WesternBlot结果条带分析
westernblot详细图案解析
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表
达的蛋白成分。该技术也广泛应用
于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品
试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒
仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒
实验步骤一、试剂准备
1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
Western blot结果异常原因分析及对策(个人总结)
⑴尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动 ⑵过滤封闭剂 ⑶戴手套，小心谨慎操作 ⑷保持膜湿润 ⑸采用铅笔或 Odyssey 笔 ⑴使用 100% methanol 浸透膜 ⑵选择小孔径的膜，缩短转移时间 ⑶使用其他缓冲液如CAPS 缓冲液（pH 10.5)或低pH 值缓冲液如乙酸缓冲液 ⑷降低甲醇浓度或用乙醇或异丙醇 ⑸厚胶及高分子蛋白需延长转移时间
或分级提取目的蛋白。
⑹转膜不充分,或洗膜过度
⑹使用丽春红 S 检测转膜效果,PVDF
膜需浸透,需正确操作,勿过度洗膜。
⑺过度封闭
⑺使用含 0.5%脱脂奶或无脱脂奶抗体
稀释液,或更换封闭剂,减少封闭时间。
⑻一抗失效
⑻使用有效期内抗体,分装保存,避免反
复冻融取用, 工作液现配现用
⑼二抗受叠氮钠抑制
⑼溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP
⑷SDS-PAGE 电泳上样 前， 煮沸 10
min，以增强蛋白质解聚变性
⑸蛋白样本降解
⑸新鲜制备标本，使用蛋白酶抑制剂
3. 背 景 非 特 异 染 ⑴封闭不充分
⑴延长封闭时间，更换合适的封闭剂
色过强
（脱脂奶粉，BSA，血清等）
⑵一抗浓度过高
⑵增加一抗稀释倍数
⑶抗体孵育温度过高
⑶4℃孵育
⑷二抗非特异Fra Baidu bibliotek结合或与封闭剂交叉反应
漂亮的westernblot条带，为什么都是别人家的？
漂亮的westernblot条带，为什么都是别人家的？
又到一年开学季，高校各大实验室又涌进来一波波的小哥哥，小姐姐。对于初来乍到的小鲜肉来说，除了练好插枪头的基本功外，其次就是跑好westernblot了。平时在实验室中，经常会听到一些小师弟小师妹在抱怨：“为什么好看的westernblot条带都是别人家的，而我的条带跑得跟shi一样”？今天小编就带大家一起来探讨跑好wb 的几条秘籍。
1. 选择好的抗体
众所周知，wb的基本原理就是利用抗体与抗原的特异性结合，来检测特定蛋白的表达。所以，首先要选好的抗体。选抗体尽可能找一些靠谱的大品牌公司的抗体(如abcam,CST,Sigma)。
下面我们介绍一个网站——Citeab来说明下抗体的选择。
网址：/
打开以后我们可以输入要检索的基因名字，比如foxo3a：
我们可以在左侧选择一抗/二抗、单抗/多抗、物种、应用技术、修饰、厂家等，比如我们选择WB:
在文章右侧就会出现对应的信息：在每个产品右侧会有citations 的数量，比如第二个:
我们可以直接单击View PDF查看使用这个抗体发表的文章：
2. 制备合格的样品
制备合格的的样品，是成功的一半。裂解液的选择也是关键（裂解液的选择参考下表）。如果要提取做IP,coIP的蛋白样品的话，则需要选取不含SDS的裂解液。在抽提蛋白时，要在裂解液中添加蛋白酶抑制剂，如果检测的磷酸化蛋白，则要在裂解液中添加磷酸化酶抑制剂，并且要在冰上操作，避免蛋白降解。为了充分裂解样品，也可以选用超声处理细胞或组织样品，超声能充分破碎细胞膜和剪切DNA。但如果提取用于做IP的样品，则不建议用超声处理样品。
wb转膜时间过长条带的变化
wb转膜时间过长条带的变化
WB（Western blotting，蛋白质印迹法）转膜时间过长可能会导
致条带出现一些变化，具体变化可能因实验条件和蛋白质的性质而异，但通常会出现以下情况：
1. 条带变弱或消失：转膜时间过长可能导致蛋白质从凝胶中迁移
到膜上的效率降低，从而使条带的强度变弱或完全消失。
2. 条带扩散：如果转膜时间过长，蛋白质可能会在膜上扩散，导
致条带变宽，清晰度降低。
3. 背景增加：转膜时间过长可能会增加非特异性结合，导致背景
噪音增加，使目标条带的识别变得困难。
为了获得最佳的结果，转膜时间通常需要根据实验条件和蛋白质
的特性进行优化。一般来说，转膜时间应该在适当的范围内，以确保
蛋白质有效地转移到膜上，同时尽量减少条带的扩散和背景噪音。
如果你发现转膜时间过长导致条带异常，可以尝试缩短转膜时间、优化转膜缓冲液的成分、调整蛋白上样量等方法来改善结果。同时，也要确保其他实验步骤的准确性，如凝胶电泳、抗体孵育等，以获得可靠的 Western blotting 结果。
WB问题分析
WesternBlot问题解答
1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。
2.条带歪斜、或漂移:因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。
3.单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。
4、转膜缓冲液过热：缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高,转膜过程中注意降温。在冰水混合物中转膜，效果很好。
5背景过高:
1）封闭不全， 5%脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。 2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，
或更换封闭液种类可能解决 3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。 4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。 5)曝光时间的控制:通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。
western显影问题及解决方案
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。
内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
Western Blot 结果条带全面分析
Western Blot 结果条带全面分析
Q1. 啥也没有
[原因]：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
[解决办法]：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
[经验]：上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
Q2. 高背景
[原因]：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够
[解决办法]：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
[经验]：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。
Q3. 非特异性条带
[原因]：一抗非特异性与蛋白结合
[解决办法]：更换一抗
[经验]：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。
Q4. 条带中出现边缘规则的白圈
[原因]：电转中膜和胶之间存在气泡。
[解决办法]：转膜前去掉膜和胶之间的气泡
[经验]：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。
(最新整理)westernblot详解
检 测 样 品 蛋 白 含 量 ： 取 一 管 考 马 斯 亮 蓝 +95 l
0.15mol/L NaCl NaCl溶液+5l待测蛋白样品，混
匀后静置2min，倒入比色杯中测试。
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2.BCA法简介
实验试剂: BCA试剂，标准蛋白质溶液
试验方法: 根据吸光值可以推算出蛋白浓度。
4X上样缓冲液 1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2ml
SDS 溴酚蓝 甘油
0.8g 0.04g 4ml
去离子水定容至10ml。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。使用
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时稀释成1X。
3·1·4 上样
上样 (注意：最外两泳道易跑歪，尽量不用。) Marker 6μl （Marker加在最边上的加样孔中） 样本 20-30μl 实验所用Marker电泳后出现10条带：10，15，25，35， 40，55，70，100，130，170KDa
实验操作: 绘制标准曲线
原理：BCA(bicinFra Baidu bibliotekhonininc acid二辛可宁酸)与二价铜
离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成
为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋
白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合
ImageJ Western 量化 拿走不谢
ImageJ实用技巧之Western blot量化
原创2016-05-26 李莫愁博士实验万事屋
ImageJ对医学生来讲最常用的功能是WesternBlot量化和细胞计数，又以前者最常见。不是所有的WB都需要量化，看审稿人的要求，好了，今天内容比较枯燥，我们一步一步来学习image J量化Western blot的条带吧！
首先下载安装Image J,温馨提示软件在网上有下载。
安装完image J，打开一张要量化的图片如下图：
点击选择方形选框工具，按住左键，在图片上拖动，选择需要分析的条带区域，如图中黄色方框所示。
依次选择，如下图，Select First Lane选项后会出现以上对话框，直接点击Yes 即可：
当选区出现1表示选择成功：
然后选择，Analyze→Gels→Plot Lanes，就会弹出山峰样的图。
峰的面积即灰度值，但是这几个峰连在了一起要先把他们分开，点击直线工具，画直线。
点击选择魔棒工具，然后分别点击每个峰的下方区域，然后就会弹出各个峰面积的结果，分别与六个条带的灰度值相对应，表示六个条带所代表的目的蛋白的表达水平。
使用同样的方法也可以对beta-actin进行量化，最后通过标准化计算得到该Western Blot的量化结果，至于如何将量化结果变成审稿人要求的柱状图，就留给你们自己思考。
207例hiv抗体不确定标本的结果分析
㊃短篇论著㊃
207例H I V抗体不确定标本的结果分析*
刘建礼,肖利力,张绍福,焦艳丽
(海关总署(北京)国际旅行卫生保健中心,北京100013)
摘要:目的分析人类免疫缺陷病毒(H I V)抗体免疫印迹试验(W e s t e r n b l o t)检测为不确定标本的结果特征,探究不确定结果的影响因素㊂方法对W e s t e r n b l o t试验检出的207例H I V抗体不确定标本从人群特征㊁条带阳性率㊁带型分布及随访复检结果进行分析㊂结果1295例初筛阳性标本W e s t e r n b l o t结果总不确定率占15.9%,女性(20.5%)不确定率高于男性(13.9%),60岁以上不确定率(26.0%)明显高于其他年龄㊂p24条带阳性率最高,其中单独p24带型为151例,占73.0%㊂31例标本随访复检结果均为转阴或无进展㊂结论 H I V W e s t e r n b l o t不确定结果与性别和年龄有一定关系,与p24蛋白的非特异性反应是造成不确定结果的主要因素之一㊂
关键词:人类免疫缺陷病毒;结果不确定;蛋白质印迹法
D O I:10.3969/j.i s s n.1673-4130.2020.10.023中图法分类号:R446.6
文章编号:1673-4130(2020)10-1245-03文献标识码:B
人类免疫缺陷病毒(H I V)是引起艾滋病的病原体㊂H I V感染者的早期发现是有效预防H I V传播的首要环节,血清H I V抗体检测是目前诊断H I V感染的重要手段㊂H I V抗体检测包括筛查试验和确证试验[1]㊂目前使用最广泛的确证试验是免疫印迹试验(W e s t e r n b l o t)㊂W e s t e r n b l o t试验的结果分为H I V-1抗体阳性,H I V抗体阴性和H I V抗体不确定,对于W e s t e r n b l o t试验不确定结果,一般建议2~4周后复查或进行病毒核酸检测㊂这无疑增加了实验室诊断的困难,同时给患者带来极大困扰㊂本研究对实验室近期出现H I V抗体W e s t e r n b l o t试验不确定标本进行分析,探讨其影响因素㊂
WesternBlot蛋白免疫印迹原理及常见问题（FAQ）
WesternBlot蛋白免疫印迹原理及常见问题（FAQ）
1. Western blot结果中的背景为什么较高?
可能的原因及建议
1.膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
2.一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
3.一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。
4.膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
5.检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
2. Western blot结果中杂带较多
可能的原因及建议
1.目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
2.查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
3.目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。
4.样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
5.上样量过高，太敏感——适当减少上样量。
6.一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。
7.一抗不纯——纯化抗体
8.一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。
3. Western blot结果中无信号或显示信号弱
可能的原因及建议
1.检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
2.检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
3.转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
4.抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
(最新整理)westernblot详解
根据分子量的大小确定电压和时间，marker 跑开后变压，
一般溴酚蓝离胶下１ cm停止电泳进行转膜（一般要让目
的条带跑过分离胶的1/3比较好）
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蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
来完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光
化学催化（核黄素——TMTED）体系。
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8
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一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（PH=8.8 ）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度） ，SDS（ 常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。
冰箱过夜
待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草
纸铺于保鲜膜上。用ddH2O浸湿草纸。取玻璃板放
Westernblot经验大盘点，有这一篇就够了
Westernblot经验大盘点，有这一篇就够了
作者：解螺旋.子非鱼
转载需授权注来源：解螺旋，医生科研助手
Western blot(蛋白印迹)作为科研研究中最为平常的实验，却蕴含了很多知识，可谓是小实验里却有大文章。尽管绝大多数研究僧在接触该实验时都会被虐的体无完肤，却也在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少经验。正所谓前人种树，后人乘凉，现在小鱼就把各位前辈做WB的各种经验总结起来，希望对大家能有所帮助。
WB的基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。依其原理，可分为两种方法：A、直接法和B、间接法。
两种的方法的优缺点比较：
WB的一般流程：
1
蛋白的提取
好的蛋白是WB成功的一半
经验总结：
1：合适的盐浓度下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
2：尽量除去核酸，多糖，脂类等干扰分子
3：提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）。
4：蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存，不要反复冻融。
5：蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。
2
电泳
凝胶浓度与蛋白分离范围
经验总结：
1：上样时：根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量，尽量保证每孔上样量保持一致。
2：胶最好现配现用，如果需要保存，最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。
3：为了检测整个实验系统或校准实验结果，需要设置内参（一般指由管家基因编码表达的蛋白）。
蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答
蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答
蛋白质电泳与western blot1
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。
（1）原理
（2）分类
①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色
（3）主要试剂
（4）主要程序
（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题9. 条件的摸索10. 方法的介绍11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（2）分类
①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色
western-blot条带分析及解决方法.
*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。
Image J和Graphpad如何对Western Blot条带灰度分析
Image J和Graphpad如何对Western Blot条带灰度分析
WB是研究蛋白表达的一个经典方法。对于一些时间点或者是不同组织蛋白表达量的分析就涉及到量的变化。一些凝胶成像软件带有此分析工具，比如Quantity One，Bandscan，Gel-Pro Analyzer等成像系统专用软件。除了这些软件，还有一个比较简单的综合性质图像处理软件Image J可以很方便的进行灰度分析。而且Image J是开源性质的免费软件，可以在其官网直接下载使用。
对Western Blot条带进行数值化有两种方法——灰度分析和光密度分析。灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为256个级别。灰度值越小物体颜色越深。光密度是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度IO与该光线通过溶液或物质后的透射光强度Ib比值的对数OD=log（IO/Ib）；图像分析中，入射光和透射光强度分别被切片上最亮区域的平均灰度值和待测目标平均灰度值取代，则图像分析系统的光密度值=log（切片标本最亮区域的平均灰度值（g0）/待测目标的平均灰度值（g））。光密度值越大，物体颜色越深，阳性物质相对含量越大。
对于灰度值来说，切片标本制作时染色时间长短，以及测量时显微镜照明光源电压的大小对其影响很大。而光密度是一个比值。是通过计算一张切片标本最亮区域的平均灰度值与该切片标本中待测目标的平均灰度值的比值，再根据数学公式计算而来的，所以受切片标本染色时间长短及照明光源电压关系很小。
然而有研究实践显示，灰度值与光密度值二者之间存在着线性关系，都可以用来进行WB定量分析。
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W e s t e r n B l o t结果条带
分析
Revised final draft November 26, 2020
W e s t e r n B l o t结果条带全面分析
1.空白
原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，显色液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
2.高背景
原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够。
解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
3.非特异性条带
原因：一抗非特异性与蛋白结合
解决办法：更换一抗
4.条带中出现边缘规则的白圈
原因：电转中膜和胶之间存在气泡。
解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡
5.出现黑点和黑斑
原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合
解决办法：封闭结束之后要洗。
6.条带拖尾
原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长
解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。
7.出现非均一性背景
原因：膜可能曾经干过
解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干。
8.某个条带变形
原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒
解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。
9.条带呈哑铃状
原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一
解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用
10.最边缘条带弯曲
原因：电泳电流不均一
解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔
其他问题
（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。
（2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。
（3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。
（4）整个条带呈“︶”状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。
（5）整个条带呈“︵”：凝胶左右两头没有凝固好
（6）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。
（7）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒
（8）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。
（9）在分离胶中跑不动：Tris-HClPH值不对，或者忘记加SDS。