重亚硫酸盐测序技术介绍

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亚硫酸盐测序

氨基有机硫酸盐氧化物（Thiophenols）是环境、污染领域重要的精细指标，在大气

颗粒物、饮用水、地下水、水环境、工业排放气体及油土中等领域，都有广泛的应用。由

硫酸异氰酸酯（ISCOM）组装的氨基有机硫除去剂，是目前应用最为普遍、成功率最高的

方法。氨基有机硫酸盐是指含具有硫杂环、氨基和硫酸基等特征的有机物，如硝酸溴苯酚（BP）、硫磷（TP）、硫代苯磺酸（TSA）等。

氨基有机硫酸盐可以通过气相色谱/质谱（GC/MS）、气相色谱-质谱联用（GC/MS/MS）来进行测试及检测。气相色谱/质谱仪将氨基有机硫酸盐样品的分子团解，从而进行分析，有助于准确测定氨基有机硫酸盐含量。在这一测试中，首先需要对样本进行液相色谱分离，然后将样品注入气相色谱柱，进行挥发性多环芳烃（BTEX）检测，从而消除室溫效应等干

扰因素，确保试验测试的准确性。之后进行质谱分析，来定性、定量分析氨基有机硫酸盐

的种类、含量。

总之，氨基有机硫酸盐测序通过气相色谱/质谱（GC/MS）、气相色谱-质谱联用

（GC/MS/MS）、液相色谱联用质谱联用仪（LC/MS/MS）来完成，是当前硫分析领域应用最

为普遍、检测精度高的方法，给监测氨基有机硫酸盐的应用提供了更加可靠的依据。

重亚硫酸盐测序技术介绍PPT课件

比较与选择
重亚硫酸盐测序技术
在DNA序列分析中，重亚硫酸盐测序技术是一种基于连接反应和重亚硫酸盐转化的序列特异性扩增技术。它具有高灵敏度、高特异性和可检测突变丰度的优点，因此在基因突变筛查、基因分型和突变体鉴定等领域具有广泛的应用价值。
与其他测序技术的比较
与第二代测序技术相比，重亚硫酸盐测序技术的通量更高，能够检测低丰度的突变；与第三代测序技术相比，重亚硫酸盐测序技术的准确性更高，适用于对准确性要求较高的应用。
甲基化组测序
甲基化位点检测
通过重亚硫酸盐测序技术，可以高精度地检测甲基化位点，包括DNA甲基化、RNA甲基化等。
甲基化模式分析
利用重亚硫酸盐测序技术，可以对甲基化模式进行分析，包括甲基化谱、甲基化区域等。
甲基化与疾病关系研究
通过重亚硫酸盐测序技术，可以研究甲基化与疾病的关系，为疾病诊断和治疗提供参考。
缺点
01
对DNA损伤
02
对环境影响大
03
对特定序列不敏感
重亚硫酸盐处理过程中会对DNA 造成一定程度的损伤，影响后续的分子生物学实验。
重亚硫酸盐是一种有毒物质，处理不当可能对环境和人体造成危害。
对于某些具有高GC含量的序列或复杂重复序列，重亚硫酸盐测序技术的准确性可能会受到影响。
改进方向
转录组测序
1 2 3

亚硫酸盐测序

亚硫酸盐测序技术是近年来发展起来的新型前沿技术，涉及着基因组学等领域，可以实现基因组组装及转录组测序、单细胞/细胞团层次等功能，从而可以更好地探究不同物种的基因组结构及功能。亚硫酸盐测序技术是继计算机的构建和基因组学研究之后出现的又一

重要进步，可以使科学家们对质粒和RNA等有机分子对细胞功能及发育进程的影响进行更深入的了解。

亚硫酸盐测序技术在基因组学研究中被广泛应用。研究者通过亚硫酸盐测序技术可以将基因组/染色体拆分成不同的段，从而获得更多的基因组信息。此外，利用亚硫酸盐测序技术，研究者可以更好地对比研究物种之间的基因组结构，因此可以深入了解基因组的物种发育进程。在医学和农业等方面的应用也正在迅速发展，可以帮助我们了解基因调控物质的表达谱和基因组结构的变化，以期解决人类面临的重大健康问题。

亚硫酸盐测序技术也有一些局限性。首先，它的分辨率比较低，只能检测到一定尺度的细胞亚结构；其次，这项技术是非常复杂的，需要提供实验证明。此外，亚硫酸盐测序技术只能对DNA进行测序，不能用于RNA或蛋白等其他有机分子的测序。

尽管存在诸多局限性，但亚硫酸盐测序技术已被越来越多的研究者所采用，为基因组学和有机生物学的发展做出了重要贡献。由于这一技术可以得到更多的基因组信息，可以为诸多基因组学研究提供新的角度，进一步深入探究基因的运作机制。

总之，亚硫酸盐测序是一种非常有前景的新型技术，可以更好地探究基因组的结构，了解基因的发育过程，为植物和动物的基因组学研究提供重要的支持。在今后的研究中，科学家们将继续深入探索这一技术，以期帮助人们更好地了解基因组，并充分发挥其在医药、生物技术、农业等领域中所具备的重要作用。

重亚硫酸盐测序技术介绍

酶切法同亚硫酸氢盐联合法
酶切法：限制性酶切后选用对特异DNA片段甲基化序列敏感的限制性内切酶(酶切位点与甲基化位点不重叠)进行酶切后，以待测甲基化位点外侧序列为扩增起始点进行PCR。该 DNA片段若存在甲基化，将会有扩增产物出现；若无甲基化，则不会有任何片段扩增出现。当用甲基化不敏感的内切酶消化产物作为PCR模板时，不论该部位是否甲基化都不应有片段扩出。PCR 法比 Southem法更为敏感，但只能检测甲基化敏感的限制性位点的CpG甲基化，且DNA必须酶切完全，否则会出现假阳性。
重亚硫酸直接测序法对启动子测序的应用
CpG岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构。启动子的甲基化能抑制基因的表达。
研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一，而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制。
谢谢！
人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。
酶切法同亚硫酸氢盐联合法

DNA重亚硫酸盐转化

DNA 重亚硫酸盐转化--Qwbio
重亚硫酸盐转化是普遍使用的 DNA 甲基化分析技术，该方法是将胞嘧啶（cytosine， C）转化为尿嘧啶，而 5-甲基胞嘧啶（5-methyl cytosine，5mC）保持不变（图 1）。重亚硫酸盐法广泛用于基因组 DNA 特定基因甲基化的分析。重亚硫酸盐转化法被认为是 DNA 甲基化分析的“黄金标准” ，下游分析方法有：PCR 和测序。经重亚硫酸盐处理，未甲基化的胞嘧啶脱氨成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不发生变化，接下来，经 PCR 放大，尿嘧啶（uracil，U）转换为胸腺嘧啶（thymine，T），而 5mC 和 5hmC 重新恢复成 C（图 2）。因此，该技术能够帮助科研工作者区分甲基化和未甲基化的胞嘧啶，为 DNA 甲基化区域提供单核苷酸分辨率的信息。实现全部转化是 DNA 甲基化研究成功的关键因素，并且还应该减少剧烈的化学反应过程中 DNA 的降解。重亚硫酸盐处理后，应用较广的下游分析特定基因 DNA 甲基化的方法主要有重亚硫酸测序、甲基化特异性 PCR（MS-PCR）和甲基化基于的微阵列分析。考虑到下游的应用，应该选择最佳的重亚硫酸盐转化方案以期得到最佳的结果，尤其是转化后片段的尺寸对各种下游分析影响较大。BisulFlash DNA Modification Kit 最适合 real-time MS-PCR，而销量最好的 Methylamp DNA Modification Kit 是专为 Illumina workflow 和下一代测序（next-generation sequencing (NGS)）设计。测序前，想在更短时间内得到重亚硫酸盐转化产物，我们推荐使用 BisulFlash DNA Bisulfite Conversion Easy Kit，它能在 60 分钟内完成转化，并且液体转化试剂更便于使用。使用高质量的 DNA 非常重要，尤其是转化过程中的酸性条件会使 DNA 发生片段化。对于 DNA 含量低的样品，我们推荐使用 Methylamp Whole Cell Bisulfite Modification Kit，它能够直接转化细胞、组织、血液和其他起始材料中的 DNA。当处理大量样品时，为节省时间和减少花费，高通量的试剂盒是更好的选择。BisulFlash DNA Bisulfite Conversion Mag-96 Kit 是基于磁珠的 96 孔板的形式，适于流线型高通量分析的试剂盒。（启维益成有售）关于重亚硫酸盐转化试剂盒，更多细节请看下表： Methylamp DNA Modification Kit P-1001 “Classic” 基于化学的 DNA 重亚硫酸盐转化 BisulFlash DNA Bisulfite Conversion Easy Kit P-1054 “Easy” 简化的基于热反应的 DNA 重亚硫酸盐转化 BisulFlash DNA Modification Kit P-1026 “Fast” 快速的基于热反应的 DNA 重亚硫酸盐转化 Methylamp Whole Cell Bisulfite Modification Kit P-1016 “Direct” 直接转化细胞、组织、唾液、尿液或血液中的 BisulFlash DNA Bisulfite Conversion Mag-96 Kit P-1050 “High Throughout” 基于磁珠的 96 孔板形式的重亚硫酸盐转化

全基因组重亚硫酸盐测序和简化代表性重亚硫酸盐测序分析流程

#流程大放送#WGBS和RRBS测序分析流程

介绍

WGBS全称Whole Genome Bisulfite Seuqneicng，即全基因组重亚硫酸盐测序。该方法通过Bisulfite处理，将原基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U的同时，保留所有甲基化C 的碱基不发生转变，从而帮助科研人员识别发生甲基化的CpG位点。该种测序技术适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。

RRBS全称Reduced Representation Bisulfite Sequencing，即简化代表性重亚硫酸盐测序。该方法在Bisulfite处理前，使用MspI（该酶的酶切位点为CCGG）酶切对样本进行处理，去除低CG含量DNA片段，从而使用较小的数据量富集到尽可能多的包含CpG位点的DNA片段。

相比于WGBS技术，RRBS是一种准确、高效且经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切，并进行Bisulfite测序，该方法在保证DNA甲基化状态检测的高分辨率的同时提升测序数据的高利用率。

该项技术可用于以下研究

1、处于特定时期或特定处理条件下的样本中，研究样本中染色体高精度DNA甲基化模式；

2、比较不同细胞、组织、样本间的高精度DNA甲基化修饰模式的差异；

3、疾病样本中，与疾病发生发展相关的高精度DNA甲基化表观遗传机理研究和相关高精度DNA甲基化位点分子标志的探索性研究。

数据处理和分析流程图

分析结果示例图片展示

示例图1 样本中各区域DNA甲基化水平信息统计和样本间差异DNA甲基化分析结果展示[1]

示例图2 差异DNA甲基化区域内转录因子基序识别[1]

亚硫酸氢盐测序原理

亚硫酸氢盐测序是一种新型的 DNA 测序技术，它比现有测序技术更快、更准确地测序细胞中 DNA 中的基因组信息。亚硫酸氢盐测序可以准确地识别 DNA 样品中缺陷部分，并且具有高可靠性和低成本的特点。

亚硫酸氢盐测序的原理是用浓度很低的氢化安息香酸（HNA）作为修饰剂来实现 DNA 分子的修饰。当浓度低于安息香酸的时候，它可以将 DNA 核苷酸链沿着 DNA 分子的同一侧打开，然后将一个由亚硫酸氢盐构成的小分子放入DNA 分子中。亚硫酸氢盐氧化碱基，并改变其稳定性和特异性，可以有效地避免形成非特异性片段，并使碱基水解活性增强。

亚硫酸氢盐测序的 DNA 片段首先用一种叫做DNA收集器的蛋白质传感器进行检测，其检测受体分子会与被检测的 DNA 片段结合，同时用一种光学技术进行检测。当 DNA 样品被收集到检测受体上的时候，这种受体王片段会发出特异的 Fluorescence 旋光光谱线。热塑性聚合酶将识别由一种酶－假脱氨酶（Taq）产生的特征性旋光，以此确定其标签位点，从而实现了DNA 分子及碱基序列分析。

亚硫酸氢盐测序的优势是它比其它测序方法更容易适应不同的应用场景，比如高覆盖度特定基因区域测序，以及同时从多个样本中获得不同细胞株基因组数据等。亚硫酸氢盐测序还可以通过定制 DNA 收集器蛋白质来结合不同的基因，从而检测出高特异性的DNA 片段。另外，亚硫酸氢盐测序有准确性、成本低廉、可定制化和高通量的优势，在基因测序领域有着广泛的应用。

重亚硫酸盐测序

重亚硫酸盐修饰直接测序技术
亚硫酸氢盐处理DNA构建一个平台，对DNA甲基化进行测序的一项技术
基ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ原理
亚硫酸氢盐能使单链DNA的胞嘧啶脱氨变成尿嘧啶，而5‘甲基胞嘧啶无变化，在CpG两端设计引物，扩增出所需片段后进行直接测序，TG为非甲基化位点，CC为甲基化CG位点。从而获取CpG岛内所有的甲基化位点。
CpG岛基因组中长度为300～3000 bp的富含CpG二核苷酸的一些区域，主要存在于基因的5′区域。启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基因转录所必需的，而CpG序列中的C的甲基化可导致基因转录被抑制。位于多种脊椎动物已知基因转录起始位点周围、由胞嘧啶(C)和鸟嘧啶(G)组成的串联重复序列。
启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。因为基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，故RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是转录起始过程中首先要解决的问题。有实验表明，对许多启动子来说，RNA聚合酶与之相结合的速率至少比布朗运动中的随机碰撞高100倍。现在已经知道，转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用：启动子的结构影响了它与 RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢?显然启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底物的结构相恰恰适合一样。将100个以上启动子的顺序进行了比较，发现在 RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下，-35区 “AATGTGTGGAAT”，-10区“TTGACATATATT”。大多数启动子均有共同顺序(consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。

DNA重亚硫酸盐转化

起始材料最低 DNA 用量转化所需总时间洗脱体积转化效率脱磺酸基作用/清除回收率转化后 DNA 片段尺寸储存管
> 75% 平均： 200-2000 bp 峰值 800 bp 离心管
> 75% 平均： 200-2000 bp 峰值 800 bp 离心管
> 75% 平均： 100-400 bp 峰值 250 bp 离心管
产品名称
货号研发代码用途
DNA 产品关键词 Illumina 工作流程兼容最稳定可靠重亚硫酸盐测序、 NGS 和各种 MSP 的理想选择 DNA 50 pg < 2 hours 8-20 μl 99.9% √ Illumina 工作流程兼容热循环变性液体重亚硫酸盐转化试剂 DNA 100 pg 1 hour 8-20 μl 99.9% √ 反应快速 real-time MSP 的理想选择测序最佳选择 DNA 200 pg 30 minutes 10-20 μl 99.9% √ 省略了 DNA 分离的步骤 DNA 含量低样品的理想选择细胞、组织、血液 100 个细胞， 1 μl 血液 < 3 hours 8-20 μl 99.9% √ Illumina 工作流程兼容流线型高通量分析专为大量样品或者自动转化设计 DNA < 10 ng < 1 hour 20 minutes 20 μl 99.9% √

亚硫酸氢盐测序

介绍

亚硫酸氢盐测序（Bisulfite sequencing）是一种用于研究DNA甲基化状态的测序技术。DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰形式，它在基因组的调控、细胞分化

和发育等过程中发挥重要作用。亚硫酸氢盐测序通过对DNA进行特定的化学处理，可以将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（T），而已甲基化的胞嘧啶不受影响。通过测序这些转化后的DNA片段，可以确定原始DNA序列中的甲基化位点，从而获得DNA甲基化的信息。

测序过程

亚硫酸氢盐测序包括以下几个主要步骤：

DNA提取

首先，需要从研究对象的细胞中提取DNA。通常使用常规的DNA提取方法，例如酚

/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。

亚硫酸氢盐处理

提取的DNA与亚硫酸氢盐溶液混合，在低pH条件下进行反应，使未甲基化的C转

化为T。这个处理过程是亚硫酸氢盐测序的关键步骤，确保只有未甲基化的C被转化。

PCR扩增

经过亚硫酸氢盐处理后的DNA片段需要进行PCR扩增。PCR扩增可以增加DNA数量，使得后续的测序实验能够顺利进行。在PCR扩增过程中，可以添加特定的引物，以选择性地扩增亚硫酸氢盐处理后的DNA片段。

DNA测序

扩增后的DNA片段需要进行测序。目前可选择的测序方法很多，包括Sanger测序、Illumina测序等。测序后可以得到大量的DNA序列数据。

数据分析

最后，对测序得到的数据进行分析。这包括对测序质量的评估、数据清洗、比对到参考基因组、甲基化位点检测等步骤。

应用领域

亚硫酸氢盐测序技术在生物医学研究中有着广泛的应用。以下是一些常见的应用领域：

重亚硫酸盐测序操作方案

重亚硫酸盐测序操作⽅案

⼀、样品收集

1、配制2%低熔点琼脂糖

称取0.02 g低熔点琼脂糖，倒⼊1.5 mL离⼼管中，随后加⼊1 mL mPBS溶液，置于100℃⾦属浴中反复加热并颠倒混匀⾄完全溶解，取出4℃保存待⽤。

2、收集细胞样品

80℃以上热⽔浴使低熔点琼脂糖溶化。向1.5 mL离⼼管底部加⼊8 µL低熔点琼脂糖，避免产⽣⽓泡。迅速吸取细胞样品吹⼊琼脂糖中，冷却后加⼊500 µL矿物质油覆盖。最后将离⼼管在热⽔浴中短暂浸泡使琼脂糖⼩球成型，取出-20℃保存待⽤。⼆、亚硫酸氢盐修饰

3、配制DNA细胞裂解液：向20 mL TE缓冲液中加⼊100 µL 的20 mg/ml蛋⽩酶K。

4、向含样品的离⼼管内加⼊500 µL DNA细胞裂解液，50℃⾦属浴8 h以上，以消化样品。

6、消化完成后，将离⼼管取出，换液清洗使⼩球变性：

0.3M NaOH，500 µL，15 min，2次；0.1M NaOH，1 mL，5 min，1次。

7、换液加⼊500 µL转化液，50℃⾦属浴8 h以上，以转化样品，注意避光。

8、⽤TE缓冲液中⽌转化，1 mL ，15 min，6次。

9、⽤0.2M NaOH脱磺化，500 µL，15 min，2次。

10、⽤TE缓冲液中⽌脱磺化，1 mL，15 min，3次。

11、⽤双蒸⽔清洗，1 mL，10 min，2次。

12、清洗完成，⽤枪头吸取琼脂糖⼩球转移⾄200 µL离⼼管中，-20℃保存待⽤。

三、甲基化基因的PCR

带，快速精确切取，将胶块放⼊1.5 mL离⼼管内。

甲基化测序

DNA甲基化检测实验

一、重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）

（Bisulfite Genomic Sequence）

原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA 分子中的甲基化状态。该方法特点是：

•特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；

•灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。

重亚硫酸盐测序法技术实验流程

A．DNA制备

用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。

B．重亚硫酸盐处理

C．DNA纯化

用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。D．PCR扩增

E．PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化

F．PCR产物连接到pMD19-T (Takara) 载体中克隆及测序。

G．用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析

二、甲基化特异性的PCR实验流程

（methylation-specific PCR, MSP）

原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。随后进行引物特异性的

重亚硫酸盐测序操作方案

一、样品收集

1、配制2%低熔点琼脂糖

称取0.02 g低熔点琼脂糖，倒入1.5 mL离心管中，随后加入1 mL mPBS溶液，置于100℃金属浴中反复加热并颠倒混匀至完全溶解，取出4℃保存待用。

2、收集细胞样品

80℃以上热水浴使低熔点琼脂糖溶化。向1.5 mL离心管底部加入8 μL低熔点琼脂糖，避免产生气泡。迅速吸取细胞样品吹入琼脂糖中，冷却后加入500 μL矿物质油覆盖。最后将离心管在热水浴中短暂浸泡使琼脂糖小球成型，取出-20℃保存待用。

二、亚硫酸氢盐修饰

3、配制DNA细胞裂解液：向20 mL TE缓冲液中加入100 μL 的20 mg/ml蛋白酶K。

4、向含样品的离心管内加入500 μL DNA细胞裂解液，50℃金属浴8 h以上，以消化样品。

6、消化完成后，将离心管取出，换液清洗使小球变性：

0.3M NaOH，500 μL，15 min，2次；0.1M NaOH，1 mL，5 min，1次。

7、换液加入500 μL转化液，50℃金属浴8 h以上，以转化样品，注意避光。

8、用TE缓冲液中止转化，1 mL ，15 min，6次。

9、用0.2M NaOH脱磺化，500 μL，15 min，2次。

10、用TE缓冲液中止脱磺化，1 mL，15 min，3次。

11、用双蒸水清洗，1 mL，10 min，2次。

12、清洗完成，用枪头吸取琼脂糖小球转移至200 μL离心管中，-20℃保存待用。

三、甲基化基因的PCR

第一轮反应体系25 μL，转化后琼脂糖小球计为2 μL DNA。第二轮反应体系扩大为50 μL。

亚硫酸盐处理甲基化测序

亚硫酸盐是一种常用的化学试剂，广泛应用于生物学研究中。在甲基化测序中，亚硫酸盐可以用来去除DNA中的甲基化基团，从而实现对DNA甲基化水平的检测和分析。本文将详细介绍亚硫酸盐处理甲基化测序的原理、方法和应用。

一、原理

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，通过甲基化修饰可以调控基因的转录活性。甲基化测序是研究DNA甲基化的一种常用方法。在甲基化测序中，亚硫酸盐被用来去除DNA上的甲基化基团。亚硫酸盐可以与甲基化的胞嘧啶发生化学反应，将甲基化胞嘧啶转化为脱氧胞嘧啶。这样一来，在测序过程中就可以准确地检测到DNA中的甲基化位点。

二、方法

亚硫酸盐处理甲基化测序的方法主要包括以下几个步骤：

1. DNA提取：首先需要从待测样品中提取出DNA。可以使用常规的DNA提取方法，如酚-氯仿法或商业化的DNA提取试剂盒。

2. 亚硫酸盐处理：将提取得到的DNA溶解在含有亚硫酸盐的反应缓冲液中，反应一段时间后，亚硫酸盐会与DNA中的甲基化胞嘧啶发生化学反应，将其转化为脱氧胞嘧啶。

3. 碱基修复：亚硫酸盐处理后的DNA需要进行碱基修复，以恢复DNA链的完整性。可以使用商业化的DNA修复试剂盒进行修复反应。

4. 文库构建：修复后的DNA可以进行文库构建。根据实验需求，可以选择不同的文库构建方法，如全基因组测序、甲基化敏感限制性酶测序等。

5. 测序：构建好的文库可以进行高通量测序。根据测序平台的不同，可以选择Illumina、PacBio等不同的测序技术。

三、应用

亚硫酸盐处理甲基化测序在生物学研究中有着广泛的应用。它可以帮助研究人员了解DNA甲基化在基因表达调控中的作用机制，以及在疾病发生和发展中的重要作用。具体应用包括：

(完整版)亚硫酸氢钠测序法

亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)

直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法.重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶.最后,对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化.此方法一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态.在寻找有意义的关键性CpG位点上,有其他方法无法比拟的优点.测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区,所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列.它的不足是耗费时间和耗资过多,至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据,需要大量的克隆及质粒提取测序,过程较为繁琐、昂贵.

第一部分基因组DNA的提取.

这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以.DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的.

此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者.

使用两者的细节：

1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；

2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml.否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了.两者均于-20度保存.

全基因组甲基化测序(WGBS)

全基因组甲基化测序（WGBS）

技术简介：

全基因组重亚硫酸盐测序（whole genome bisulfite Sequencing）是基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法，首先通过重亚硫酸盐对样本DNA进行处理，将未甲基化的C碱基转化为U碱基，而甲基化的C碱基则不会改变，进行PCR扩增后U碱基会变成T，与原本甲基化的C碱基区分开，再结合高通量测序技术，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。

应用领域：

•基因表达调控

•发育表观组学

•细胞分化、组织发育

技术优势：

•可精确分析每一个C碱基的甲基化状态

•可在全基因组水平上最大限度的获取完整的甲基化信息，精确绘制全基因组甲基化图谱

•适用于所有具有参考基因组的物种

•性价比高，相对于传统BSP或MSP方法，费用少

实验流程

A.建库测序流程

B.数据分析流程

如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！