第二章 流加发酵与高密度培养

提高溶氧的方法有： 提高通气速率和搅拌速度 富氧空气和纯氧 在加压环境下培养



HCDC遇到的问题
混合的限制

HCDC的另一个物理限制。 发酵罐体积越大问题越明显。 靠近进料口部分的细胞暴露在高浓度营养物中。 而其它位置的细胞则处于饥饿状态。
有必要研究发酵罐中的搅拌模型，找到改善搅拌的方法。
流加发酵与高密度培养
流加发酵

所 谓 流 加 发 酵 ， 即 补 料 分 批发 酵 (Fed-
batch fermentation)，有时又称半连续培
养或半连续发酵，是指在分批发酵过程 中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵 方法
分批、连续、流加操作方式的比较
优点 分批发酵 1.一般投资较小 2.易转产、生产灵活 3.分批操作中某一阶段可获得高的 转化率 4.发酵周期短，菌种退化率小 连续发酵 1.可实现有规律的机械、自动化 2.操作人员少 3.反应器体积小、非生产时间少 4.产品质量稳定 5.操作人员接触毒害物质的可能性 小 6.测量仪器使用寿命长 流加发酵 1.操作灵活 2.染菌、退化的几率小 3.可获得高的转化率 4.对发酵过程可实现优化控制 5.因经常灭菌会降低仪器使用寿命 1.非生产时间长 2.需较多的操作人员或计算机控制系统 3.操作人员接触一些病原菌和有毒产品的可 能性大 4.需较多的操作人员或较多的自动控制系统 1.操作不灵活 2.因操作条件不易改变，原料质量必须稳定 3.若采用连续灭菌，加上控制系统和自动化 设备，投资较大 4.必须不断地排除一些非溶性的固型物 5.易染菌，菌种易退化 缺点 1.因放罐、灭菌等原因，非生产时间长 2.经常灭菌会降低仪器寿命 3.前培养和种子的花费大


流加发酵所取得的三个方面的重大进展



20世纪70年代中后期对流加发酵过程的 动力学解析 结合发酵过程的可测参数对流加过程进 行反馈控制（如DO法、CO2法、RQ(呼吸 商)法、pH法、代谢物法、萤光法等） 流加发酵的最优化研究


流加发酵最优化研究的核心问题是找出 最佳的底物流加方式，以维持发酵过程 始终处于最佳状态 流加发酵最优化的研究内容包括： （1）状态方程的建立 （2）目标泛函的确定 （3）最优化底物流加方式的求解
概述

随着重组DNA技术的发展，利用大肠杆菌或其它微生物 为宿主表达重组蛋白（如干扰素、白介素等）在分子和 策略上已没有问题。但为了提高过程的经济性必需开发 高效的培养和发酵技术。

对大肠杆菌的分子生物学和生理学知 识的熟识，使得它成为高细胞密度培 养的先锋微生物。
控制
微生物
温度 pH 培养基 DO 搅拌 压力
d (VS ) Vrs FS 0 碳平衡： dt dVP 产物平衡： Vrp dt dV 体积平衡： F dt
恒流速流加过程中的流量F的确定：
(a)预试验中所得出的流加时刻菌体对 所流加基质的消耗速率 (b)发酵液中残留基质浓度 (c)流加后需要控制的发酵液中的基质 浓度
(2) 指数速率流加
温度的影响

把培养温度从 37 ℃降到 26 －30℃，会降低营养吸收和 生长速度，因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。 降低温度也能减少细胞对氧的需求。


降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质 的产生。
以上这些优点说服了许多研究者使用低温，对大肠杆菌 进行高细胞密度培养。
HCDC遇到的问题

代谢工程的方法减少乙酸合成
修饰
磷酸转移 酶体系 TCA循环中 过剩的碳
截断
Pta CoA Ack
葡萄糖 去往其它产物 （乙醇、乙醛等）
大肠杆菌
乙酸
乙酸代谢过程示意图
加强
氧的限制

氧经常是高细胞密度培养的限制因素。 因为氧的溶解度很低。25℃、1大气压下，水中饱 和溶解氧浓度为7mgL-1。
透析反应器 反应器
HCDC问题的解决

HCDC遇到的主要问题有： 产物或代谢副产物的积累对生长的抑制 氧的限制 HCDC中培养基粘度不断增加，引起混合不充分 CO2和热量的高释放率
下面以大肠杆菌为例，来探讨如何解决HCDC中 的问题。
大肠杆菌HCDC中乙酸的形成

乙酸是大肠杆菌流入中心代谢途径的碳超过生物合成 的需要和产生能量超过细胞的容量时产生的。 高浓度的乙酸（如pH7，超过5gL-1）会降低HCDC的生 长速率、生物量和可获得的最大细胞密度。 乙酸毒害作用的机理还未被阐明。很有可能是因为抑 制DNA、RNA、蛋白质和脂肪的合成。
一、何时采用流加发酵方式？
• 所用底物在高浓度时对菌体生长有抑制 作用 • 高菌体浓度培养即高密度培养系统
• 非生长耦联性次级代谢产物(如产物的合 成需要某些营养物质或前体)
• 利用营养突变体的系统(过量加入营养物只能使菌体
迅速生长，而目的代谢产物的产量会减少。而当营养物严重缺乏 时，菌体生长受抑制，代谢产物的产量也会减小 )
流加发酵的研究进展
在20世纪70年代以前流加发酵的理论研 究几乎是个空白，流加过程控制仅仅以 经验为主，流加方式也仅仅局限于间歇 或恒速流加 1973年日本学者Yoshida等人首次提出了 “Fed-Batch Fermentation”这个术语， 并从理论上建立了第一个数学模型，流 加发酵的研究才开始进入理论研究阶段
在菌体生长阶段采用指数速率流加法的 几点假设如下： (a) 发酵罐内为理想混合； (b) 葡萄糖为唯一限制性碳源； (c) 残留菌体对葡萄糖的产率系数(YX/s)为常 数； (d) 菌体生长遵循Monod方程。
对底物葡萄糖进行衡算，则：
d (VS ) FS0 ( ms ) VX dt Yx / s
4. 合适的流加发酵类型的确定 a.恒速流加(包括单一速率和分阶段恒速流加) b.指数速率流加 c.底物在线测定后的反馈流加 (如葡萄糖反馈流加) d. pH-stat e. DO-stat
5. 流加方式的应用 (1) 恒速流加
采用恒流速流加培养时，可得到如下 的物料平衡方程式：
d (VX ) 细胞平衡： dt Vr x
生理状态
条件
μ
代谢流向 能量状况
目的产物 副产物 尾气 细胞
产物
反应器
HCDC过程示意图
概述
当细胞浓度超过200g(DCW)L-1 时，培养液的粘度迅速增加，在 220g(DCW)L-1几乎失去流动性。 高细胞密度带来的问题： 1. 底物对生长的限制或抑制
2. 产物或代谢副产物的抑制
3. CO2和热量 4. 粘度增加、混合不充分 5. 氧的限制
HCDC遇到的问题
二氧化碳和放热的影响

HCDC中高细胞密度培养中的二氧化碳会影响细胞的生长。 高CO2分压（>0.3atm）会降低生长速率并刺激乙酸的生成。
放热也是高细胞密度培养的一个问题。

热量的主要来源是搅拌产生的机械热和细胞代谢产生的热量。
这些问题可通过降低细胞比生长速率而部分的解决。
HCDC遇到的问题
微生物的高细胞密度培养
概述


发酵研究和工业的一个主要目标是使 体积生产率（g/L•h）最大化，即在 给定体积中和一定时间内获得尽可能 多的产品数量。 高细胞密度培养是高生产效率的要求。 历史上，高细胞密度培养首先建立在 酵母上，用以生产单细胞蛋白、乙醇 和菌体。
概述
后来，建立起其它的嗜温菌的高密度培养，生 产各种类型产品。 甲基营养生物的高密度培养导致了聚羟基烷酸 的高效生产。 如今，微生物的高细胞密 度培养的范畴已包括细菌、 古细菌和真核生物（酵母）。
对菌体量的变化进行物料衡算，则：
d ( XV ) XV dt
假定为常数，则上式积分可得：
XV X F VF e
(t t F )
由于生长符合Monod方程

m S
Ks S
μ 是S的函数，要使μ 恒定，S必须 恒定，则有：
dS 0 dt
指数速率流加的速率F的表达式为:
直接控制流加、间接控制流加 定值控制流加、程序控制流加、最优控制流 加
2. 采用流加发酵应该解决的关键问题 (1) 流加什么物质？
①补充微生物能源和碳源，如在发酵液中添加 葡萄糖、 饴糖、液化淀粉。作为消泡剂的天然油 脂，有时也能同时起到补充碳源的作用
②补充菌体所需要的氮源，有机氮或氨水 ③加入某些微生物生长或合成需要的微量 元素或无机盐 ④加入酶合成诱导物或前体物质
(2) 如何流加？
a.底物流加速率
b.流加开始时间及总流加时间
c.需控制的底物浓度
3. 流加发酵过程中某些重要参数的确定
a. 最佳底物浓度的确定
(包括菌体生长阶段和产物合成阶段)
b. 底物的消耗速率
c. 菌体比生长速率()
d. 菌体对底物的产率系数(Yx/s)
及产物对底物的产率系数(Yp/s)
F为体积流加速率(L/h)，S0为流加液中基质浓 度 (g/L) ， Yx/s 为菌体对底物的产率系数 (g/g) ， ms 为细 胞比维 持系数 (g/g/h) ， X 为菌体 浓度 (g/L)，V为培养液体积 (L) ， μ为菌体比生长速 率(h-1)。
dS dV V S F S0 ( m) V X dt dt Yx / c
1 F ( m s ) X F V F e ( t t F ) ( S 0 S ) Yx / s
其中tF为开始指数速率流加的时间， t≥tF，XF和VF分别为tF时刻的菌体浓度和 发酵液体积
指数速率流加方式在实际过程中的注 意事项：
(1)方程中各参数要预先求知 (2)应用时流加速率F可采用阶梯递增方 式进行设定

HCDC中各种微生物的最大细胞密度
微生物 细菌 Methylobacterium extorquens Escherichia coli DCW（g/l） 233 190 180 148 145 184 184 157 141 100 132 114 268 208 235 100
概述
Bacillus subtilis Alcaligenes eutrophus NCIMB 11599 Streptomyces laurentii Lactococcus lactis Pseudomonas putida BM01 古细菌 Marinococcus M52 Sulfolobus hibatae 真核 Candida brassicae Saccharomyces serevisiae Pichia pastoris
流加发酵的物料衡算式可以表达为：
d ( XV ) XV dt d ( SV ) XV S F F dt
d ( PV ) XV dt
dV F dt
流加发酵的最优化理论有：格林原理、庞特里金最小值 (最大值)原理等
在采用流加发酵技术之前要考虑的两个 问题 一、何时采用流加发酵方式？ 二、如何进行底物的流加？
Markl等计算出，填塞满长3μ m，直径1μ m 细胞的培养液中，只有25％的空间是培养基。 考虑到细胞干重是湿重的20～25%，细胞的 最大密度应该是160～200g(DCW)L。
概述
反应器
HCDC的生物反应器类型包括： 具有底物流加装置的通用式搅拌罐反应器 带有各种内置或外置细胞维持装置的搅拌 罐反应器 膜透析反应器 气升式反应器 陶瓷膜摇瓶
• 营养缺陷型菌株的培养
二、如何进行流加发酵操作？ 1. 流加发酵类型
2. 采用流加发酵应该解决的关键问题？
3.流加发酵过程中某些重要参数的确定 4.合适的流加发酵类型的确定 5. 流加方式的应用
1. 流加发酵类型
流加发酵的分类
类别 流 加 方 式
无反馈控 制
恒流量流加、变流量流加和间歇流加
反馈控制


HCDC遇到的问题
减少乙酸合成的方法

控制比生长速率在产生乙酸的临界值以下
一般可通过控制限制性底物浓度控制比生长速率。 比生长速率临界值： 在复合和半合成培养基中，约为为0.2h-1和0.35h-1；
在合成培养基中，为0.14h-1。
HCDC遇到的问题
Байду номын сангаас

选择合适的培养基
例如，甘油比葡萄糖吸收进入细胞的速度要慢，可 能会减少流入糖酵解途径的碳，这会极大的减少乙 酸的合成。 此外，加入某些氨基酸（如谷氨酸、甲硫氨酸）， 可减轻乙酸的毒害作用。 使用酸和碱调节pH而积累下来的盐会使乙酸的毒害 作用加强。