现代遗传学14.遗传工程学

5‘
随机引物
标记的DNA片段
REMOVE
REMOVE bait DNA
Inserted DNA coding Protein for detection GAL4-AD
lacZ
bait DNA
Inserted DNA coding Protein for detection GAL4-AD
将目的片段和载体相连
C. 其他工具酶
修饰, 加工等作用
限制性内切酶II及其产生的3种不同末端
5'突出的粘性末端
P
EcoR I
P
3'突出的粘性末端
P
Pst I 平末端
P P
EcoR V
P
同切酶和同粘酶
同切酶: 识别相同的位点, 但生成不同的末端. 同粘酶: 识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端
同切酶
lacZ
Bait DNA
Bait DNA
PCR技术及其应用
应用范围：


检测和诊断（高灵敏度）
基因克隆（eg: 通过部分已知序列扩增未知目标片段
其他常用分子生物学技术
丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE） 脉冲电泳 双向电泳 Southern杂交 northern杂交 western杂交
转基因动植物和基因治疗
过oligo(dU)柱
TTTTTTTTT AAAAAAAA
洗脱
AAAAAAAA
mRNA
筛选DNA文库
用标记的核酸作为探针
用诱饵质粒筛选表达cDNA文库
探针标记
标ห้องสมุดไป่ตู้物：
同位素标记：32P
非放射性标记：荧光标记，生物素，dig(地高辛）等
模板DNA 变性
随机6核苷酸引物， dNTP, 某种标记dNTP DNA Pol I
常用宿主
大肠杆菌: 繁殖快, 易培养, 易分离产物 噬菌体: 转化效率高, 易于保存
酵母: 繁殖最快的真核生物, 适于有蛋白质加工的基因
表达
lacZ
如何提高克隆效率?
提高插入片段和载体的比例
尽可能采用粘端连接*
载体脱磷以降低载体自连
插入片段磷酸化
改进转化条件
问题:
有一外源片段用某种酶切,生成了5´ 突出粘性 末端 5´ -GATC, 但是载体上的单酶切位点 只能生成下面这几种粘性末端: 5´-CTAG 5´-TCGA 5´-TTAA 应当采用怎样的策略来提高连接效率?
转基因动物：医学研究，生物制药 转基因植物：改良品质，提高抗逆能力 基因治疗：治疗药物无法根治的遗传性疾病
5´ C A U G 3´ 3´ G U A C 5´
mRNA Antisense RNA
第十四章 遗传工程
利用转基因手段对生物进行 人为改造的技术
什么是遗传工程？
体外DNA重组技术：利用工具酶将
外源片段和载体连接，导入生物体并 使其稳定复制和传代的技术
目的

研究工作 生物产品(生物反应器) 改良物种(提高品质)

基因治疗
工具酶
A. 剪切酶类
有目的有选择的把目的片段切开
B. 连接酶类
不依赖于内切酶和连接酶的体外重组
----位点专一性重组
（依赖于短片段同源序列的重组）
cosN, LoxP
cre
LoxP
LoxP
LoxP
LoxP
Transform
+report gene substrates
新鲜组织研磨或匀浆
rRNA tRNA mRNA AAAAAAAA
RNA提取液
总RNA


易分离提取 高产率（多拷贝） 强启动子 多宿主
常用载体
质粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬
粒(phagemid), 病毒，PAC，YAC，BAC
特殊用途的载体
表达型载体， 分泌型载体，穿梭载体
宿主
•繁殖快, 易于培养, 能够快速得到产物 •对所携带基因的表达产物具有较高耐受性, 具有 克隆最多种基因的可能 •突变率低, 能够稳定忠实的保存被克隆基因
Sma I
5´ ... C C C^G G G ... 3´ 3´ ... G G G^C C C ... 5´
Xma I
5´ ... C ^ C CG G G ... 3´ 3´ ... G G GC C ^ C ... 5´
同粘酶
BamH I
5´ ... G^G A T C C ... 3´
3´ ... C C T A G^G ... 5´
Bgl II
5´ ... A^G A T C T ... 3´ 3´ ... T C T A G^A ... 5´
Sau3A
5´ ... ^G A T C ... 3´
3´ ... C T A G^ ... 5´
连接酶及其对底物的要求:
T4 Ligase, Ecoli Ligase
底物:
自由5’末端和自由3’末端, 5’末端带磷
磷酸化酶,激酶(kinase)
逆转录酶(reverse transcriptase) RNase H, RNase A 甲基化酶(methylase)
载体及其构成基本要素



能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝 粒, 端粒 方便插入外源片段: 单酶切位点 选择标记: 药物抗性 报告基因: 插入筛选标记
酸基团
反应条件：Mg++，ATP存在
其它工具酶
聚合酶(polymerase): DNA聚合酶I, klenow片段, Taq, Pfu, 末端转移酶 外切核酸酶(exonuclease): exo III, S1核酸酶, DNase I 脱磷酸酶(dephosphatase): 碱性磷酸酯酶CIP