耐铅微生物筛选及其铅去除能力的初步研究_杨亮

取 土 样 0.1 g 溶 于 100 mL 培 养 液 中 , 在 HZQ-F100 振荡培养箱中(160 r/min, 25℃)恒温培养 48 小时, 用移液枪取 1 mL 培养液转接到 Pb2+浓度 为 100 mg/L 的液体培养基(100 mL)中, 继续培养 48 小时, 重复以上操作 5 次。
北京大学学报(自然科学版), 第 48 卷, 第 6 期 , 2012 年 11 月 Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 48, No. 6 (Nov. 2012)
耐铅微生物筛选及其铅去除能力的初步研究
杨亮 郝瑞霞† 吴沣 肖育雄
将上述菌液分别取适量稀释一定的倍数, 取 0.1 mL 稀释液滴加在固体平板(含铅量为 100 mg/L) 中央, 立即用无菌玻璃刮刀涂抹均匀。接种后移入 恒温培养箱中倒置, 25℃恒温培养 48 小时, 直到培 养基表面观察到菌落。根据菌落形态不同, 挑取单 菌落, 移种转接到液体培养基中, 160 r/min, 25℃恒 温培养 48 小时。反复进行上述操作, 同时用显微镜 检查, 直至获得纯菌株(以上操作均在严格无菌条 件下进行)。 1.2.3 生长曲线的测定
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第6期
杨亮等: 耐铅微生物筛选及其铅去除能力的初步研究
分别取加铅与不加铅的培养液中生长的菌株 Pb-X-2, 按照微生物电镜制样方法进行制样, 切片, 使用日本 JEM-1400 高衬度透射电镜对样品进行 观察。
2 结果与讨论
2.1 土壤重金属 Pb 全量测定
土壤样品全铅含量的测定表明, 1 号土壤样的 铅浓度为 200 mg/L, 2 号土壤样的铅浓度为 2500 mg/L, 3 号土壤样的铅浓度为 4500 mg/L, 无污染的 对照土壤样的铅浓度为 50 mg/L, 而《土壤环境质量 分类》中 3 级标准为 500 mg/L。由此可知, 调查的 样点中 2 号与 3 号样品都受到不同程度的铅污染, 其中 3 号土壤样品的位置距离污染中心最近, 表现 为重污染。
去除率按照下列公式计算: P=[C0 (Pb2+)-C(Pb2+)]/ C0 (Pb2+)×100%, P 为去除率, C0 (Pb2+)为原培养液中 Pb2+的质量浓度 (mg/L), C (Pb2+)为菌体生长后培养液中 Pb2+的质量 浓度(mg/L)。 1.2.6 菌体切片的观察 分别取一定量的菌株 Pb-X-2 和消除铅离子的 菌株 Pb-X-2, 使用醋酸双氧铀对菌体样品进行负 染, 使用日本 JEM-1400 高衬度透射电镜对样品进 行观察。
铅是对人类有毒的重金属元素之一, 在数千年 的人类文明进程中发挥积极作用的同时, 也带来了 严重的负面效应。近年来, 工业“三废”、机动车辆 使用含铅抗震剂汽油、污水灌溉以及农药和化肥的 使用, 使得铅对环境的污染不断加剧和蔓延, 造成 了植物、动物、微生物的铅毒害, 并引起人类食物 链中铅的含量不断提高。
取适量培养液, 4000 r/min 离心 5 min, 取适量 上清液, 使用硝酸及过氧化氢消解, 其含铅量使用 日本日立 5000 原子分光光度计测定, 具体方法为空 气–乙炔火焰法。每测 10 个样后, 就用 1000 mg/L 的硝酸铅标准液矫正仪器。以不加菌体组作为对照 组, 每组样品重复 3 次, 若测得的样品数据重复性 不好, 则重新测试。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验试剂 液体培养基: NaCl 0.5 g, NaNO3 0.5 g, MgCl2
0.01 g, NH4Cl 0.1 g, 牛肉浸膏 1.0 g, 胰蛋白胨 3.0 g, 酵母浸粉 3.0 g, 葡萄糖 3.0 g, 蒸馏水 1 L, pH 调节至 6。
固体培养基中加入琼脂 15 g/L。 硝酸铅(配制 2000 mg/L 的铅标准溶液待用)、 盐酸、硝酸、氢氟酸、高氯酸, 均为分析纯。 1.1.2 土壤样品 含铅的土样取自河北省涞源县乌龙沟镇铅锌矿 尾矿堆。
国家重点基础研究发展计划(2007CB815601)资助 收稿日期: 2011-12-09; 修回日期: 2012-05-09; 网络出版日期: 2012-10-25 网络出版地址: /kcms/detail/11.2442.N.20121025.0952.002.html
使用 720 型紫外分光光度计于 600 nm 波长处测 定培养液吸光度, 以 OD600 表示菌的生物量。 1.2.4 构建系统发育树
依据细菌 16S rRNA 中最保守的序列, 使用引 物 8F-1492R 进行 PCR 扩增。PCR 体系为 50 μL, 即: 灭菌超纯 ddH2O 37 μL, 缓冲剂 5 μL, dNTP 4 μL, 引物 primer (8F-1492R)1 μL, rTap 1 μL, DNA 1 μL。 PCR 运行程序为: 95℃预变性 5 min; 94℃变性 1 min, 50℃ 退火 45 s, 72℃延伸 1min 30 s , 29 个循 环; 4℃保存(时间最好不超过 12 小时)。进行 PCR 扩增后, 委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进 行 16S rRNA 测定。将所得序列与 NCBI 数据库中 已有的 16S rRNA 序列进行 BLAST 分析, 分析其同 源性, 利用 Clustal 进行对比, 通过 MEGA 4.1 软件 生成系统发育树, 并申请 GenBank 数据库接收号。 1.2.5 4 株耐铅菌对铅的去除率
北京大学地球与空间科学学院造山带与地壳演化重点实验室, 北京 100871; † 通信作者, E-mail: rxhao@
摘要 从铅锌尾矿厂周围土壤样品中分离出 4 株耐铅菌。4 株耐铅菌均能在 Pb2+浓度范围为 100~1000 mg/L 的培养液中生长。在 pH 6, 25℃, 160 r/min 及初始 Pb2+浓度为 600 mg/L 时, 菌株 Pb-X-1, Pb-Z-3 和 Pb-Z-4 的 Pb2+去除率分别为 78.31%, 77.8%和 87%。菌株 Pb-X-2 在初始 Pb2+浓度为 100~400 mg/L 时, 去除率均高于 95%。16S rRDA 基因序列分析表明, Pb-X-2 属于嗜麦芽寡养单胞菌。菌株 Pb-X-2 对溶液中铅离子的去除机 理为细胞表面吸附与胞内富集。 关键词 铅; 去除; 嗜麦芽寡养单胞菌 中图分类号 X172
1.2 实验方法
1.2.1 土壤重金属 Pb 全量测定 称取过 100 目筛土样 0.1 g 放于坩埚中, 加入 5
mL HNO3, 10 mL HF, 12 mL HClO4, 低温加热至白 烟冒尽。冷却后, 加入 10 mL HCl, 低温溶解后, 移入 50 mL 容量瓶中。使用日本日立 5000 原子分 光光度计测定铅含量。 1.2.2 微生物分离和纯化
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北京大学学报(自然科学版)
第 48 卷
重金属选择培养基, 从中筛选出对土壤重金属具有 专性高效富集作用的菌株, 并进行分类鉴定, 是微 生物修复技术应用的前提。
随着环境微生物学的发展, 人们发现一些微生 物如 Norcardia amarae[1]、芽孢杆菌[2]、浮游球衣 菌[3]、拉微球菌[4]、镰刀霉菌属[4]、曲霉[5]、短小芽 孢杆菌[6]、啤酒酵母菌[7]、Enterobacter sp. J1[8]、 Phanerochaete chrysosporium[9]、根霉[10]、青霉[11]、 肺 炎 克 雷 伯 氏 菌 [12] 等 均 能 吸 附 去 除 废 水 中 的 铅 离 子, 但对铅离子的耐受能力不太高, 大部分小于 400 mg/L, 而且在初始铅离子浓度相对较高时, 对 铅离子的去除率却较低。本研究从分离和筛选高耐 受铅微生物的研究角度出发, 从铅矿厂周围的土壤 中分离得到两株真菌和两株细菌, 对其生物学特性 进行了初步研究, 同时对铅的去除能力和机制也进 行了研究和探讨。
菌落为圆形, 表面光滑, 边缘整齐, 易于挑起, 黏 稠。菌株 Pb-Z-3 菌落颜色为灰色, 表面为毡状, 无 固定形态, 比较粗糙, 用接种针不易挑起。菌株 Pb-Z-4 菌落颜色为绿色, 表面为粉粒状, 无固定形 态, 比较粗糙, 用接种针不易挑起。对 4 种菌株分 别进行了生理生化实验, 结果如表 1 所示。
2.2 菌株的基本特征
经过富集和分离, 从所采土样中筛选出 4 株耐 铅微生物, 其中有两株是细菌, 编号分别为 Pb-X-1 和 Pb-X-2; 两 株 是 真 菌 , 编 号 分 别 为 Pb-Z-3 和 Pb-Z-4。菌株 Pb-X-1 菌落颜色为白色, 菌ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ表面粗 糙不透明, 易于挑起, 黏稠, 菌落直径为 1~5 mm, 在液体培养基中生长时, 形成皱醭。菌株 Pb-X-2 菌 落颜色为淡黄色, 菌落直径小于 5 mm, 中央突起,
Abstract Four lead-tolerant strains were isolated from lead-contaminated soil around the lead-zinc ore deposit. All strains could grow in nutrient solution containing 100–1000 mg/L Pb(II). The removal rates of Pb(II) by Pb-X-1, Pb-Z-3 and Pb-Z-4 were 78.31%, 77.8% and 87% respectively in the following conditions: pH was 6, 25℃, 160 r/min, initial Pb2+concentration was 600 mg/L. The Pb(II) removal rate by Pb-X-2 was higher than 95%, when initial Pb(II)concentration was 100–400 mg/L. The result of 16S rRNA sequencing indicates that Pb-X-2 belonged to Stenotrophomonas maltophilia. The removal mechanism of Pb(II) removal by Pb-X-2 was mainly cellular surface adsorption and intracellular enrichment. Key words lead; remove; Stenotrophomonas maltophilia