弱酸树脂D113对S_腺苷_L_蛋氨酸的交换行为及分离应用研究

Fig. 1 Structure of S-adenosyl-L-methioninePresence of the high energy sulfonium ion activateseach of the attached carbons towardnucleophilic attack离子交换与吸附, 2003, 19(2): 104 ~ 110 ION EXCHANGE AND ADSORPTION 文章编号：　1001-5493(2003)02-0104-07弱酸树脂D113对S-腺苷-L-蛋氨酸的交换行为及分离应用研究*刘 惠 林建平 岑沛霖**浙江大学(玉泉)材化学院生物工程研究所，杭州 310027摘要：考察了S-腺苷-L-蛋氨酸 (S-adenosyl-L-methionine, SAM) 在弱酸树脂争光D113上的静态吸附及分离行为，利用Langmuir 等温式对平衡等温线进行了拟合，实验表明，随着pH 的提高，平衡交换量增加，提高温度和SAM 的初始浓度在一定程度上能促进内扩散过程，利用D113树脂在φ 1.7×30.0cm 小型柱上从酵母提取液中分离SAM 的得率为90%以上，纯度达87%以上。

关键词：S-腺苷-L-蛋氨酸 (SAM ，AdoMet 或SAM-e) 弱酸树脂 离子交换 酵母 分离 中图分类号: TQ028 文献标识码: A1 前 言S-腺苷-L-蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine,简称SAM ，AdoMet 或SAM-e ），是一种生物体内广泛存在的小分子。

对关节病疗效显著，是一种有效的抗抑郁药，利于肝病患者的康复[1~3]。

分子量为399，分子结构见Fig 1。

一般采用从酵母细胞中提取的方法生产SAM ，在其溶液的pH 值及常温下，SAM 会发生各种降解及硫原子上的手性异构反应[4]，工业生产中存在的主要问题是SAM 的不稳定特点以及其复杂的分离纯化过程。

文献中一般利用选择性沉淀剂如苦酮酸、Reinack 盐、苦味酸、磷钨酸盐等沉淀SAM ，与其他杂质如核酸、蛋白类等分离[5]，工艺中有机溶剂的用量较大。

SAM 分子除具有一带正电荷的极性较强的锍基，还有3个可离子化的基团[5]：氨基酸链上的氨基和羧基p K a分别为7.8和1.8，嘌呤上的氨基p K a 为3.4，酸性条件下氨基质子化后带正电荷，可以利用阳离子树脂进行交换分离[6]。

* 收稿日期：　2002年8月18日作者简介： 刘 惠, 女(1975－), 山东省人, 在读博士研究生. E-mail: lhzju@ **通信联系人C OH OC H 2C H 2C H 2第19卷第2期 离 子 交 换 与 吸 附 ・105・SAM 分子具有一定的尺寸，而且带正电荷的锍基极性较强，适用大孔弱酸树脂进行分离，分离选择性好，但SAM 的不稳定特点需要分离操作在酸性条件下进行[7]，而弱酸树脂一般适于在碱性或中性体系中使用，否则交换能力较低，本文将主要对SAM 在D113弱酸树脂上的静态离子交换行为以及分离应用特点进行考察，为SAM 的工业化生产做准备。

2 实验部分2.1 材料SAM 标准品购自Sigma 公司，为SAM 的硫酸和对甲苯磺酸双盐。

所用的其它化学试剂均为分析纯。

争光D113树脂由杭州争光树脂厂提供，是一种丙烯酸类弱酸型阳离子交换树脂，聚合单体为丙烯腈，交联剂为TAIC(Trially-1,3,5-triazine-2,4,6-(1H,3H,5H)-trione)，其体积交换容量较大，具体性能见表1。

2.2 实验和分析方法 2.2.1 SAM 破胞萃取采用本实验室保存的酿酒酵母 (S. cerevisiae ZJUS1) 在富蛋氨酸的基质中培养[8]24h 后，利用Sorvall RC5C 冷冻离心机在5℃~10℃下3000r/min 离心后收集菌体，SAM 约占菌体干重的3%~5%，加入水和乙酸乙酯各0.12L/kg 湿酵母，剧烈搅拌30min 后，加入0.175mol/L 的硫酸溶液0.5L/kg 湿酵母，继续搅拌1.5h ，5℃下5000r/min 离心30min ，收集上清液待用，pH 约在2.0~3.5之间。

2.2.2 SAM 的定量分析[9]样品适当稀释后用HPLC 分析：色谱柱Nova-Pak C 18(150×3.9mm I.D.)；流动相40mmol/L NH 4H 2PO 4，8mmol/L 1-庚烷磺酸钠，18%甲醇，pH 用浓盐酸调至 3.0；流速0.7ml/min ；检测器波长254nm ，出峰时间4min ~5min 。

2.2.3 交换容量的测定全交换容量的测定：见文献[10]所介绍的常规方法。

表1 争光D113树脂的性能指标 分 类大孔弱酸阳树脂 树脂骨架 丙烯酸系 功能基团 －COO － 出厂形式 H + 含水量 (%)45~55 质量全交换容量 (mmol/g)≥11.0 体积全交换容量 (mmol/ml)≥4.2 湿视密度 (g/ml) 0.72~0.80 湿真密度 (g/ml) 1.14~1.2范围粒度 (%) 0.315~1.25 mm ≥95 机械强度 (%)渗磨圆球率 ≥90Ion Exchange and Adsorption 2003年4月・106・Fig. 2 Ion-Exchange Isotherm at T=303.15K with Initial pH 5.0平衡等温线测定：阳离子树脂按常规方法转成H +型，抽滤待用，分别称取0.3g~0.5g 湿树脂于50ml 的具塞三角瓶内，并取适量烘干称重，SAM 溶液（纯度95%以上，浓度0mg/ml~10mg/ml ，pH 3.0~4.0），用浓NaOH 溶液调至pH 5.0，移取10ml~20ml 于三角瓶内，置于温控摇床内，转速180r/min~190r/min ，交换8h~12h 取样分析。

静态离子交换动力学过程的测定：样品溶液用浓NaOH 溶液调至需要的pH 值，间隔一定的时间取样，其它同上。

2.2.4 从酵母萃取液分离SAM离子交换柱（φ1.7×30cm ）内D113树脂（H +型）装柱约50ml ，水洗平衡20min ，酵母萃取液pH 用浓NaOH 溶液调至5.0，调节适当流速（Pharmacia pump-1）进样，用去离子水、乙酸洗脱杂质后，采用0.1mol/L 硫酸调节不同的流速进行SAM 洗脱，流出液采用检测器（Pharmacia Optical Unit UV-1）与记录仪（Pharmacia Rec 111）监视，并采样分析。

3 结果与讨论3.1 离子交换平衡等温线通过比较，发现大孔弱酸型离子交换树脂争光D113具有在酸性条件下离子交换SAM 能力较高的特点。

在初始pH 5.0时，SAM 在D113弱酸树脂上的离子交换平衡如Fig. 2所示，可以采用Langmuir 方程描述：∗∗+=Kcbc q 1 （1） 拟合结果见Fig 2，实验测得D113树脂的总交换容量为7.67mmol/g 干树脂，Fig. 2中结果表明树脂交换容量的利用率较低。

3.2 pH 对离子交换过程的影响弱酸树脂的体积交换量随pH 增加而增加，一般适合在碱性体系中使用。

Fig. 3为D113树脂在不同初始pH 的样品溶液中的静态离子交换过程，而Fig. 4为Fig. 3中对应的平衡交换量与样品液的初始pH 的关系，在初始pH 2~5范围内，随着初始pH 的增加，由于羧基的解离受pH 影响而增加，平衡交换量也随pH 增加而增加，而且在离子交换过程中，液相pH 也会随着交换量的变化而改变。

因此式（1）所示的Langmuir 等温线由于没有考虑pH 对平衡的影响而局限于较窄的pH 范围。

第19卷第2期 离 子 交 换 与 吸 附 ・107・Fig. 3 The Effect of Initial pH on the StaticIon-Exchange of SAM on D113Fig. 4 pH Effect on Ion-Exchange Amounts onD113 at Equilibrium3.3 温度对SAM 在D113树脂上离子交换的影响当初始pH 为5.0，c 0=5.4mmol/L 时，温度控制在20℃和30℃时SAM 在D113树脂上离子交换的动力学曲线如Fig 5所示，说明温度提高将使扩散速率加快，而且主要是影响离子交换初期的速度。

在离子交换的后期，两种温度下的交换曲线几乎重合，而且平衡交换量随温度增加略有降低。

Fig. 5 Temperature Effect on Static Ion-ExchangeDynamics of SAM on D113, c 0=5.4 mmol/LFig. 6 The Dynamics of Static Ion-Exchange ofSAM on D113, T=25℃3.4 初始SAM 浓度对D113树脂上离子交换速率的影响初始pH 为5.0，25℃时，初始浓度分别为10.2mmol/L 和2.1mmol/L 时的静态离子交换动力学实验数据见Fig 6，从图中可以看到，初始SAM 浓度较高时，最终达到的离子交换量也比较高。

・108・Ion Exchange and Adsorption 2003年4月3.5 应用D113树脂从酵母提取液中分离纯化SAMTable 2 Effects of Loading Rates and Amounts on the SAM Y ield # (column volume/h)(volume ratio)(g/L resin)elution (volume ratio)(%)1.5 6.8341.8 6.490.43.07.2944.67.269.0#柱尺寸：φ1.7×30.0 cm，树脂装柱50 ml，c=6.4 g/l，pH=5.0在富含蛋氨酸的基质中培养酵母细胞，离心分离获得湿酵母，先后采用乙酸乙酯与0.175mol/L硫酸处理湿酵母，释放出胞内的SAM，离心分离出菌体碎片，将离心后的上清液的pH调节至5.0，利用φ1.7×30.0 cm小型树脂柱，D113树脂装量50ml，分别在两种速率下进样，当进样量达到床层体积的约7倍时停止进样，先用去离子水洗涤、然后再用0.1mol/L乙酸洗去部分杂质以后，以0.1mol/L硫酸洗脱SAM，实验数据及SAM得率见Table 2，可以看到当进样速率为每小时1.5倍交换柱体积、进样量为6.83倍交换柱体积时，SAM的处理量为41.8g/L resin，经过φ1.7×30.0cm小型离子交换柱分离后，SAM得率达到了90%以上。