 常数之一。

由于仪器和操作方法的限制，紫外光谱只 适合于具有不饱和双键系统的分子。电子 跃迁受分子结构的影响，所以紫外光谱能 部分反映分子中电子间的相互作用。

光电管 光电管是由一个阳极和一个光敏阴极组成 的真空（或充少量惰性气体）二极管，阴 极表面镀有碱金属或碱金属氧化物等光敏 材料，当它被有足够能量的光照射时，能 够发射出电子。当两极间有电位差时，发 射出的电子向阳极移动而 产生电流，电流大小 决定于照射光强度。
紫外光谱与红外光谱的区别

紫外光谱图形简单，吸收峰宽且成带状， 红外光谱吸收峰较尖且数目多。 紫外光谱主要反映分子中不饱和基团的性 质，而不反映整个分子的结构；红外光谱 则不仅能反映分子中功能基团的存在，而 且与整个分子的结构有关。

特点
紫外光谱不仅能识别分子中的不饱和系 统，而且可以测定不饱和化合物的含量 同一物质相同浓度的吸收曲线，应能相互 重合，这是定性鉴定的依据之一。 在定量分析中，可提供选择测定的适宜波 长。因所需样品量少，通常为微克级或毫 克级，所以对测定微量成分，尤其是生物 体内的有机化合物更为有利。

溶剂效应

化合物在溶剂中的紫外吸收光谱受溶剂影 响较大，所以一般应注明所用溶剂。溶剂 的极性不同，对n→π* 跃迁和π→π* 跃迁 所产生的吸收峰位置向不同方向移动 改用极性较大的溶剂， 使π→π* 跃迁吸收峰向长波方向移动 而n→π* 跃迁吸收峰蓝移 后者的移动一般比前者移动大

溶剂要求
不能与样品反应 样品溶液中能达到一定浓度 在所测定的波长范围内，溶剂没有吸收

紫外光谱与 分子结构的关系
1.电子跃迁类型 2.常用术语 3.吸收带 4.溶剂效应
电子跃迁类型
电子围绕分子或原子运动的几率分布叫 轨道。轨道不同电子所具有的能量不同。 紫外可见吸收光谱是讨论分子中的价电 子有处于σ轨道上的σ电子，π轨道上的π电 子和未参与成键而仍处于原子轨道中的n电 子（亦称p电子）。
n →π* 跃迁 含有杂原子不饱和基团，如C=O, C=S, -N=N-等化合物，其非键轨道中孤对电子吸收能 量后，向π*反键轨道跃迁，这种跃迁一般在近 紫外区（200400nm）,吸收强度弱，ε小，约 在10 100之间。 n →σ*跃迁 如含有-OH，-NH2，-X，-S等基团化 合物，其杂原子中孤对电子吸收能量后向σ*反 键轨道跃迁，这种跃迁所吸收的波长在200nm 左右。 上述4种类型的电子跃迁，按照所需能量大 小其顺序为： σ→σ* > n →σ* >π→π* > n →π*

因此改用极性溶剂时，吸收峰短移，说明R带 存在。
K带 相当于共轭双键π→π* 跃迁所产生的 吸收峰。 特点： 值一般大于104，为强吸收带。 B带 芳香族（包括杂芳香族）化合物的特 征吸收带。 E带 也是芳香族化合物特征吸收，认为是由 苯环结构中三个乙烯的环状共轭体系的 π→π* 跃迁所产生，分为E1和E2。E1带的 吸收峰约在180nm， 为4.7104;E2带的吸 收峰约在200nm,为7000。
3．红移 (red shift) 也称长移，由于化合 物结构改变，如发生共轭作用，引入助色 团以及溶剂改变等，使吸收峰向长波方向 移动。 4．蓝（紫）移 (blue shift) 也称短移。当 化合物的结构改变时或受溶剂影响使吸收 峰向短波方向移动。



增色效应 (hyperchromic effect) 由于化 合物结构改变或其他原因，使吸收强度增 加。 减色效应 (hypochromic effect) 使吸 收强度减弱。 强带和弱带 (strong band and weak band) 化合物的紫外可见吸收光谱中，凡 摩尔吸收系数εmax值大于104的吸收峰称 为强带；凡εmax值小于103的吸收峰称为 弱带。

棱镜材料有玻璃和石英两种，玻璃对可见区的色 散率比石英大，石英对紫外光有很好的色散作用， 但在可见区不如玻璃。

光栅 是一高度抛光的表面上刻出大量平行等距离 的槽。
射到每一条槽上的光被衍射或散开成一定的角度， 在其中的某些方向产生干涉作用，使不同波长的 光有不同方向，出现各级明暗条纹形成光栅的各 级衍射光谱。

检测器

一般常用光电效应检测器（光电池和光 电管），将接收到的辐射功率变成电流的 转换器。 光电池 光电管 光电倍增管 光二极管阵列检测器

光电池
是一种光敏 半导体，当光照时就产生电流，在一 定范围内光电流大小与照射光强成正比，可直接 用微电流计测量。 光电池有硒光电池和硅光电池。硒光电池只能 用于可见光区，硅光电池同时适用于 紫外区和可 见区。

3. 狭缝 狭缝宽度直接影响分光质量，狭 缝过宽，单色光不纯，可使吸光度变值; 狭缝过窄，光通量小，降低灵敏度，若增 大放大器放大倍数而使噪音增大，影响准 确度。
吸收池
用光学玻璃制成的吸收池，只能用于可 见光区。用熔融石英（氧化硅）制的吸收 池，适用于紫外光区，也可用于可见光区。 空白溶液的吸收池与样品溶液的吸收池应 相互匹配，即有相同的厚度与相同的透光 性。


钨灯或卤钨灯 固体炽热发光，用于可见 区光源。要求供电电压稳定。 氢灯或氘灯 气体放电发光，发射自 150nm至约400 nm的连续光谱，用于紫 外区光源。
单色器

单色器的作用是将 来自光源的连续光 谱按波长顺序色散， 并从中分离出一定 宽度的谱带。