BioRT cDNA第一链合成试剂盒 100(20070225)-Hangzhou
总RNA提取,cDNA第一条链合成,cDNA纯化,3‘端加尾实验,荧光定量PCRprotocol
RNA Extraction Protocol1.实验原理异硫氰酸胍/苯酚法-----目前实验室使用的方法！✓细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放✓释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离细胞或组织1. 样品裂解2. 分离总RNA2.实验试剂与器材2.1实验试剂RNA提取试剂Trizol（Invitrogen）、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、DEPC 水，反转录试剂盒（Fermentas），cDNA纯化试剂盒（Promega），末端加尾酶TdT （Thermo）。
2.2实验器材微量移液器（Eppendorf），电泳仪，电泳槽，超净工作台，4℃低温离心机（Eppendorf），常温离心机（Eppendorf），匀浆机（IKA），高压蒸汽灭菌锅，通风橱，紫外分光光度计（Eppendorf），PCR仪（Takala），剪刀，镊子，0.2mL、1.5mL离心管，枪头。
3.实验前准备工作实验前将要用到的试剂配好（75%乙醇：75mL的无水乙醇+25mL的去离子水；DEPC水：在1000ml双蒸水中加入DEPC原液1ml，然后摇匀过夜），与离心管、枪头、剪刀、镊子（用DEPC水处理过的，浸泡过夜）一起灭菌（126℃，90min），之后剪刀和镊子最好在紫外灯下照射半小时。
提前20min打开低温离心机预冷。
准备两幅手套，一个口罩，塑胶手套不能离开通风橱，整个实验过程尽量降低外源RNA酶对样品中RNA的降解。
4.实验步骤4.1取样（1）组织样品：将组织在RNA保护液中用剪刀剪碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
（2）贴壁培养细胞：不须消化，直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。
第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 中文说明书
第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit中文说明书2013-12-07 13:20:16Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379012001b)04896866001c************1红色TranscriptorReverseTranscriptase（逆转录酶）a) 1瓶，25 μl (20 U/μl)b) 1瓶，50 μl (20 U/μl)c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl)•储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.22无色Transcriptor RTReaction Buffer(5×)（逆转录缓冲液）a) 1瓶，1 mlb) 1瓶，1 mlc) 2瓶，各1 ml• 5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)3无色ProtectorRNase Inhibitor（RNase抑制剂）a) 1瓶，50 μl(40 U/μl)b) 1瓶，100 μl(40 U/μl)c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl)•储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)4黄色/紫色Deoxynuc-leo-tideMix（dNTP）a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖)b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖)c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖)• dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM5蓝色Anchored-oligo(dT)18Primer（锚定oligo(dT)18引物）a) 1瓶，100 μl(50 μM)b) 1瓶，200 μl(50 μM)c) 2瓶，各200 μl(50 μM)6Random Hexamera) 1瓶，100 μl(600 μM)蓝色Primer（随机引物）b) 1瓶，200 μl(600 μM)c) 2瓶，各200 μl(600 μM)7绿色Control RNA（对照RNA）a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl)•包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA片段稳定溶液8绿色Control Primer Mix PBGD（对照基因引物）a) 1瓶，40 μl•5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物9(b和c为瓶7)无色Water, PCR-gradea) 1瓶，1 mlb) 2瓶，各1 mlc) 3瓶，各1 ml注意：货号为***********和***********的产品不含有control试剂(瓶7和瓶8)，因此瓶7即为Water, PCR-grade。
一步法RT-PCR试剂盒使用说明书
一步法RT-PCR 检测试剂盒 (一步法RT-PCR 扩增试剂盒)(目录号HS0612-2)产品包装保存条件-20℃产品简介本试剂盒是专为一步法RT-PCR 实验研制，逆转录和PCR 在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。
本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA 聚合酶，同时包含适用于逆转录和PCR 扩增的反应缓冲液和实验中所必需的反应组分。
经过重组表达的SuperRT 逆转录酶RNase H 活性缺失，减少了逆转录反应中RNA 的降解，更容易获得全长的cDNA 。
该逆转酶逆转录效率高，可对少量 RNA 模板进行良好的逆转录反应。
SuperRT 逆转录酶与RNA 亲合性高，能通读GC 含量高，二级结构复杂的RNA 模板，获得高产量的cDNA 。
PCR 反应使用的DNA 聚合酶具有扩增效率高、延伸速度快的优良性能。
独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。
使用该试剂盒能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录和PCR 扩增反应。
使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个″A ″碱基，可直接用于T/A 克隆。
北京厚生博泰科技有限公司Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.产品特点1. 效率高，可以高效转录GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。
2. 耐热性及稳定性强。
3. 操作简单迅速,最大限度的避免污染。
4. 独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。
使用方法1）一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20 ~ 30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2）延伸时间根据所扩增的片段大小设定，本产品中所包含的DNA Polymerase的扩增效率为1 kb/30s。
3）可根据扩增产物的下游应用设定循环数。
ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKitK说明书第一链cDNA合成试剂盒
RevertAid第一链cDNA Synthesis试剂盒#K1621, #K1622分析证明书质量控制#K1621Lot采用100 fg对照GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物质量认证人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组成 (2)存储条件 (2)产品说明 (2)注意事项 (3)操作步骤 (6)RT-PCR (6)合成cDNA用于克隆………..………………………………………7 实验对照……………………………………………………………….8 问题分析与解决 (10)** 一个单位的RiboLockRNase酶抑制剂抑制5ng RNA酶A 50%的活性。
存储条件试剂盒中所有组分应存储在-20°C。
对照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。
产品说明RevertAid第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。
本试剂盒使用RevertAid M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。
该反转录酶可耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。
试剂盒中含有RiboLock 重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。
试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。
随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA中任何RNA为模板合成cDNA。
oligo(dT)18选择性和RNA 3’po ly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的mRNA为模板合成cDNA。
使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。
合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。
cdna第一链合成所需要的引物
cdna第一链合成所需要的引物CDNA第一链合成需要的引物是DNA聚合酶在合成cDNA时所使用的短的DNA片段。
引物通常由两个部分组成，一个部分是具有亲水性的序列，在合成反应开始时，能够与RNA模板的末端结合；另一个部分是亲脂性的序列，与DNA聚合酶结合，用于酶的附着和合成扩增。
在cDNA第一链合成中，有两种主要的引物：随机引物和寡聚引物。
下面将对这两种引物进行详细介绍。
1. 随机引物：随机引物是由所有四种核苷酸（A、T、C和G）随机分布而成的短寡核苷酸序列。
它通常由6-20个核苷酸组成。
随机引物可以与RNA模板中的任意位置结合，因此可以产生全长覆盖的cDNA。
在cDNA合成过程中，随机引物在RNA 模板上的结合位点是随机的，所以合成的cDNA是等长的。
2. 寡聚引物：寡聚引物是由具有特定碱基序列的寡核苷酸组成的。
常用的寡聚引物是d(T)18-Oligo(dT)引物或d(N)6引物。
d(T)18-Oligo(dT)引物含有18个连续的寡聚T序列（T18），它主要与RNA模板的多聚腺苷酸尾部结合，以确保合成cDNA的特异性。
d(N)6引物包含了六个随机分布的核苷酸（N），它能够在cDNA 合成反应中覆盖众多的RNA序列。
两种寡聚引物的选择取决于实验的需要，例如，d(T)18-Oligo(dT)引物适用于合成特定RNA的全长cDNA，而d(N)6引物适用于合成整个RNA群的cDNA。
总结起来，cDNA第一链合成所需要的引物主要有随机引物和寡聚引物。
随机引物能够在RNA模板上的任意位置结合，产生全长覆盖的cDNA；而寡聚引物则具有特异性，能够选择性地合成特定RNA或整个RNA群的cDNA。
不同引物的选择取决于需要合成的cDNA的特性和研究目的。
ThermoScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒适用于RT-qPCR
产品信息Thermo ScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒（适用于RT-qPCR）#K1641，#K1642/onebio分析证书经验证，在两步法RT-qPCR中，对于不同起始量（5 ng-0.5 fg）的RNA逆转录产物，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR 预混液进行qPCR扩增。
其反应效率在90-110％之间，曲线斜率在-3.09和-3.58之间，且相关系数>0.99。
质量授权人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组分 (4)贮存条件 (4)产品描述 (4)重要提示 (5)RT-qPCR实验方案 (6)对照反应 (6)疑难解答 (7)参考文献 (8)试剂盒组分贮存条件所有试剂盒成分都应贮存于-20 °C。
产品描述Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒是合成cDNA第一链的方便系统，适用于两步法实时定量RT-PCR（RT-qPCR）中的cDNA合成。
试剂盒采用先进的Maxima 反转录酶（RT），该酶源自M-MuL V 逆转录酶的体外进化。
这种酶相比M-MuL V逆转录酶热稳定性高，扩增效果强劲且具有更高的cDNA合成效率。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒能够在较高温度下（55-65℃），在很宽的总RNA量范围内（从1 pg到5 μg）合成cDNA。
合成反应能在15-30分钟内完成。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒的各组分经预混合，以节约时间和减少移液错误。
试剂盒由Maxima Enzyme Mix、5×反应混合液、无核酸酶的水三部分组成。
Maxima Enzyme Mix包含Maxima反转录酶和Thermo Scientific Ribolock RNase抑制剂。
重组的Ribolock RNase抑制剂能有效保护RNA模板在高于55℃时不被RNase A、B和C降解。
ThermoScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒适用于RT-qPCR
产品信息Thermo ScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒（适用于RT-qPCR）#K1641，#K1642/onebio分析证书经验证，在两步法RT-qPCR中，对于不同起始量（5 ng-0.5 fg）的RNA逆转录产物，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR 预混液进行qPCR扩增。
其反应效率在90-110％之间，曲线斜率在-3.09和-3.58之间，且相关系数>0.99。
质量授权人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组分 (4)贮存条件 (4)产品描述 (4)重要提示 (5)RT-qPCR实验方案 (6)对照反应 (6)疑难解答 (7)参考文献 (8)试剂盒组分贮存条件所有试剂盒成分都应贮存于-20 °C。
产品描述Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒是合成cDNA第一链的方便系统，适用于两步法实时定量RT-PCR（RT-qPCR）中的cDNA合成。
试剂盒采用先进的Maxima 反转录酶（RT），该酶源自M-MuL V 逆转录酶的体外进化。
这种酶相比M-MuL V逆转录酶热稳定性高，扩增效果强劲且具有更高的cDNA合成效率。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒能够在较高温度下（55-65℃），在很宽的总RNA量范围内（从1 pg到5 μg）合成cDNA。
合成反应能在15-30分钟内完成。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒的各组分经预混合，以节约时间和减少移液错误。
试剂盒由Maxima Enzyme Mix、5×反应混合液、无核酸酶的水三部分组成。
Maxima Enzyme Mix包含Maxima反转录酶和Thermo Scientific Ribolock RNase抑制剂。
重组的Ribolock RNase抑制剂能有效保护RNA模板在高于55℃时不被RNase A、B和C降解。
cDNA第一链合成试剂盒
cDNA 第一链合成试剂盒操作方法1、逆转录反应（ 1）在无菌薄壁管中加入以下成份：Total RNA 0.5-1.0 μg(dN) 9 or oligo(dT) 18 100pmol（ 2）混匀后， 70℃变性 5min，将薄壁管迅速置于冰上冷却，然后依次加入以下成份：5×M-MLV Buffer 4μldNTPs（ 10mM each）RNasin 1μl 10U100mM DTTM-MLV Reverse Transcriptase 2μl 100UDEPC-treated water up to 20 μl（ 3）混匀后短暂离心，使用oligo(dT) 18 引物时在42℃，使用随机引物(dN) 9 时在37℃下温育 1 小时。
（4） 94 ℃ 5min 终止反应后，冰上冷却。
（5）合成的 cDNA第一链可直接用于 PCR扩增或进行其它下游操作。
2、 PCR扩增（ 1）在 PCR薄壁管中加入以下试剂Synthesized cDNA 2-5 μl10×PCR Buffer 2μlUpper primer 10pmolLower primer 10pmoldNTPs（10mM each）0.5 μlTaq DNA Polymerase 1.5UddH2O up to 20 μl（ 2）混匀后短暂离心，然后进行PCR扩增。
94℃预变性 2.5min 。
进入下列30~40 个循环（此扩增条件仅供参考）：94℃30s， 60℃ 45s ，72℃ 1min ~3min。
最后 72℃延伸 7min。
注意事项1、确保 RNA完整性及纯度。
RNA质量是决定合成cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性可由 OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。
较纯的 RNA 样品 OD260/OD280比值通常为 1.8-2.0 ，若该比值偏低，应进一步纯化。
真核生物RNA样品电泳图谱 28s 和 18s 的比值约为 2:1 ，否则，表明有 RNA降解。
百泰克石蜡组织基因组DNA自动提取试剂盒（磁珠法）说明书
北京百泰克生物技术有限公司BioTeke Corporation地址：北京海淀区留学人员创业园电话：************传真：************网址： Email:****************一般实验室使用，仅用于体外石蜡组织基因组DNA自动提取试剂盒（磁珠法）自动、快速提取石蜡组织基因组DNA目录号：AU7111116次使用手册2016年11月，第4版北京百泰克生物技术有限公司BiotekeCorporation一、试剂盒组成、储存、稳定性本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
注意事项1.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，使用时可短暂离心后，加入1mL灭菌水溶解，-20℃保存，经常使用可以放在4℃。
2.避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
3.核酸提取仪在运行前请先检查仪器是否正常，磁力架是否在水平位置。
4.深孔板在核酸提取仪中放置时要平稳，并用底部卡槽卡紧，避免晃动。
二、操作步骤1）将石蜡组织切成4~10um厚的薄片，用灭菌小镊子将切片放入1.5ml离心管中，组织的量在5-20mg左右（5-10片），加入400uL溶液B，90°C 水浴30min。
2）12,000rpm离心2min，石蜡会浮于液体表面，组织沉于管底，将除石蜡外的液体及组织转移至预装深孔板的第1、7列，加入20ul蛋白酶K。
裂解温度设置65°C，按照下面程序，点击“运行”开始实验,运行40分钟之后加入300ul无水乙醇。
步骤孔位名称等待时间（min）混合时间（min）磁吸时间（s）混合速度容积运行状态11裂解0400慢500否22转移磁珠0130慢300否31吸附核酸02060慢500否42洗涤0030中400否53漂洗0330中400否64漂洗0230中500否75漂洗0130中600否86洗脱21560中200否92弃磁珠000慢0否3）DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放，请放置在-20℃。
使用快速反转录试剂盒合成第一链cDNA
RT延伸。
注意事项
1. 下列操作步骤适用于模板量为50 ng-2 μg的总RNA，如果总RNA量大于2 μg，请按比例扩 大反应体系。
2. 在冰上进行操作，防止RNA发生降解。 3. 不需分开变性和退火两个步骤。但是对于二级结构很复杂的RNA模板，推荐使用变性步
KR116-0μl 25 μl 50 μl 1 ml
KR116-02 (100 rxn)
200 μl 200 μl 100 μl 200 μl 2×1 ml
KR116-03 (1000 rxn) 10×200 μl 10×200 μl 10×100 μl 10×200 μl 10×2×1 ml
操作步骤
使用快速反转录试剂盒合成第一链cDNA
50 ng-2 μg总RNA可建立20 μl反应体系。
1. 将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×King RT Buffer、 RNase-Free ddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液 涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配 制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
2. 按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育 3 min。然后置于冰上放置。
表1 gDNA去除反应体系
组成成分
使用量
5×gDNA Buffer
产品特点
反转录效率高：反转录效率可达95%以上； 操作简单快速：反应体系配制简单，21 min完成cDNA第一链的合成； 通读复杂模板：能够作用于GC含量高，二级结构复杂的RNA模板； 样品普适性高：对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高； 后续兼容性好：后续配合荧光定量检测产品，灵敏度高、稳定性好。
cDNA第一链的合成
cDNA合成1. cDNA第一链的合成1.1 取一个0.2 ml 薄壁管，于冰浴上加入：混匀，短暂离心收集液滴至管底。
1.2 72°C温育2分钟后，冰浴2分钟并短暂离心收集液滴至管底。
1.3 在管中冰浴按下列顺序加入：混合后离心5 秒钟，置冰上备用。
1.4 GeneAmp 2400 PCR仪上42°C温育1小时。
注：若使用水浴进行温育，应在反应混合物上覆盖一滴石蜡油以防止水分蒸发。
1.5 取出管子置于冰浴上中止反应。
若不进行下一步，则将产物冻存于-20°C。
2. LD PCR扩增cDNA双链2.1于冰浴上在0.2ml薄壁管中加入：混匀后，短暂离心收集液滴至管底。
根据表1的数据确定PCR循环数。
2.2 GeneAmp 2400 PCR仪上进行PCR反应，参数为：· 95°C 1min· 22次循环：95°C 15sec68°C 5min3. 双链cDNA补平反应3.1 每50μl扩增好的双链cDNA加2μl浓度为20μg/μl的蛋白酶K，混匀后45°C温育1小时，短暂离心后置于90°C，10分钟以灭活蛋白酶K。
3.2 将离心管冰浴2分钟，加入3μl（15 units）T4 DNA聚合酶，16°C反应30分钟。
3.3 72°C，10分钟灭活酶，加入27.5μl，4 mol/L醋酸铵，再加入210 μl 95％的乙醇，颠倒管子数次混匀溶液。
3.4 立即于室温，14,000 rpm条件下离心20分钟（离心前不要将管子置于冰浴，否则会有杂质的共沉淀）。
小心弃上清，用80％乙醇洗涤沉淀一次。
3.5 室温干燥沉淀，用19μl水重溶。
4. 接头与cDNA的连接4.1 在3中第5步得到的重悬液中加入：混匀后，短暂离心收集液滴至管底。
16°C连接过夜。
4.2 加入3μl，0.2mol/L EDTA中止反应。
cdna_synthesis_kit
0.2-2 μg 1 μl 1 μl 4在PCR仪上按以下条件进行反转录反应:
30°C
5min
42°C 30-40min
95°C
5min
4°C
产品组分
组分名称 M-MuLV 反转录酶 (200 U/μl) 5XRT PCR Buffer dNTP Mixture (10 mM each) Rnase Inhibitor (40 U/μl) Oligo (dT)15 Primer (20 μM)
cDNA 第一链合成试剂盒 1st cDNA Synthesis Kit
使用说明书
Cat. No.: D0401 包装量：50次
产品说明
本试剂盒采用莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶M-MuLV ，该酶通过点突变使RNase H活性缺失，而保持完全的 mRNA-directed DNA多聚合活性，有效增强了cDNA的 合成效率、增加了该酶与模板/引物的亲和力, 从而增 加了酶的活性和持续合成能力。本试剂盒优化了反应 Buffer，能使反应的模板量（Total RNA）可在0.2-2 μg 范围之间进行逆转录反应。cDNA合成后进行PCR扩增 既可检测到长cDNA（>10 kb）片段，也可检测到低丰 度cDNA样品。本试剂盒提供了由Total RNA或mRNA合 成cDNA第一链所需要的全部试剂，并提供两种cDNA合 成引物。合成的第一链cDNA可广泛用于2nd Strand的合 成、杂交、PCR扩增、Real-Time PCR反应等。
Rnase Free H2O
储存条件
-20°C保存，避免反复冻融。
数量 50 μl 250 μl 50 μl 25 μl 50 μl
1 ml
操作方法
1．按以下组分配制反转录反应液
Thermo Scientific Rever id First Strand cDNA Synthesis Kit K 说明书 第一链cDNA合成试剂盒
#K1621, #K1622
分析证明书 #K1621 Lot
质量控制
采用100 fg对照GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴 化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物
质量认证人：Jurgita Zilinskiene
RT-PCR…………………………………………………………….6 合成cDNA用于克隆………..………………………………………7 实验对照……………………………………………………………….8 问题分析与解决……………………………………………………...10
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试剂盒成分
RevertAid™第一链cDNA合成试剂盒
2. 37°C 孵育 30 分钟。
3. 加入1 μl 50 mM EDTA，65°C 孵育10分钟。在含有二价阳离子(1)而缺乏螯合剂的环境中，RNA
产品说明
RevertAid™第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。本试剂 盒使用RevertAid™ M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。该反转录酶可 耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。
试剂盒中含有RiboLock™ 重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。 试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA 中任何RNA为模板合成cDNA。oligo(dT)18选择性和RNA 3’poly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的 mRNA为模板合成cDNA。使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。 合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增， 也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。
31cDNA第一链的合成
3.1 cDNA第一链的合成1)在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mRNA各2ug(2-4ul)，然后加入1ul(10uM) 随机引物(9mer)，70℃温浴2min,然后迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物：5×First-strand Buffer 2uldNTPs Mix(10mM) 1ulsterile H2O 1ulAMV Reverse Transcriptase(20U/ul) 1ul2)42℃反应1.5hr.，然后将离心管置于冰上,终止cDNA第一链的合成,然后马上进行第二链的合成。
3.2cDNA第二链的合成1)在已经合成好cDNA第一链的离心管中每管加入如下反应物，16℃反应2hr：sterile H2O 48.4-50.4 ul5×Second-strand Buffer 16.0uldNTPs Mix(10mM) 1.6ul20×Second-strand Enzyme Cocktail 4.0ul2) 混匀, 16℃反应2hr3)加入2ul(6U)T4 DNA Polymerase，16℃反应30min。
4)加入20×EDTA/Glycogen Mix 4ul，以终止反应。
5)加入100ul 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,离心14000rpm/10min,吸取上清到一新的1.5ml的离心管中,加入100ul氯仿:异戊醇(24:1)离心 14000rpm/10min,吸取上清到一新的1.5ml的离心管中,加入40ul4MNH4Oac和300ul95%的乙醇离心14000rpm/20min倒去上清,向离心管中加入500ul的乙醇, 离心 14000rpm/10min 倒去上清,放置10min,使剩余的乙醇挥发调,溶解于50ul双蒸水中。
3.3cDNA质量检测根据目的基因Ccl1(GI:1694628)的cDNA序列设计特异性引物（CF：5′-…………………-3′ CR：5′-…………………….-3′），目标片段大小为nbp。
BeyoRT cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) 说明书
BeyoRT cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)产品编号产品名称包装cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) 10次D7166 BeyoRT产品简介：¾BeyoRT cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)，即BeyoRT First Strand cDNA Synthesis Kit (RNase H minus)是一种采用了经过改造和优化的BeyoRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)，用于在总RNA、mRNA等RNA模板的基础上反转录产生cDNA第一链的试剂盒。
本试剂盒包含了进行cDNA第一链合成所需的各种试剂。
¾采用本试剂盒可以合成长达13kb的cDNA第一链。
在采用BeyoRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)的情况下，由于缺失了RNase H，RNA和DNA双链复合物中的RNA不会被降解，这样反转录出来的cDNA的长度就会更长，并且产量更高。
¾试剂盒中提供了RNase Inhibitor，确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得较好的反转录效果。
¾试剂盒还提供了Oligo(dT)18和random hexamer这两种引物，前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录，后者进行反转录时不需要poly(A)尾。
也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。
¾试剂盒中提供的Control Primer为17聚，即引物的长度为17个碱基。
试剂盒中提供的Control RNA为带有3’ poly(A)的1.1kb RNA。
¾使用本试剂盒合成的第一链，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。
¾本试剂盒用于体积为20微升的cDNA第一链合成反应时足够进行10个cDNA第一链样品的合成。
包装清单：产品编号产品名称包装D7166-1 BeyoRT M-MuLV反转录酶(RNase H-) 2000UD7166-2 Reaction Buffer (5X) 50µlD7166-3 RNase Inhibitor (20U/µl) 10µlD7166-4 dNTP Mix (10 mM each) 20µlD7166-5 Oligo(dT)18 Primer (0.5µg/µl) 10µlD7166-6 Random Hexamer Primer (0.2µg/µl) 10µlD7166-7 Control RNA (20ng/µl) 6µlD7166-8 Control Primer (5pmol/µl) 6µlD7166-9 DEPC-treated Water 0.2ml－说明书1份保存条件：-20℃保存。
实验四 cDNA的合成
实验四cDNA的合成1．目的与要求：掌握cDNA的合成方法。
2．实验原理cDNA的合成是进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的基础。
RT-PCR的原理是利用组织或细胞中的总RNA, 以其中的mRNA作为模板, 采用Oligo (dT)或随机引物, 利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增,从而获得目的基因或检测基因表达。
该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
对于cDNA第一链的合成, 目前试剂公司有多种cDNA第一链的试剂盒出售, 其基本原理相同, 但操作步骤不一。
3. 仪器设备：高压灭菌锅、烘箱、恒温水箱、制冰机、蜗旋震荡器、台式微量离心机、移液枪等。
4. 实验材料：1.5ml、2ml、200ul离心管、一次性枪头等。
5. 试剂：5.1 TIANScript M-MLV。
5.2 Frist-Strand buffer(含有DTT)。
5.3 RNasin。
5.4 2.5mmol/L dNTP Mix。
5.5 0.1mol/L DTT。
5.6 RNase-free ddH2O。
5.7 Oligo(dT)15。
5.8 RNase H。
6. 实验步骤6.1 在冰浴的0.2ml微量离心管中, 加入总RNA 1∼5μg（实验二）、2μl Oligo(dT)、2ul dNTP，补充适量的DEPC水使总体积达14.5μl,轻轻混匀。
156.2 将混合液置于70 o C水浴中加热5min, 立即将微量离心管插入冰浴中2min。
简短的离心收集反应液后加入以下各组分：4ul 5x Frist-Strand buffer(含有DTT)，0.5ul RNasin。
6.3 加1ul（200U）TIANScript M-MLV，轻轻用移液器混匀。
如果用随机引物，请将离心管置25o C温浴10分钟。
6.5 在42 o C孵育50min。
6.6 置95 o C加热5min 终止反应。
cDNA 第一链合成
RevertAid™ PremiumFirst Strand cDNA Synthesis Kit#K1651, #K1652CERTIFICATE OF ANALYSIS#K1651Lot ___QUALITY CONTROLRT-PCR using 100 fg of control GAPDH RNA and GAPDH control primers generated a prominent496 bp product on 1% agarose gel after ethidium bromide staining.Quality authorized by: Jurgita ZilinskieneRev.3IMPORTANT NOTES RNA quantityAvoiding ribonuclease contamination ∙Use 1 pg - 5 µg of total RNA, 0.1 pg - 500 ng of poly(A) mRNA or 0.01 pg – 500 ng ofspecific RNA transcript to generate first strand cDNA as the initial step of a two-step RTRNA purity and integrity is essential for synthesis of full-length cDNA. RNA can be degradedPCR protocol.by RNase A, which is a highly stable contaminant found in any laboratory environment. Allcomponents of the kit have been rigorously tested to ensure that they are RNase free. To ∙Use 1 µg of isolated mRNA to generate first strand cDNA for second-strand synthesis and prevent contamination both the laboratory environment and all prepared solutions must be free subsequent cloning reactions.of RNases.PrimersGeneral recommendations to avoid RNase contamination:Synthesis of first strand cDNA can be primed with either oligo(dT)18 primer, random primers or ∙Use certified nuclease-free labware or DEPC-treat all tubes and pipette tips to be used ingene-specific primers.cDNA synthesis.Oligo(dT)18 primes cDNA synthesis from the poly(A) tail present at the 3’-end of eukaryotic∙Wear gloves when handling RNA and all reagents, as skin is a common source of RNases.mRNA. Random primers initiate cDNA synthesis from the total RNA population (rRNA and Change gloves frequently.mRNA). Therefore, using random primers for first strand synthesis results in a greater∙Use RNase-free reagents, including high quality water (e.g., Water, nuclease-free, complexity of the generated cDNA compared with the oligo(dT)18 primer. As a consequence,#R0581). the sensitivity and specificity of subsequent PCR reactions may be reduced. However, there ∙Keep the kit components tightly sealed when not in use. Keep all tubes tightly closed during are several applications where it is beneficial to use random primers, such as cDNA synthesis the reverse transcription reaction. using mRNAs without a poly(A) tail, or cDNA synthesis using poly(A)-enriched RNA samples.Gene-specific primers are used to synthesize specific cDNA from a pool of total RNA or mRNA Template RNAand must be obtained by the user.Total cellular RNA isolated by standard methods is suitable for use with the kit. Purified RNAmust be free of salts, metal ions, ethanol and phenol to avoid inhibiting the cDNA synthesisreaction. CONTROL REACTIONS for RT-PCR / RT-qPCRFor RT-PCR applications, template RNA must be free of DNA contamination. Prior to cDNA The following negative control reactions should be used to verify the results of the first strand synthesis, RNA can be treated with DNase I, RNase-free (#EN0521) to remove trace amounts cDNA synthesis.of DNA. ∙Reverse transcriptase minus (RT-) negative control is important in RT-PCR and Always perform a RT-minus negative control reaction, which includes all components for RT-qPCR reactions to assess for genomic DNA contamination of the RNA sample. The RT-PCR except the RevertAid™ Premium Enzyme Mix. control RT- reaction should contain all reagents for the reverse transcription reaction RNA sample quality except for the RevertAid™ Premium Enzyme Mix.∙No template control (NTC) is important to assess for reagent contamination. The NTC Assess RNA integrity prior to cDNA synthesis. Total eukaryotic RNA can be analyzed byreaction should contain all reagents necessary for the reverse transcription reaction except agarose gel electrophoresis followed by ethidium bromide staining. The RNA isfor the RNA template.considered to be intact, if both 18S and 28S rRNA appear as sharp bands afterelectrophoresis of total RNA. The 28S rRNA band should be approximately twice asintense as the 18S rRNA. Any smearing of rRNA bands is an indication of degradedmRNA. If this occurs, a new sample of total RNA should be prepared. Alternatively, totalRNA can be analyzed using a bioanalyzer (e.g., Agilent 2100) which providesquantitative information about the general state of the RNA sample, the RNA integritynumber (2). A reference gene/target gene 3’:5’ integrity assay (3) can also be used todetermine the integrity of the RNA sample.34。
一管式双链cDNA合成试剂盒说明书
一管式双链cDNA合成试剂盒说明书产品编号：BTN130308规格：10T产品及特点：本产品是用于一管式双链cDNA合成的试剂盒。
cDNA第一链合成的原理是以OligodT为通用引物的、MMLV催化的逆转录反应。
其原理如下：cDNA第二链合成的原理是用RNase H使RNA-DNA杂合链中的RNA产生切口，再用DNA Polymerase I通过切口平移(nick translation)反应进行RNA链取代合成cDNA第二链，其原理图如下：本产品具有下列特点：1.即开即用，含有合成两条cDNA链的所有试剂。
2.适用于含poly rA的RNA，对不含poly rA的RNA（如细菌RNA），不能使用本试剂盒制备ds cDNA。
3.一管式进行，第一链cDNA合成后不需要任何处理，直接进入第二链的合成。
4.所得双链cDNA可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库构建、抑制性差减杂交等。
5.本试剂盒足够10次80μL体系的双链cDNA合成反应。
6.如果需要合成全长cDNA，最好选用SMART全长cDNA双链合成试剂盒。
规格及成分：成分规格Oligo dT引物10μlcDNA第一链合成缓冲液40μlMMLV逆转录酶（200U/μL）10μl5×cDNA第二链合成缓冲液160μl20×cDNA第二链合成酶混合液40μlT4DNA聚合酶20μl0.2M EDTA溶液40μl超纯水1ml说明书1份保存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：mRNA提取试剂盒使用方法：一：mRNA的制备本试剂盒不提供mRNA提取试剂，用户需自备相关试剂。
二：双链cDNA的合成1.在一个干净的塑料离心管中，按下表设置cDNA合成反应：成分用量自备mRNA样品4μL（0.5-2μg）Oligo dT引物1μL70℃2分钟后室温放置2分钟，短暂离心cDNA第一链合成缓冲液4μLMMLV逆转录酶1μL轻柔吹打混匀后42℃保温90分钟合成第一链cDNA超纯水48μLcDNA第二链合成缓冲液16μLcDNA第二链合成酶混合液4μL轻柔吹打混匀后，短暂离心，16℃保温2小时自备的T4DNA聚合酶2μL轻柔吹打混匀后，16℃继续保温30分钟0.2M EDTA溶液4μL注：如果不需要将双链cDNA平末端化，则可以跳过T4DNA聚合酶处理步骤。
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温育10分钟，再冰浴5min后继续后续实验；逆转录长链RNA （> 2kb）时，建议在42℃左右进行。
**** 95℃加热使AMV Reverse Transcriptase失活并阻止其与DNA结合。
使用提示1. RNA模板可以采用总RNA或mRNA，建议使用Biozol(BSC51M1)制备高质量RNA；2. RT实验应避免RNase污染，可采用以下措施：1）因人的皮肤表面和唾液都有RNase，因此实验中应戴一次性手套和口罩；2） RT实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA；3） RT实验相关耗材应使用干热灭菌（180℃，60分钟）或用0.1％ DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时后在121℃高压灭菌30分钟；3. AMV逆转录酶和RNase抑制剂在取用之前应离心后再吸取，吸取时动作要慢，使用后应尽快放回-20℃；4. dNTP应避免反复冻融以免失效；5. 引物的选择可根据具体情况，Oligo-dT适用于具有PolyA尾的RNA(一般是真核生物的mRNA)，Random Hexamer Primer适用于所有RNA，尤其适用于有复杂二级结构的RNA，特异性引物适用于已知模板序列的RNA；6. PCR反应中MgCl2浓度可依据不同条件进行调整，当目的片段长度大于2kb时，我们建议增加MgCl2浓度，以0.5mM间隔梯度增加。
RT-PCR实验必需用品仪器和耗材试剂离心机DEPC(焦碳酸二乙酯)微量移液器移液器吸头RNase free离心管电泳缓冲液水浴装置或金属浴装置上样缓冲液电泳及UV装置DNA Marker参考文献1. Houts, G.E., Miyagi, M., Ellis, C., Beard, D., and Beard, J.W. (1979) J.Virol.29(2):517-522.2. Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzymology, Volume 152. pp316-325. Edited by Shelby Berger and Alan R. Kimmel. Academic Press, Inc.BioRT cDNA First Strand Synthesis KitUser’s ManualBioRT cDNA第一链合成试剂盒说明书Cat No.: BSB09M1产品说明BioRT cDNA第一链合成试剂盒，是在反转录酶（AMV）的作用下，以动植物来源的RNA为模板，利用Oligo(dT)或者随机引物合成cDNA第一条链。
该试剂盒采用美国先进技术生产的高质量逆转录酶(AMV酶)进行的逆转录反应，可得到高产量的cDNA，并可逆转录长达10kb的cDNA，同时AMV逆转录酶有较高的热稳定性，其反应温度可高达60℃，特别可以逆转录具有复杂二级结构的RNA模板。
该产品包含了逆转录反应必需的所有反应组分。
RT-PCR原理Components (100 rxns)AMV Reverse Transcriptase(5U/μl) 5 x RT BufferdNTP Mixture(10mM)RNase inhibitor(40U/μl)Oligo-dT(18)Random PrimerRNase free H2O 52 μl 500 μl 200 μl 52 μl 52 μl 52 μl 1 mlStore at -20℃ProtocolRT reactiona、Reaction setup for cDNA synthesis5 x RT Buffer 2 μldNTP Mixture (10mM) 1 μlOligo-dTor Random Hexamer Primer** 0.5 μlor special downstream primerRNase inhibitor (40U/ul) 0.5 μlAMV Reverse Transcriptase (5U/ul) 0.5 μlSample RNA*x μlRNase free H2O 5.5-x μltotal 10 μlNotes* When you do controls. Sample RNA valume can be add up to 5.5ul (≤1ug ).b、RT reaction condition(room temprature，10min) **42-60℃ ***，45min95℃ ****，5minice bath，5mincDNA for PCR reaction.Notes**If using random Hexamer Primer, holding at room temprature for 10 minutes.*** Reaction temperature can be elevated for RNA template with second structure，lower than 60℃.**** Heat to 95℃let AMV Reverse Transcriptase denature.Using Tips1. Total RNA or mRNA can be used as RNA template，and we suggest using Biozol(BSC51M1)to isolate high quality RNA；2. RNase contamination should be avoided and follow the measures:1）Ware one time gloves and respirator because of the RNases in saliva and skin;2）Use special instruments and consumables and handle in specific areas;℃℃3）Consumables should be treated at 180 for 60min or 37 for 12 hours℃with 0.1% DEPC H2O followed by sterilized at 121 for 30min;3. AMV reverse transcriptase, Taq polymerase and RNase inhibitor should be℃slowly pipetted after centrifuging, and put back at -20 later;4. Avoid frequently freezing and thawing dNTP;5. Specific primers should be used and concentration of primers should be optimized and We suggest 0.4μM as a starting point for optimizing; Oligo-dT and Random primers are not suitable for this kit;Required materials for RTInstruments and consumables ReagentsCentrifuge DEPC Pipettes Tips RNase free tubes Electrophoresis BufferWater bath instruments Loading BufferGel electrophoresis instruments DNA MarkerReference1. Houts, G.E., Miyagi, M., Ellis, C., Beard, D., and Beard, J.W. (1979) J.Virol.29(2):517-522.2. Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzymology, Volume152. pp 316-325. Edited by Shelby Berger and Alan R. Kimmel. Academic Press, Inc.Descri ptionBioRT cDNA First Strand Synthesis Kit provides the materials needed to rapidly and reliably synthesis first strand cDNA from RNA. It uses AMV reverse transcriptase to synthesize first strand cDNA from an RNA population.The kit includes all the necessary reagents for first strand cDNA synthesis. The kit includes both random primers and oligo(dT18) primers. The user can choose either of these or alternatively use gene specific primers. The reverse transcriptase in the BioRT cDNA First Strand Synthesis Kit is AMV, which provides up to 60℃reverse transcriptase temperature and provides higher sensitivity and higher yield to cDNA’s synthesis and PCR. The kit can synthesis up to 10kb cDNA. The reaction buffer is optimized for a kind of reaction system.RT Principle试剂盒组成 (100次使用量)AMV Reverse Transcriptase(5U/μl) 5 x RT BufferdNTP Mixture(10mM)RNase inhibitor(40U/μl)Oligo-dT(18)Random PrimerRNase free H2O52 μl 500 μl 200 μl 52 μl 52 μl 52 μl 1 ml保存-20℃实验操作ProtocolRT反应a、按以下条件配制RT反应液5x R T B u f f e r2μld N T P M i x t u r e(10m M)1μlOligo-dT或 Random Hexamer Primer ** 0.5 μl或特异性下游引物R N a s e i n h i b i t o r(40U/u l)0.5μlA M V R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e0.5μl实验样品R N A*xμlR N a s e f r e e H2O 5.5-xμl总体积10μl注：*实验样品RNA体积根据浓度确定，总量小于等于1ug总RNA；当实验样品RNA的表达数量较少时，可加至5.5ul，同时在反应体系中相应地减少RNase free H2O 的量。