珍珠角壳蛋白中氨基酸的高效液相色谱分析
高效液相色谱及其应用脂类氨基酸肽和蛋白质维生素2003
高效液相色谱及其应用：脂类、氨基酸、肽和蛋白质、维生素脂类样品处理①脂类一般用氯仿-甲醇可获得较好的提取效果.三甘酯也可用石油醚从已均质的样品中萃取出来，再蒸发转溶于四氢呋喃.②脂质提取液的净化:固相萃取小柱分离---碱性氧化铝、硅胶及C18和NH2键合相等③鸡蛋和肉类中胆固醇及植物油或脱臭馏出物中植物甾醇的提取，一般需先将样品用2 mol/L KOH的乙醇溶液于90℃水浴皂化1 h左右，以除去甘油酯和脂肪酸,再用乙醚或乙酸乙酯萃取，然后可再用固相萃取小柱(硅胶)净化(吸附去除其他较强极性杂质)。
甘油酯（TG）1、分离模式及保留特性①甘油酯类分析，分离模式既可正相，也可反相。
②对于TG和极性脂质DG、MG、FFA及固醇酯等不同极性脂类的同时分离或DG的1，3和1，2异构体的分离，一般可选用硅胶或氨基、氰基键合相柱(即正相色谱模式).③脂酸碳氢链长短不同或不饱和度有差异或双键位置异构的三甘酯的分离大多采用“非水反相”色谱法.④反相色谱分析时:饱和TG的链长与保留体积(时间)的对数呈线性正相关；而链长相同的TG: 其双键数与保留体积(时间)的对数呈线性负相关;实验还表明双键减少一个与链长增加两个碳原子对保留时间的影响效果相同。
对于不饱和度有差异的TG分离也可:使用硝酸银硅胶柱（AgNO3浸渍过的硅胶柱），可将含0，1，2…n个双键的不同化合物进行族分离;用此柱，某些TG的甘油分子上的位置异构体也能分开（如SOS和SSO）。
等价碳原子数（ECN)：碳原子数减去二倍的双键数。
例如甘油三油酸酯和甘油三棕榈酸酯，前者多六个碳原子和三个双键，它们具有相同的ECN，据此可以将这两种甘油酯视为临界对（Critical pairs）。
2、检测器选择①分析甘油酯所用的检测器，以示差折光（RI）较普遍，其次是低波长紫外（UV）检测（205-237nm）。
②ELSD用于甘油酯分析的报道渐多。
其优点是可梯度洗脱，流动相所用溶剂也不受UV截止波长的限制，且灵敏度也较高。
5‘淡水养殖珍珠的化学成分与呈色机理研究_杨明月
收稿日期:2004-05-08 作者简介:杨明月(1979—),女,华东理工大学材料学专业硕士研究生。
淡水养殖珍珠的化学成分与呈色机理研究杨明月,郭守国,史凌云,王伟忠(华东理工大学材料科学与工程学院,上海200237)摘 要:将淡水养殖珍珠按颜色分类,通过傅里叶变换红外光谱、等离子发射光谱、拉曼光谱和X 射线粉末衍射等对其进行了有机成分和无机成分的测试研究,发现珍珠的颜色主要受微量金属元素和类胡萝卜素的影响。
关键词:淡水养殖珍珠;颜色;成分中图分类号:P 619.28 文献标识码:A 文章编号:1008-214X (2004)02-0010-04Study on Compositions and Colouring Mechanismof Freshwater Cultured PearlsYAN G Ming -yue,GUO Shou-guo,SHI Ling -yun,W AN G W ei-zhong(College of Material Science and Engineering ,ECUS T ,Shanghai 200237,China )Abstract :The freshw ater cultured pea rls are classified according to the colour and inv estigated by Fo urier transfo rm infra red spectro scopy (FT -IR ),plasma emissio n spectrom etry ,Rama n spectrum and X -ray pow der diffractio n (X RD )to research their o rganic and ino rg anic co mposi-tions.The trace metal elements and caro tenoids hav e influence o n the co lour o f the freshwa ter cultured pearls.Key words :freshw ater cultured pea rl ;colour ;co mpo sition 中国淡水养殖珍珠的颜色包括多种系列和许多过渡性颜色,其中浅色调系列占有较大比重[1]。
柱前衍生高效液相色谱法测定灵芝孢子粉中氨基酸的含量
柱前衍生高效液相色谱法测定灵芝孢子粉中氨基酸的含量殷娇阳1，阎 姝2，田书霞2摘要 目的：建立用于测定灵芝孢子粉中氨基酸含量的柱前衍生化高效液相色谱方法。
方法：采用邻苯二甲醛（OPA）和9-氯甲酸芴甲酯（FMOC）联用对灵芝孢子粉中的氨基酸进行衍生，色谱条件为：Advance Bio AAA（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色谱柱，流动相A为0.01 mol/L磷酸氢二钠和0.01 mol/L硼酸钠溶液，pH值为8.2±0.1，流动相B为甲醇︰乙腈︰水（45︰45︰10）。
流速：0.8 mL/min，柱温：45 ℃，进样量：10 μL，检测波长：338 nm和262 nm。
结果：灵芝孢子粉中检测的17种氨基酸在60 min内分离良好；在一定范围内线性关系良好(r≥0.999，n=6)；加样回收率为95.42%~99.38%，实验方法的精密度、重复性和稳定性的相对标准偏差（RSD）均小于3.0%。
结论：经方法学验证显示，本研究所建立的实验方法适用于灵芝孢子粉中17种氨基酸的含量测定。
关键词：灵芝孢子粉；高效液相色谱法；氨基酸；衍生化中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：1007-6948(2021)02-0182-07doi：10.3969/j.issn.1007-6948.2021.02.004Assay of Amino Acids in Ganoderma Lucidum Spore Powder by Pre-column Derivatization HPLC YIN Jiao-yang, YAN Shu, TIAN Shu-xia School of Pharmacy, Tianjin Medical University, Tianjin (300070), China Abstract: Objective To establish a pre-column derivatization-high performance liquid chromatography method for the determination of amino acids in ganoderma lucidum spore powder. Methods The amino acids in ganoderma lucidum spore powder were derivatized with o-phthalaldehyde (OPA) and 9-fluorenylmethoxycarbonyl chloride(FMOC). The chromatographic conditions were Advance Bio AAA (100 mm×4.6 mm, 2.7μm) column, and Mobile phase A was 0.01 mol/L disodium hydrogen phosphate and 0.01 mol/L sodium borate solution (pH: 8.2±0.1). Mobile phase B was methanol: acetonitrile: water (45:45:10), flow rate was 0.8 mL/min, the column temperature was 45 ℃, the injection volume was 10 μL and the detection wavelength was fixed at 338 nm and 262 nm. Results 17 amino acids in Ganoderma lucidum spore powder were separated satisfactorily in 60 minutes. All the components exhibited good linear correlation in the given concentration range (r≥0.999, n=6). The recovery rate of the sample was between 95.42% and 99.38%. The RSD of the precision, repeatability and stability of the experimental method were all less than 3.0%. Conclusion The methodological verification shows that the established experimental method is suitable for the determination of 17 amino acids in ganoderma spore powder.Key words: Ganoderma lucidum spore powder; HPLC; amino acid; derivatization灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，灵芝药用在我国已有几千年的历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品[1]。
高效液相色谱法测定贝壳类海洋生物中的多胺含量
高效液相色谱法测定贝壳类海洋生物中的多胺含量郑晓菊;许泳吉;刘云云;韩玮【期刊名称】《青岛科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(035)005【摘要】利用柱前衍生高效液相色谱法测定了贝壳类海洋生物(蛤蜊、牡蛎、扇贝)中多胺(主要是指亚精胺(SPD)和精胺(SPM))的含量.采取多种提取试剂(如不同浓度的HC1和H2SO4、甲醇、水提醇沉等)考察了样品中多胺的提取效果,另外,确定了最佳提取时间和温度.结果表明:样品中多胺的最佳提取条件为6 mol·L-1HC1溶液,蛤蜊和牡蛎60℃下提取3h,扇贝提取时间4h为好.提取液用丹磺酰氯衍生,甲苯萃取后高效液相色谱分析.色谱条件:流动相为甲醇和水,采用梯度洗脱,柱温40℃,荧光检测.测定结果:亚精胺(SPD)的回归方程为Y=0.172 9+0.2616 X(R=0.998 8),检出限为0.48 pmol;精胺(SPM)的回归方程Y=0.074 0+0.170 4X(R=0.999 2),检出限为0.54 pmol.【总页数】5页(P446-450)【作者】郑晓菊;许泳吉;刘云云;韩玮【作者单位】青岛科技大学化学与分子工程学院,山东青岛266042;青岛科技大学化学与分子工程学院,山东青岛266042;青岛科技大学化学与分子工程学院,山东青岛266042;青岛科技大学化学与分子工程学院,山东青岛266042【正文语种】中文【中图分类】Q966【相关文献】1.高效液相色谱法测定海洋生物中牛磺酸的含量 [J], 柳小英;毛丽沙;鲍敏洁;周瑾;金火喜2.柱前衍生化-高效液相色谱法测定白念珠菌中多胺的含量 [J], 纪松岗;杨宇;李康;吴海棠;朱臻宇3.高效液相色谱法测定茶鲜叶中游离多胺含量 [J], 吴琴燕;陈露;张文文;马圣洲;赵飞;庄义庆4.OPA-巯基乙醇柱前衍生反相高效液相色谱法测定生物组织中多胺含量 [J], 杜军英;孙秉庸;陈兆珍;解爱东;勾凌燕5.高效液相色谱法测定人参中多胺含量 [J], 仲崇林;金玉莲;王兆华;周海欧;李海日因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高效液相色谱方法及应用
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专属型检测器
它对不同组成的物质响应差别极大，因此只能选 择性的检测某些物质，如紫外检测器、荧光检测 器和电导检测器。
通用型检测器
它对大多数物质的响应相差不大几乎适用于所有 物质，如示差折光化学检测器 。但它的灵敏度低， 受温度影响波动大、使用时有一定局限性。
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紫外吸收检测器
简称紫外检测器（ ultraviolet absorption detector ， UV），是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测 器。 因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外吸 收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的检测 器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。 它不仅有较好的选择性和较高的灵敏度，而且对环境温 度、流动相组成变化和流速波动不太敏感，因此既可用 于等度洗脱，也可用于梯度洗脱。
1、适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应， 可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选 择性；另一方面可以通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非 极性、极性和离子型化合物。 2、由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定 液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创 造了条件。 3、键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和 热稳定性。 4、固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。
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HPLC与GC差别
相同：兼具分离和分析功能 均可以在线检测 不同：
1．分析对象的区别 2．流动相的区别 3．操作条件区别
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HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但 对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测，占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、 难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均 可检测，用途广泛，占有机物的80%
珍珠层粉氨基酸指纹图谱的构建及氨基酸含量测定的研究
珍殊层粉氨基酸指纹图谱的构建 及氨基酸含量测定的研克*
乔艺涵孟雪丹打索亚然I,刘雯雪I,李二文王昭懿打 冯 丹I,柯尊洪2,林瑞超邹迪新3**
(1.北京中医药大学中药学院中药品质评价北京市重点实验室 北京100102； 2.成都康弘制药有限公司成都 610036； 3.中国中医科学院中药研究所北京100700)
doi： 10.11842/wst.2019.07.011 中图分类号:R284.1
文献标识码：A
珍珠层粉为蚌科动物三角帆蚌Hyriopsis cumingii (Lea)、褶纹冠蚌Cristaria plicata(Leach)或珍珠贝科动
珠层粉的确是同质同效的珍珠粉代用品，无论内服外 用,均无任何毒性和副作用,即珍珠层粉供药用具有可
粉指纹图谱进行模式识别研究。结果建立了珍珠层粉氨基酸指纹图谱，以及氨基酸指纹图谱的共有模式，检
测出23个共有峰，并指认出其中15个共有峰相似度分析的结果与聚类分析和主成分分析保持一致，不同产地 的珍珠层粉氨基酸成分差异不大，但不同基源的珍珠层粉氨基酸成分差异明显。本研究测定17个批次珍珠层
粉中17种氨基酸(Asp天门冬氨酸、Glu谷氨酸、Ser丝氨酸、Gly甘氨酸、His组氨酸、Arg精氨酸、Thr苏氨酸、Ala
摘要：目的建立中药珍珠层粉HPLC氨基酸指纹图谱，进行指纹图谱的模式识别研究，并测定珍珠层粉
的氨基酸含量，为珍珠层粉质量评价提供依据；方法 采用Venusil-AA氨基酸分析柱(4.6 mm X 250 mm,5 pjn, 柱号：AA952505-0)，柱温:28七，进样量。10 g,波长：254 nm,流速:0.9 mL• min''，以pH为6.5的醋酸钠水溶液 为流动相A,以80%乙睛水溶液为流动相B。运用SAS和SPSS统计软件进行聚类分析和主成分分析，对珍珠层
柱前衍生化反相高效液相色谱法测定蝉蜕中3种氨基酸含量
０ ． ９ ９ ９ ０ ， 加 样 回收 率 （ ｎ 一６ ） 分 别为 ９ ５ ． ６ ２ 、 １ Ｏ １ ． ２ ６ 和１ ０ ０ ． Ｏ ０ 。结 论 所 建立 的检 测 方法 稳 定 可靠 ， 精
密 度 和 重 复 性 良好 ， 可 用 于蝉 蜕 中天 冬 氨 酸 、 酪氨酸、 缬氨酸 含 量测 定 。
柱 前 衍 生 化 反 相 高效 液 相 色谱 法 测 定 蝉 蜕 中 ３种 氨 基 酸 含 量
张 楠 ， 刘 劲松 ， 王 国凯 ， 郑 娟 ， 刘 松 照
（ 安徽 中医药 大学 药学 院 现代 中药 安徽 省 重点 实验 室 ， 安 徽 合肥 ２ ３ ０ ０ １ ２ ）
［ 摘要 ］ 目的 建 立柱前 衍 生化反 相 高效 液相 色谱 法 测定蝉 蜕 中天 冬氨 酸 、 酪氨 酸和 缬氨 酸 ３种 氨 基 酸含 量
（ ５ ） 、 山东 （ ６ ） ， 均 是野 生 品 ， 由安 徽 中医 药 大 学谢 冬 ｐ ｕ ｓ ｔ ｕ ｌ ａ ｔ ａ Ｆ ａ ｂ ｒ ｉ ｃ ｉ ｕ ｓ的若虫 羽化 时脱 落 的皮 壳 。
２ 方 法 与 结 果
用 ］ ， 可 能与其 所 含 的氨 基 酸 等 成 分有 关 。 目前 对
Ｃ ｒ ｙ ｐ ｔ ｏ ｔ ｙ ｍｐ ａ ｎ ａ ｐ ｕ ｓ ｔ ｕ ｌ ａ ｔ ａ Ｆ ａ ｂ ｒ ｉ ｃ ｉ ｕ ｓ的 若 虫 羽 化 时
有限公司； ＡＬ ２ ０ ５型 十 万 分 之 一 电 子 天 平 、 Ｅ ２ ０ ｐ Ｈ
计： 上海 梅 特 勒一 托 利 多 仪 器 有 限公 司 ； ＫＱ 一 ２ ２ ０ ０型 超 声 波清 洁器 ： 江 苏省 昆 山市超 声仪 器有 限公 司 。
脱 落 的皮 壳 ， 味甘 ， 性寒 ， 归肺 、 肝经 ， 具有 疏 散风 热 、 利 咽等 功能 ， 主治 风热 感 冒 、 咽 痛音 哑等 口 ］ 。全 国大 部 分地 区均 有 ， 主 要 分布 于 安 徽 、 江苏、 河南、 河北、 四川 Ｉ 、 山东等 省 区 ， 以 山 东 产量 最 大 ， 销售 全 国并 出
柱前衍生液相色谱-串联质谱法测定珍珠粉中氨基酸
柱前衍生液相色谱-串联质谱法测定珍珠粉中氨基酸郭华;朱智甲;周晓雅;吴文【期刊名称】《分析科学学报》【年(卷),期】2015(31)6【摘要】以邻苯二甲醛(OPA)为柱前衍生化试剂,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测,建立了测定珍珠粉中氨基酸的新方法。
珍珠粉样品经研磨、拌糊、酸化、水解、蒸干、用乙腈定容等处理,采用Welch Topsil C_(18)色谱柱(150×2.1mm,3μm)进行分离,流动相为10mmol/L HAc-NH_4Ac/乙腈,梯度洗脱。
在正离子模式下采用多重反应模式(MRM)进行监测。
氨基酸在0.1ng/mL^100μg/mL浓度范围内线性良好,相关系数在0.9928~0.9990之间,7种氨基酸的检出限在0.03~15ng/mL之间,加标回收率在95%~105%之间。
该方法灵敏度高、选择性好,适用于珍珠粉中氨基酸的测定。
【总页数】4页(P855-858)【关键词】液相色谱-串联质谱法;柱前衍生;邻苯二甲醛;氨基酸;珍珠粉【作者】郭华;朱智甲;周晓雅;吴文【作者单位】东华大学化学化工与生物工程学院;东华大学生态纺织品教育部重点实验室【正文语种】中文【中图分类】O657.63【相关文献】1.柱前衍生-液相色谱-串联质谱法测定葡萄和樱桃中单氰胺残留 [J], 兰丰;刘传德2.柱前衍生化-超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定人血清中11种雌激素的方法学研究 [J], 杨娜; 王敏; 王月园; 柳航; 朱怀军; 葛卫红3.柱前衍生超高效液相色谱-串联质谱法测定三文鱼中9种生物胺 [J], 罗娇依;郑越男;刘彤彤;郭亚辉;曹进;孙姗姗4.柱前衍生–高效液相色谱–串联质谱法测定塑料产品中两种苯酐化合物 [J], 钟琳;杨文宇;李支薇5.柱前衍生-液相色谱-串联质谱法测定环境水体中草甘膦及其代谢产物的影响因素研究 [J], 董建芳;董会军;李义;赵峰;马天翼;刘雪瑜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高效液相色谱分析法概述
高效液相色谱分析技术及其新的发展与应用余建军(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法（high performanc，liquid chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。
经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。
新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来[1]。
高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：（1）高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。
近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。
（2）高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。
（3）高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC 的最小检测量可达10-9～10-11g（4）高度自动化计算机的应用，使HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。
（5）应用范围广（与气相色谱法相比）HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。
如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。
（6）流动相可选择范围广它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。
（7）馏分容易收集更有利于制备2 色谱法分类高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等[2]。
邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法检测珍珠粉中的氨基酸含量
邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法检测珍珠粉中的氨基酸含量【摘要】目的测定珍珠粉中的氨基酸含量。
方法邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生反相高效液相色谱法，采用荧光检测，梯度洗脱。
结果该法在28 min之内分离出15种氨基酸。
结论该法样品用量少、灵敏度高、线性范围宽、重现性好，适于分离大量样品。
【关键词】高效液相色谱；柱前衍生法；氨基酸；珍珠粉Determination of the Contents of Amino Acids in Pearl Powder by RP-HPLC after Pre��column Derivation with O��Phthaldialdehyde (OPA)Abstract：ObjectiveIn this paper， we determined amino acids in pearl powder. Methods A manual pre-column derivation procedure has been developed by reversed-phase HPLC with O-phthalaldehyde and fluorescence detector. Results More than 15 amino acids were separated within 28 min. Conclusion The method is sensitive， precise and shows good repeatability.Key words：High��performance liquid chromatography；Pre��column derivation； Amino acids； Pearl powder随着生命科学和生物工程的发展，氨基酸作为组成生物大分子的基本单元，其分析方法受到重视。
20世纪70年代以后，反相高效液相色谱技术在氨基酸分析中得到广泛应用，使分离时间缩短。
高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中的酪氨酸和色氨酸含量
８ ５ ） ， 甲醇一 水一 冰醋酸（ ３ ３ ： ６ ６ ： １ ） ， 乙腈一 ０ ． ０ １ ｍ ｏ １ ］ Ｌ磷 酸二 氢钾 （ 三 乙胺调
ｐ Ｈ＝ ６ ． ５ ）（ ５ ５ ： ４ ５ ） ， 甲醇 一 水一 三 乙胺 （ ４ ０ ： ６ ０ ： ０ ． １ ） ， 甲醇 一 水一 冰醋酸 （ ４ ６ ： ４ ３ ： １ ） ，
谱 柱 为 奥 泰 公 司 Ｃｌ ８色 谱 柱 （ ２ ５ ０ ｍ ｍｘ ４ ． ６ ｍｍ， ５ ｍ ） ： 乙腈一 甲醇 一 ２ ０ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ
乙腈一 ０ ． ０ １ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ的磷酸氢 二钠一 磷酸 （ ２ ０ ： ８ ０ ： ０ ． ０ １ ） 不 同比例 的流动相 ， 结果 以乙腈一甲醇一 ２ ０ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ磷酸 二氢钠溶液 （ 磷酸调 ｐ Ｈ ３ ． ５ ￣ ０ ． １ ） （ ５ ： ５ ： ９ ０ ） 为流 动相， 供试品各峰分离效果最好 ， 故选用 乙腈一 甲醇一 ２ ０ ｍｍ ｏ Ｉ ／ Ｌ磷酸二氢钠 溶液 （ 磷酸调 ｐ Ｈ ３ ． ５ ￣ ０ ． １ ） （ ５ ： ５ ： ９ ０ ） 为流 动相。复方氨基酸注射液 中色 氨酸 和 酪 氨 酸 的含 量 为标 示 量 的 ９ ５ ％一１ ０ ５ ％。 ■ 参 考文献 【 １ １ 焦庆才 ， 赵根 海， 刘均忠， 刘茜． Ｌ 一 色氨 酸工业化技术研 究进展Ｉ Ｊ Ｉ ． 发 酵科技通讯， ２ ０ １ ０（ ４ ） ．
３讨 论
分别考察 乙腈一甲醇一 ２ ０ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ磷酸 二氢钠溶液 （ 磷酸调 ｐ Ｈ ３ ． ５ ￣ ０ ． １ ）
（ ５ ： ５ ： ９ Ｏ ） ， 乙腈 一 甲醇 一 ２ ０ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ磷 酸 ： 二 氢钠溶液 （ 磷酸调 ｐ Ｈ ３ ． ５ ￣ ０ ． １ ）（ １ ０ ： ５ ：
高效液相色谱的使用及氨基酸标样的分析PPT课件
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高效液相色谱的使用及氨基酸标样 的分析
一、高效液相色谱的基础知识
二、LC-10AVP液相色谱仪键盘操作
三、氨基酸标样的分析
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一、高效液相色谱的基础知识
高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）以前也称为高压（high pressure）液相色谱法、高速（high speed）液 相色谱法。HPLC是在经典的液相色谱法的基础上， 在20世纪70年代后快速发展起来的一项高效、快
和操作程序。 （2）掌握氨基酸标样的分析方法、原理。
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11
二、实验原理
氨基酸与PITC发生反应生成的衍生物，在 254nm处有最大吸光值。氨基酸衍生物进高 效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保 留时间和峰面积可进行定性和定量。该方法 是柱前衍生法中的一种。PITC方法的反应方 程式如下图所示：
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• 21.01
BCONC
• 25
BCONC
• 25.01
BCONC 80 80 10 STOP
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3、数据采集
打开real-time CS analysis软件采集数据并对数 据进行分析。
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五、注意事项
1、流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其 中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜 过滤)。
静止丌动的一相通常为色谱柱固定反相液相色谱流动相极性大亍固定相极性能溶亍水有机混合物的中性或非离子化合物正相液相色谱流动相极性小亍固定相极性丌溶亍水有机混合液的亲脂样品异构体混合物和制备hplc采用hplc级溶剂四高效液相色谱仪的基本结构高效液相色谱仪由高压输液系统迚样系统分离系统检测系统记录系统等五大部分组成其基本结构如下图
高效液相色谱法测定食物中氨基酸含量 北京液相色谱仪分析案例
食物中氨基酸含量的高效液相色谱法测定一、简介测定食物中氨基酸含量一般采用氨基酸分析仪，柱后衍生测定，但氨基酸分析仪价格昂贵，分析时间长，且只能用于分析氨基酸，限制了氨基酸分析技术的广泛应用。
七十年代以来，柱前衍生高效液相色谱法开始应用于氨基酸的测定。
液相色谱通用性强，检测灵敏度高,可用于多种物质的分析。
南京科捷应用研究所采用柱前衍生紫外检测的方法对几种食物中的16种氨基酸进行了测定。
二、LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪配置LC-10Tvp高压恒流泵：2台SPD-10Tvp紫外检测器：1台SCL-10Tvp 系统控制器：1台7725i手动进样阀： 1套色谱工作站：1套（VI2010、N2000、N3000选用）液相色谱柱：1支（C18 4.6*250mn,5um）微量进样器：1支（50ul/100ul）进样支架：1只（进样阀用）三、LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪特点LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪是南京科捷分析仪器有限公司为了快速地满足多样化的客户需求，在原有的STI501液相色谱仪的基础上经过优化，利用美国先进技术开发设计，国内加工生产的的一款新型的液相色谱仪。
LC-10Tvp等度高效液相色谱仪实现了人机对话，可实时对仪器的运行状态进行监控，并可对潜在和已出现的故障做出判断，同时提供在线解决方案。
该仪器也全面实现了远程的准无人操作，大大提高了仪器的使用效率，同时通过高精度的AS1000自动进样系统，实现自动化进样，最大程度抑制了样品的交叉污染，提供样品分析精度。
LC-10Tvp等度高效液相色谱仪可广泛应用于研究开发、医药检验、食品检测、化工分析、环境监测等众多分析领域。
主要特点丰富的功能——符合客户对分析的不同需求硬件具有VP功能，记录维护信息和操作记录，符合GLP/GMP要求；系统控制器增具有时钟、温度计、湿度计等人性化设计的功能。
卓越的性能——满足客户对仪器的严格要求检测器采用进口氘灯、光电池以及1200条/mm凹面光栅组成的双光束单色器；精密加工的双透镜流通池，控制波长调节的高精度微处理器以及双路高速的采样频率，确保了低噪声、低漂移及超高灵敏度等特点。
珍珠壳角蛋白中色氨酸的三种检测方法
珍珠壳角蛋白中色氨酸的三种检测方法
宋慧春;范雁
【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】1999(020)006
【摘要】目的：探明色氨酸在壳角蛋白中的存在与含量。
方法：实验设计用荧光法、氨基酸自动分析仪和对二甲氨基苯甲醛（ＤＡＢ）化学分析法三种方法定性定量对比分析检测。
结果：三种检测方法的分析结果均显示壳角蛋白内有色氨酸存在，占壳角蛋白的百分含量分别为：荥光法：２．５０％～２．５８％，氨基酸自动分析仪：１．９５％～２．２７％，ＤＡＢ化学分析法：２．５１％～２．６４％。
结论：存在于珍珠及期贝壳内的壳角蛋白的氨基酸组份
【总页数】2页(P307-308)
【作者】宋慧春;范雁
【作者单位】苏州大学生物技术学院生化教研室;苏州大学生物技术学院生化教研
室
【正文语种】中文
【中图分类】R392－33
【相关文献】
1.两种植物蛋白酶对珍珠壳角蛋白降解效果的观察 [J], 宋慧春;范雁;王雪峰
2.三种大鼠实验性肝损伤中细胞角蛋白异常表面及其机理 [J], 苏勤;刘彦仿
3.淡水无核珍珠壳角蛋白的酶解及其色氨酸分析 [J], 宋慧春;项苏留
4.免疫组织化学广谱细胞角蛋白联合三种弹力纤维染色法在肺腺癌胸膜侵犯应用中的比较 [J], 解立武;王晶
5.三种大鼠肝损伤模型中细胞角蛋白异常表达及其机制──免疫组化及免疫电镜研究 [J], 苏勤;刘彦仿;魏正乾
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高效液相色谱法反相梯度洗脱萤光检测分析血浆氨基酸
实验适当增加了邻苯二甲 醛和 － 巯基乙 醇的
用量。用这一衍生试剂分析氨基 酸 标 准 品
本实验考察了反应时间和温度不同 对邻苯二 甲醛氨基酸衍生物萤光强度的影响。反应时
间的影响见表 Ｉ 。 从表中可见，反应时间为 ８ 分钟时与 １
机（ 上海计算技术研究所）。色谱柱为Ｌ－ ｉ
ｃｒｓｒ Ｒ －８等， 微米，２ ０ ． ｈｏｏｂ １ Ｐ ５ ５ ×４ 毫米 ６ （ 内径）。
（ 二）试剂
用方便， 且价格低廉 ３ 。 ， 因此我们摸索应用 ４
高效液相色谱法反相梯度洗脱、邻苯二甲醛 和 － 巯基 乙醇柱前衍生以及萤光检测分析血
柠檬酸三钠、 柠檬酸、 冰醋酸、醋酸钠、
相比之下，Ｒ －８ Ｐ １ 色谱柱的分析效果较 好，故为本实验所用。 将色谱柱恒定于不同温度比较 实 验 结
较〔，除甘氨酸和苏氨酸的洗脱秩序先后不 ７
同外，其他均一致。进一步的实验表明，用
Ｒ －８ Ｐ １ 色谱柱分析时， Ｂ 溶剂缓冲溶液的
表 １ 衍生 化反 应时间 对氨基酸萤光强度的影响
果，我们观察到色谱柱温度从１℃ ８ 升至４℃ ０
氨基酸标准品混合液中的 谷氨酰胺与组氨酸已能分 离；如延长梯度时间至５ ０ 分钟，则血浆样品中的谷 氨酰胺与组氨酸也可良好 分离。因此本实验选择的
流动相流量 为１ 毫升／ 分
钟，梯度时间为４或５分 ０ ０ 钟。在分析不同样品时， 可根据需要选择适当的梯
度时间。 （ 二）流动相
流动相中缓冲溶液的 离子浓度对各氨基酸容量
１７ ９９
３ Ａ Ｊ ｈｍ ｓ Ａ ｉ Ａ ｉ Ａ ａ ｓ ＂ 〕 ． ｏ ａ，＂ ｍｎ ｃ ．Ｔ ｏ ｄ ｎｌ ｉ ． ｙｓ
蚕蛹蛋白氨基酸含量的高效液相色谱法测定
ｆｒ ｏ ｍａ ｅ Ｌｉ ｕ ｄ Ｃｈｒ ｍａ ｏ ｒ ｐｈ ｎｃ ｑ ｉ ｏ ｔｇ ａ ｙ
ＪＮ Ｗｅ— ｉ，Ｚ Ａ ｈ ｎ —ｉｇ ，ＬＵ Ｘ —ｕ ，Ｌ Ｏ Ｚ ｅ —ｕ ，Ｚ Ａ Ｇ Ｌ ｉ，ＷＥ ｉｏＨ Ｉ ０ Ｄ ｎ ｋ ｉ Ｉ ｉ Ｈ ０ Ｚ ｏ ｇｘｎ Ｉ ｕ ｈ ｉ’ Ｕ ｈ ｎ ｙ Ｈ Ｎ ｅ ｗｅ Ｉ ａ —ａ ，ＬＡ ａ —ｕ 。 Ｑ
下，８种氨基酸在 ３ ｉ １ ５ｍ ｎ内获得 了较好的分 离， 一定浓度 范围 内， 在 氨基酸 的峰 面积与浓度 的线性相 关系数在 ０ ９ ０６— ．９
０ ９９８之 间 ， 对 标 准 偏 差 为 ２ ０ ％ ～ ． ５ （ ５ 。并 测 定 了蚕 蛹 蛋 白 中氨 基 酸 的 组 成 和 含 量 。 结 论 该 方 法 准 确 ．９ 相 ．２ ５ ４ ％ ｎ＝ ）
Ｔ ｅ ｍｅ ｈ ｄ ｉ ａ ｃ ｒ ｔ ，ｒ ｌ ｂｅ ａ ｄ ｒ ｐ ａ ａ ｌ ｏ ｅ ｄ ｔｒ ｎ ｔ ｎ ｏ ｍｉ ｏ ａ ｉ ｓｉ ｒｔ ｉｓ ｏ ｉ ｒ ｈ ｔ ｏ ｓ ｃ ｕ ａ ｅ ｅｉ ｌ ｎ ｅ ｅ ｔｂ ｅ ｆ ｒｔ ｅ ｅｍｉａ ｉ ｆａ ｎ ｃｄ ｎ ｐ ｏ ｅｎ ｆｓ ｋ ｗｏｍ． ａ ｈ ｏ ｌ
柱前衍生液相色谱法测定贝类中氨基酸含量
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Vol.27No.12001-02华 东 理 工 大 学 学 报 Journ al of East Chin a University of Science an d T echnology E -mail :fengxw@ecus 收稿日期:1999-12-30作者简介:金凤明(1965-),男,讲师,硕士,研究方向:仪器分析。
(现在江苏石油化工学院工作) 文章编号:1006-3080(2001)01-0103-03珍珠角壳蛋白中氨基酸的高效液相色谱分析金凤明, 冯学伟, 李桂贞*(华东理工大学分析测试中心,上海200237) 摘要:采用国产C 18反相柱,对以异硫氰酸苯酯(PITC )为柱前衍生化试剂的高效液相色谱测定氨基酸的方法进行了研究。
在室温下,以pH =6.3的HAc-NaAc 缓冲溶液及乙腈水溶液为流动相进行梯度洗脱,18种常见氨基酸在30min 内获得了较好的分离,并且测定了珍珠角壳蛋白的氨基酸组成,结果表明:珍珠角壳蛋白主要由天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸等10种氨基酸组成,这些氨基酸约占蛋白总量的85%。
关键词:珍珠;蛋白质;氨基酸;异硫氰酸苯酯;反相高效液相色谱中图分类号:O657.7文献标识码:ADetermination of Amino Acids in Protein of Pearlsby Reversed -phase High Performance Liquid ChromatographyJ I N F eng -ming , F EN G Xue -wei , LI Gui -zhen *(Analysis and Research Center ECUST ,Sha nghai 200237,China )Abstr act :By use of octadecyl (C 18)column made in China ,a RP -HPLC method was studied using phenylisothiocyanate (PIT C)as the pre-column der ivatizing reagent for the determination of amino acids.Under room temperature,pH6.3HAc-NaAc buffers,acetonitrile-water solutions as the mobile phase and the use of the gr adient elution mode ,fine r esolution of phenylthiocar bamyl derivatives of 18kinds of com-mon amino acids was achieved after about 30minutes and the content of amino acids (except T rp)in the hydr olysate of protein of pearl was determined.T he results showed that the proteins in pearls mainly con-sist of 10kinds of amino acids such as Asp ,Glu ,Ser ,Gly ,Ala ,Leu and so on which account for about 85percent of total amount of protein .Key wor ds :pearls;pr otein;amino acids;phenylisothiocyanate;r everse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) 珍珠作为药用在我国已有一千多年的历史[1],对珍珠化学组成尤其是珍珠中角壳蛋白的氨基酸组成的研究,对于珍珠有效成分的探讨及珍珠资源的开发和利用具有重要意义,近年来,国内已有一些学者对其作了研究[2～3],但他们采用了氨基酸自动分析仪或专用的氨基酸分析柱,因而费用较高。
本文在前人工作[4～6]的基础上,采用国产C 18反相柱,以异硫氰酸苯酯(PITC)为柱前衍生化试剂,在普通高效液相色谱仪上获得了18种常见氨基酸的较好分离,并且对珍珠角壳蛋白中的氨基酸组成进行了测定。
1 实验部分1.1 仪器、材料和试剂Shimadzu LC-6A 高效液相色谱仪,包括SPD-6A 紫外检测器、C-R3A 色谱数据处理机、SCL-6A103梯度控制器;色谱柱:20cm×5mm,YWG-C18H37, 10L m;真空泵:浙江黄岩医疗器件厂,ZXZ-1型;超声波清洗器:上海超声波仪器厂,CSF-1型;18种常见氨基酸对照品,BR;异硫氰酸苯酯,CP;乙腈,色谱纯;无水醋酸钠、三乙胺,AR;二次蒸馏水,自制;淡水珍珠,浙江诸暨珠力神营养品厂。
1.2 试剂配制流动相A液:无水醋酸钠5.7g加三乙胺0.4mL,以蒸馏水溶解并稀释至1000mL,用稀醋酸调节至pH6.3,滤膜过滤。
取滤液960mL,加乙腈40mL,摇匀,超声处理20min,备用。
流动相B液:取乙腈600mL,加蒸馏水至1000mL,摇匀,超声处理20min,备用。
再干燥液:乙醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1(V/ V)。
衍生剂溶液:异硫氰酸苯酯∶乙醇∶三乙胺∶水=1∶7∶1∶1(V/V)。
样品稀释液:取354mg Na2HPO4・12H2O加200mL蒸馏水溶解,用磷酸(U=0.1)-乙腈(95/5)溶液调至pH7.4,备用。
氨基酸标准储备液:准确称取氨基酸对照品各10mg于25mL容量瓶中,加0.1mol・L-1HCl超声溶解并稀释至刻度,摇匀。
1.3 实验方法1.3.1 角壳蛋白的提取 取适量洁净珍珠,用过量稀盐酸溶液室温浸泡至其中碳酸钙全部溶解为止,过滤并用蒸馏水洗涤。
将提取的角壳蛋白低温烘干,研磨,备用。
1.3.2 水解 称取适量角壳蛋白粉样品于安瓿瓶中,加数毫升6mol・L-1H Cl及2～3滴苯酚,封口,于105℃下水解24h,开管,将水解液移入容量瓶,用氢氧化钠溶液中和并加蒸馏水稀至刻度,摇匀,即得蛋白水解液。
1.3.3 衍生 取10L L氨基酸标准储备液和蛋白水解液分别置于0.5L L塑料小管中,真空干燥:加10L L再干燥液,真空干燥;加20L L PITC衍生剂溶液,超声处理后放置20min,再真空干燥。
将干燥后的衍生物储存于0～10℃冰箱中,备用。
1.3.4 色谱分离和定量 取经衍生并干燥后的样品,加100L L样品稀释液,超声溶解,离心分离,吸取适量上清液,在优化的色谱分离条件下进样,于250nm处紫外检测,并用峰面积外标法定量。
2 结果与讨论2.1 色谱条件的优化利用本法进行氨基酸分析的最大困难是组氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸和脯氨酸的相互分离,为保持流动相的一致性,本文主要通过提高柱温同时辅以流动相的梯度和流速的调整,来改善氨基酸的分离效果,经反复试验,当柱温为50℃及采用如表1所示的流动相梯度和流速控制程序时,18种氨基酸获得了较好的分离(见图1)。
表1 流动相梯度洗脱程序Table1 Pr ogr am for gr adient elut ion of flow phaset/min v/(mL・min-1)U A U B0 1.0103 1.01020 1.00.752521 1.50.712930 1.50.544631 1.5010035 1.5010036 1.51040 1.010图1 氨基酸混合标样色谱图F ig.1 Chr omat ogram of amino a cids in stan-dar d sample1-Asp;2-Glu;3-Ser;4-Gly;5-His;6-T hr;7-Ala;8-Arg;9-Pr o;10-Tyr;11-Val;12-M et;13-Cys;14-Ile;15-Leu;16-P he;17-Tr p;18-Lys2.2 重现性试验在相同实验条件下,取同一浓度的氨基酸混合标样进行连续5次平行测定,考察各峰面积的重现性,结果如表2所示,表明该方法的重现性较好。
2.3 准确度试验在相同实验条件下,对同一氨基酸混合标样分别取不同进样量进样分析,考察峰面积定量的准确性,图2给出了4种氨基酸的进样量与峰面积的关系,表明进样量在15L L范围内与峰面积成良好的线性关系。
104 华 东 理 工 大 学 学 报第27卷表2 峰面积定量重现性(n =5)Ta ble 2 R epeat ability of quantit ation of peak a rea (n =5)No.Amino acid Coefficient of var iation (%)No.Amino acid Coefficient of variation (%)1Asp 1.1410Tyr 0.942Glu 1.2011Val 0.303Ser 1.5112M et 0.254Gly 0.9213Cys 0.295His 0.4314Ile 0.566T hr 1.1615Leu 0.877Ala 0.6716Phe 0.408Arg 1.3817Trp 1.319Pro1.4118Lys1.20图2 进样量与峰面积的关系F ig .2 Linear r egr ession cur ve of peak a rea onsample quantity of injection▲-Cys ,C =0.9981,○-Tyr ,C =0.9993◆-Asp ,C =0.9989;×-Lys,C =0.99792.4 样品测定在与氨基酸混合标样相同的实验条件下,进行珍珠角蛋白盐酸水解液的样品分析,图3和表3给出了氨基酸(除色氨酸外)含量的测定结果,表明构成珍珠角蛋白的氨基酸品种齐全,但主要是天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸等10种,这些氨基酸约占蛋白总量的85%。
图3 珍珠角壳蛋白样品氨基酸色谱图F ig .3 Chr omatogr am of amino acids in pro-tein of pearls表3 珍珠角壳蛋白氨基酸含量Table 3 T he cont ent of amino acid in pr otein of pearlsNo.Amino acid Content (%)No.Am ino acid Conten t (%)1As p 10.310T yr 3.92Glu 4.411Val 2.43Ser 7.912Met 1.34Gly 16.613Cys 1.95His 0.514Ile 2.06Th r 1.915Leu 7.37Ala 18.716Phe 6.68Arg 6.117T rp /**9Pro3.318Lys4.9*Ess ential am ino acid ;**T rp was completely decomposed in process of h ydrolysis in HCl.3 结 论(1)18种常见氨基酸经异硫氰酸苯酯柱前衍生后,在国产C18反相柱及普通高效液相色谱仪上可获得较好的分离,不一定需要专门的氨基酸分析柱及其分析仪器系统。