2015版新药典黄曲霉毒素检测方案

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黄曲霉毒素国标检测方法

黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素（AF）是一种由黄曲霉属真菌产生的有毒代谢产物。

它们被广泛分布在食品、饲料和环境中，可能对人类和动物健康造成危害。

因此，对黄曲霉毒素的快速、准确检测成为了保障公众健康的关键。

国家标准委员会制定了黄曲霉毒素国标检测方法，以保证各个检验机构的检测质量和结果一致性。

1. 检测样品的制备
样品制备过程是检测过程的关键步骤。

样品必须被精确称量和混合，以确保最终检测结果的准确性和可重复性。

样品预处理的方法通常包括研磨、切碎、混合和抽样等步骤，具体方法取决于样品的特性，如水分含量、粘度和粒度分布等。

2. 样品提取
样品提取过程中，黄曲霉毒素从样品中被提取到适当的溶剂中。

提取的选择取决于样品的特性和黄曲霉毒素的特性。

一些常见的提取方法包括回收萃取、固相萃取和羧甲基纤维素柱萃取等。

3. 分离和净化
为了获得最终准确的结果，必须分离并净化提取的样品。

对于黄曲霉毒素的分离和纯化方法主要有和阳离子交换树脂和固相萃取等方法。

检测黄曲霉毒素的方法主要包括色谱检测法、酶联免疫检测法、毛细管电泳等方法。

其中酶联免疫检测法已成为广泛使用的检测方法之一。

该方法以特异性抗体为基础，利用抗原抗体相互作用，快速、敏感地检测黄曲霉毒素。

总的来说，黄曲霉毒素国标检测方法是一系列高效准确的方法，可以帮助检验机构检测食品或饲料中的黄曲霉毒素，保证公众健康。

2015版药典微生物限度检查法

（MPN 法），
度 30 ～度 30 ～
培养温度
35℃，培养 35 ℃ ，培养
30～35℃，培
时间 18～24 时间不超过
养时间不超
小时
3 天，接种量
过 3 天，接种
不大于
量不大于
100cfu
100cfu
沙氏葡萄糖胰酪大豆胨沙氏葡萄胰酪大豆胨沙氏葡萄
琼脂培养基琼脂培养糖琼脂培琼脂培养基糖琼脂培
过 3 天，接种
小时
不大于
量不大于
100cfu
100cfu
枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨胰酪大豆胨
胰酪大豆胨
(Bacillus
琼脂培养基琼脂培养基
琼脂培养基/
subtilis)
或胰酪大豆和胰酪大豆
胰酪大豆胨
〔CMCC(B) 63 501〕胨液体培养胨液体培养
液体培养基
基，培养温基，培养温
贴膏剂供试品取供试品,去掉防粘层，将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上，在粘贴面上覆盖一层适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布），避免贴膏剂粘贴在一起。将处理后的贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨脂 80 或卵磷脂）稀释液的容器中，振荡至少 30 分钟。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释。
计数方法适用性试验 ⒈供试液制备根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过 45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过 1 小时。常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。 ⑴ 水溶性供试品取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 ⑵ 水不溶性非油脂类供试品取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。分散力较差的供试品，可在稀释剂中加入表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释。 ⑶ 油脂类供试品取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯 80 或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过 40℃（特殊情况下，最多不超过 45℃），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成 1∶10 供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步 10 倍系列稀释。 ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品膜剂供试品取供试品,剪碎,加 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡，振摇，制成 1∶10 的供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释。肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品，加入 pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或 pH7.6 无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂），置 45℃水浴中,振

黄曲霉毒素标准检测规程

黄曲霉毒素标准操作规程1、目的为了规范亲和柱净化样本中黄曲霉毒素的操作流程，特制订本操作规程。

2、范围本标准适用于粮食、饲料、中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测。

3、检出限和定量限项目岛津安捷伦样本检出限（µg/kg）样本定量限（µg/kg）样本检出限（µg/kg）样本定量限（µg/kg）AFG10.12 0.4 0.9 3.0AFG20.08 0.2 0.3 0.86AFB10.08 0.2 0.6 1.97AFB20.04 0.12 0.2 0.63 4、职责部门名称部门职责质量管理部1、负责本制度的实施。

2、负责本制度的监督执行。

5、程序5.1 原理测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品中的黄曲霉毒素B1经过提取、过滤、稀释，然后缓慢的通过黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。

用甲醇洗脱黄曲霉毒素B1，然后注入到分析仪器中用于检测。

5.2 溶液配制5.2.1 70%甲醇-水溶液：取700mL甲醇，加入300ml去离子水混匀即可。

5.2.2 80%乙腈-水溶液：取800m乙腈，加入200ml去离子混匀即可。

5.2.3 1% 吐温-水溶液：取1ml 吐温-20，加入去离子水并定容至100ml。

5.2.4 黄曲霉毒素混合标准工作液：用色谱级甲醇将储备工作液分别稀释到50 ng/ml、20 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml、0.5 ng/ml。

5.3 样品前处理5.3 1 适用于玉米、小麦等粮食作物，花生及其制品，坚果、玉米油、花生油、饲料等样品----25g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过2mm 分样筛），加入5g 氯化钠与125mL 70% 甲醇-水溶液混匀；----高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液；----取10mL 滤液加入20mL 蒸馏水稀释，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；----取15mL 上样液过免疫亲和柱净化。

黄曲霉毒素检测方案

黄曲霉毒素检测方案
【黄曲霉毒素】
黄曲霉毒素是主要由黄曲霉、寄生曲霉产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率较高。

B1、B2和G1、G2，就是经常经常出现在农产品中的黄曲霉毒素的代表，毒性较强的排行“B1”，B表示蓝色，因为它在紫外光的照射下会发出蓝色荧光。

除了亲兄弟B2之外，它还有堂兄弟G1和G2，因为在紫外光下发射黄绿色荧光而得名。

黄曲霉毒素在农产品中几乎无法避免，不想饿死的人类也只好无奈地吃下一些。

世界各国，都只能设定一个“限量标准”。

不超过那个标准，危害就小到可以忽略了。

它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。

当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。

AFT的致癌力也居首位，是目前已知致癌物之一。

由于黄曲霉毒素在水溶液中会发生荧光淬灭，反相色谱中B1和G1两种异构体荧光强度很弱，需要进行衍生化。

衍生化的方法一般有柱前和柱后两类，我国药典在测定黄曲霉毒素时采用碘柱后衍生法。

【样品制备】
【主要仪器】
【色谱条件】。

中药材中黄曲霉毒素的检测

为进一步加强中药材的质量控制，国家食品药品监督管理局，增加中药材的安全性指标控制项目，尤其是加强对中药材中重金属及有害元素、黄曲霉毒素、农药残留量的控制。《中国药典》对中药材的规定限度为黄曲霉毒素 B1 不得过 5μg/kg；黄曲霉毒素 G2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 B2 总量不得过 10μg/kg。
黄曲霉毒素 B1 标准品
黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 混标（GB/T 5009.23-2006）标准品 Athena C18-WP 液相色谱柱优级纯氯化钠，ACS-ISO，≥ 99.5% SPE 小柱连接件【1，3，6mL】，PP 材质 CNW 12 位固相萃取真空装置亲水 PTFE 针式滤器 2ml 无针注射器 3ml 塑料巴斯德吸管、160mm、未灭菌
3mL，20 支 / 盒 (4℃ -8℃保存 ) 1mL，25 支 / 盒 (4℃ -8℃保存 ) 3mL，20 支 / 盒 (4℃ -8℃保存 )
3 mg/L 乙腈，1mL 于 Certan Vial
不同浓度于乙腈，1 ml 于 Certan Vial 4.6*150mm，5um 500g 12 个 / 包 12 位 13mm*0.22um，金色，100 只 / 罐 100 只 / 包 500/ 箱 2ml，12*32mm，9mm，100 只 / 盒
安谱实验推出 Beacon 黄曲霉毒素总量免疫亲和柱用于中药材（僵蚕，酸枣仁，陈皮，桃仁）中的黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2 的检测 , 方法简单易行 , 回收率高。
一 . 前处理方法
1. 称取供试品粉末约 5g( 过二号筛 ) 于 50ml 离心管中，加入氯化钠 1g； 2. 加入 70％甲醇溶液 25ml，高速混匀震荡 5 分钟，离心 5 分钟 ( 离心速度 4000 转／分钟 )； 3. 量取上清液 15ml，置 50ml 容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀； 4. 用玻璃纤维滤纸滤过； 5. 量取滤液 20.0ml，通过免疫亲合柱，用去离子水 20ml 淋洗，淋洗液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用 1.5ml 甲醇洗脱，收集洗脱液，待测。 6. 取洗脱液 500ul，加入 500ul 去离子水，混匀后待测。

黄曲霉毒素的污染及快速定量检测方案

中药材中黄曲霉毒素的污染及快速定量检测方案--8min准确定量一、黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素是一类真菌(黄曲霉和寄生曲霉)的有毒的代谢产物，具有很强的致癌性，它们主要存在于药材、谷物、坚果、棉籽以及动物饲料相关的产品中。

毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，且以B1毒性最大。

当人摄入量大时，会发生急性中毒，急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。

当微量持续摄入时，会造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。

二、黄曲霉毒素检测的中药材品种及其国家限量标准2010版《中国药典》规定黄曲霉素检查的5种药材：酸枣仁、僵蚕、胖大海、陈皮、桃仁。

现行的2015版《中国药典》规定黄曲霉毒素检查的19种中药材，相对2010版《中国药典》增加了14个品种：(1)根及根茎类：远志；(2)果实种子类：大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟榔、酸枣仁、薏苡仁；(3)动物类：水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣、僵蚕。

黄曲霉毒素类别限量标准（μg/kg）黄曲霉毒素B1 ≤5黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1及≤10黄曲霉毒素G2总量引自：现行的2015版《中国药典》《中国药典》对黄曲霉毒素检测的要求，既突出了中药整体质量控制的特点，又增加和完善了安全性控制方面的要求。

三、上海飞测生物中药材中黄曲霉毒素B1快速定量检测方案--8min准确定量检测原理：4.1.黄曲霉毒素B1荧光定量快速检测系统性能◆检测灵敏度：0.5μg/kg；◆定量线性范围：1.0μg/kg - 75.0μg/kg；◆样品前处理时间：7min；◆检测时间：8min；◆准确度：回收率为80%-125%；◆特异性：在1000μg/kg浓度水平下与其它真菌毒素无交叉反应；4.2.样品前处理过程1、粉碎（中药材样品粉碎处理、称量）；2、振荡提取（5min）；3、离心（2min）；4.3.检测操作过程1、稀释；2、加样反应（8min）；3、读数，打印检测报告；4.4.结果判读和输出采用便携式黄曲霉毒素B1检测仪进行读数，使得检测结果更加准确、客观，避免人为的误判。

黄曲霉素检测法

食品中黄曲霉毒素的测定—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法1 范围本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。

本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。

样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。

2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法2.1 方法提要试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。

用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。

2.2 试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。

2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水2.2.5 苯：色谱纯2.2.6乙腈：色谱纯2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯2.2.8氯化钠（NaCl）2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）GB/T 18979-20032.2.11氯化钾（KCl）2.2.12 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。

2.2.13 吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。

[整理]2015版新药典黄曲霉毒素检测方案

2015年药典黄曲霉毒素测定法本法系用高效液相色谱法测定药材及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相，流速0.8mL/min；采用柱后衍生法检测:光化学衍生法：光化学衍生器（254nm. PriboFast-KRC光化学柱后衍生器.Pribolab-MDU光化学柱后衍生器）；以荧光检测器检测，激发波长λex =360nm(或365nm)，发射波长λem =450nm。

两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

混合对照品溶液的制备：精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1.0μg/m L、0.3μg/m L、1.0μg/m L、0.3μg/m L、）0.5mL，置10mL于量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。

精密量取储备液1mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

(Pribolab STD#1082-2 AFT混合标准品：AFT B1和AFT G1：1.0μg/mL，AFT B2和AFT G2：0.3μg/mL ）供试品溶液的制备：1. 取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入精密加入70%甲醇溶液75mL，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11,000r/min,®他物质萃取时间要求不一的需求，通过特殊结构设计实现在短时间内对真菌毒素等物质的高效粉碎、萃取，保证检测结果的准确性和精确度。

粉碎样品在不锈钢杯中通过电机旋转驱动刀同时进行劈裂、碾碎、掺合等过程。

使物料搅拌粉碎,转速高达22000以上,全金属机身和不锈钢杯子,抗有机溶剂的腐蚀,可以实现在2-3分钟高效实现真菌毒素的均质、萃取等关键环节。

优点：高速震荡3分钟即可完成整个真菌毒素及其他物质的萃取过程；●转速两档可调，低速12000r/min，高速22000r/min；●全金属机身，不锈钢材质，抗有机溶剂腐蚀；●可广泛应用于食品检验、科学研究、医学治疗、化工制药等行业；●本机构造方面均合于无菌操作的要求；●通过CE认证。

黄曲霉毒素

黄曲霉毒素B2
0.0035～0.0175
黄曲霉毒素G1
0.0118～0.059
黄曲霉毒素G2
0.0059～0.0295
五、我国现行法定检测方法
• 线性范围与标准曲线
基本要求：所测样品应在线性内以黄曲霉毒素B1的限度为例：不得过5μ g/kg、取样15g、进样量20μ l
黄曲霉毒素B1
15×5×15×20×20 1000×75×50×2
一、黄曲霉毒素的发现及简介
基本结构是由一个双呋喃环和香豆素构成。
一、黄曲霉毒素的发现及简介
黄曲霉毒素的理化性质
一般特性：几乎是无色，分子量为312～346。B1 的分子量为312
荧光特点：在 365nm紫外照射下可产生荧光，B族毒素显蓝紫色荧光；G族毒素显黄绿色荧光
溶解特性：难溶于水，石油醚和乙醚；易溶于氯仿、甲醇、丙酮、苯、乙腈等多种有机溶剂
限量标准：黄曲霉毒素B1≤5μg/kg，B1、B2、G1、G2总量 ≤20μg/kg
提取方法：甲醇/水（17:3）振荡提取，部分提取液以氯化钠溶液稀释后，正己烷脱脂，再用三氯甲烷萃取。净化：硅胶柱测定：TLC UV365nm
四、黄曲霉毒素测定方法简介
薄层色谱法酶联免疫吸附（ELISA）法荧光光度法 HPLC法（中国药典，测B1/ B2/ G1/ G2 含量）金标试纸条（现场使用，样品初筛）
光化学柱后衍生二、柱后衍生：加热柱后衍生（溴或碘柱后衍生）
电化学衍生
五、我国现行法定检测方法
I2
I2
碘衍生原理
五、我国现行法定检测方法
hV
hV
光化学衍生的原理
五、我国现行法定检测方法
测定设备

2015版药典中中药材特殊检查品种(农残、重金属、黄曲霉毒素)

2015版药典中药材黄曲霉毒素检查品种
柏子仁、莲子、使君子、槟榔、麦芽、肉豆蔻、决明子、远志、薏苡仁、大枣、地龙、水蛭、蜈蚣、全蝎、陈皮、胖大海、僵蚕、酸枣仁、桃仁等19种中药材品种。

2015版药典中药材铅镉砷汞铜重金属检查品种
丹参、水蛭、甘草、白芍、牡蛎、阿胶、昆布、金银花、珍珠、枸杞子、海螵蛸、海藻、蛤壳、黄芪、蜂胶等15种中药材品种
2015版药典中药材农药残留检查品种
人参、西洋参等2种中药材品种有机氯农药残留量照农药残留量测定法(通则2341有机氯类农药残留量测定法一第二法)
甘草、黄芪等2种中药材品种有机氯农药残留量照农药残留量测定法(通则2341有机氯类农药残留量测定法一第一法)。

黄曲霉毒素测定法

黄曲霉毒素测定法第一法本法系用高效液相色谱法（附录8）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相，采用柱后衍生法检测，①碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；②以光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm （或365nm），发射波长λem=450nm。

两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。

精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

供试品溶液的制备取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，置于均质瓶中，加入氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度1100转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱（AflaT-est@P）,流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取上述混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。

2015版药典黄曲霉毒素测定法

2351 黄曲霉毒素测定法第一法1 本法系用高效液相色谱法(通则 0512)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素 G2 总量计)，除另有规定外，按下列方法测定。

当测定结果不符合规定时，以第二法测定结果为准。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 - 乙腈 - 水(40∶18∶42)为流动相；采用柱后衍生法检测，（1）碘衍生法：衍生溶液为 0.05％的碘溶液 (取碘 0.5g，加入甲醇 100ml 使溶解，用水稀释至 1000ml 制成)，衍生化泵流速每分钟 0.3ml，衍生化温度 70℃；（2）光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发波长 λex=360nm(或 365nm)，发射波长 λem=450nm。

两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。

混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 标示浓度分别为 1.0μg／ml、0.3μg／ml、1.0μg／ml、 0.3μg／m1)0.5ml，置 10ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。

精密量取储备液 1ml，置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

供试品溶液的制备取供试品粉末约 15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠 3g，置于均质瓶中，精密加入 70％甲醇溶液 75ml，高速搅拌 2 分钟(搅拌速度大于 11000 转／分钟)，离心 5 分钟(离心速度 2500 转／分钟)，精密量取上清液 15ml，置 50ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，量取续滤液 20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟 3ml，用水 20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置 2ml 量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

黄曲霉毒素检测方法国标

黄曲霉毒素检测方法国标
黄曲霉毒素检测方法国标是指按照中国国家标准制定的黄曲霉毒素检测方法。

目前，中国国家标准中规定的黄曲霉毒素检测方法主要有两种：液相色谱-质谱联用法和酶联免疫吸附测定法。

这两种方法都是目前应用较广泛且效果较好的检测方法。

液相色谱-质谱联用法是一种高灵敏度、高选择性的方法，能够同时检测多种黄曲霉毒素，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2等。

该方法通过液相色谱分离，再通过质谱联用技术进行鉴定和定量，具有高精确度和准确性。

酶联免疫吸附测定法是一种简便快速的检测方法，该方法通过将黄曲霉毒素与特异性抗体结合，然后通过酶标记的二抗或底物发生染色反应来检测黄曲霉毒素的存在。

该方法速度快、操作简便，适用于快速筛查和初步定量。

需要强调的是，具体的黄曲霉毒素检测方法国标可能会因地区和标准的变化而有所差异，建议使用时查阅当地的相关标准或咨询专业机构进行确定。

《中国药典》2015年版微生物测定修订情况

常州药检
一、微生物计数法
分别接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平板，每一试验菌株平行制备2个平皿，30～35℃培养不超过3天。同时，用相应的对照培养基代替被检培养基进行上述试验。分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平板，每一试验菌株平行制备 2个平皿，30～35℃培养不超过5天。同时，用相应的对照培养基代替被检培养基进行上述试验。
常州药检
一、微生物计数法计数培养基适用性检查
菌种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，不得超过5代。
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
取其新鲜培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。黑曲霉制备时在缓冲液或氯化钠溶液中加入0.05%（v/v）聚山梨酯80。菌液在室温下2小时内使用，2～8℃时可在24h内使用，黑曲霉孢子悬液可2～8℃保存，在验证过的贮存期内使用。
MPN法
常州药检
一、微生物计数法
平皿法：包括倾注法和涂布法。每株菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术平均值计算。使用涂布法应采用适宜的方法使培养基表面干燥，且每个平皿接种的供试液不少于0.1ml。
常州药检
一、微生物计数法
薄膜过滤法：一般取相当于1g（ml、10cm2）的供试品，（若供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量）加至适量稀释液中，混匀，过滤。用适量冲洗液冲洗。每株菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
常州药检

黄曲霉毒素检测方法

黄曲霉毒素检测方法
黄曲霉毒素是引起动物和人类食物中毒的常见真菌毒素之一。

为了确保食品的安全和质量，需要对食品样品中的黄曲霉毒素进行检测。

下面介绍几种常用的黄曲霉毒素检测方法。

1. 高效液相色谱法（HPLC）：HPLC是一种常用的分离、鉴定和测定食品中黄曲霉毒素的方法。

该方法使用高效液相色谱仪通过不同的分离柱，将样品中的黄曲霉毒素与其他组分分离开来，并根据其唯一的吸收特性进行检测和定量测定。

2. 气相色谱法（GC）：GC是一种基于样品中物质的挥发性的分离和检测方法，可以用于测定黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2。

该方法需要将样品进行预处理，如萃取、净化等，然后通过气相色谱仪进行分离和检测。

3. 免疫测定法：免疫测定法是一种基于抗原与抗体特异性结合的原理进行黄曲霉毒素检测的方法。

常见的免疫测定法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫测定法（RIA）。

这些方法操作简便、快速，可以实现对大量样品的高通量检测。

4. 质谱法：质谱法是一种可靠的黄曲霉毒素检测方法。

质谱法主要包括质量光谱（MS）和质谱联用技术（LC-MS/MS）。

这些方法通过样品中黄曲霉毒素的特征峰进行检测和定量，并具有高灵敏度和高选择性的优势。

以上是几种常用的黄曲霉毒素检测方法，每种方法都有其优缺点，选用合适的方法应根据样品特性、设备条件、经济性和检
测需求来决定。

为了确保食品的安全，建议将不同的检测方法结合使用，以提高检测的准确性和可靠性。

黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案设计

黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案一、黄曲霉毒素介绍黄曲霉毒素(aflatoxin，简称为AF)是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素。

它可通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全，对人体及动物脏器官尤其是肝脏损害严重，该毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中。

黄曲霉毒素比较耐热，加热至230℃才能被完全破坏，因此一般烹饪加工也不易消除。

二、黄曲霉毒素对人体的危害1、引起急、慢性中毒：黄曲霉毒素是剧毒物质，其毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍。

黄曲霉毒素属肝脏毒，除抑制DNA、RNA的合成外，也抑制肝脏蛋白质的合成，黄曲霉毒索引起人类的急性中毒事件，国外均有许多报导，最典型的是印度的霉变玉米事件，该事件直接导致了数十人丧生，数百人患上不同类型的肝脏疾病。

2、致癌性：黄曲霉毒素有极强的致癌性，长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌。

它诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍，是目前公认的致癌性最强的物质之一。

另据世界卫生组织报导，黄曲霉毒素含量在30~50ug/kg时为低毒，50~100ug/kg时为中毒，100~1000ug/kg时为高毒，1000ug/kg以上为极毒。

鉴于黄曲霉毒素对人类的巨大危害性，我国对其在食品中的含量作了严格规定，其中，乳制品中黄曲霉毒素最高允许量为5ug/kg（即5ppb）。

三、黄曲霉毒素的种类黄曲霉毒素主要有4种：即B1、B2、G1、G2，其中B1被认为是主要的有毒物质，有2种这些毒素的代谢产物M1和M2。

其中黄曲霉毒素B1主要存在于农产品，动物饲料，中药等产品中；黄曲霉毒素M1是动物摄入黄曲霉毒素B1后在体经羟基化代谢的产物，一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的可食部分，如乳、肝、蛋类、肾、血和肌肉中，其中以乳最为常见。

黄曲霉毒素M1的毒性和致癌性与黄曲霉毒素B1的基本相似。

由于牛乳及其制品是人类、特别是婴儿的主要食品，所以其危害性更大。

黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案_刘先德

参考文献：
[1] 胡玲玲 . 食品中黄曲霉毒素检测方法研究与评估 [D]. 浙江工业大学 ,2014.
Mar 2015
CHINA F及其检测方法整体解决方案
刘先德吉林省敦化市质量技术监督局
摘要：黄曲霉毒素 ( 简称 AF) 是世界上至今所发现的毒性最厉害的真菌毒素，在人类生产生活中的多个环节都有可能产生黄曲霉毒素，直接污染食品和饲料，威胁人类健康和生命安全。本文简要介绍了黄曲霉素的种类及其对人体的危害，重点探讨了黄曲霉毒素的检测方法。关键词：黄曲霉毒素；检测；免疫亲和柱法 DOI:10.16043/ki.cfs.2015.09.051 (Tween) 1 黄曲霉毒素的分类（5）HPLC 流动相配制：水 / 甲黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉醇 / 乙腈（60/30/15,v/v）中产毒菌株的代谢产物，主要产生于发霉变质的粮食谷物或其生产制品。 3.2 样品处理方法一：标准方法，该处理程序适黄曲霉毒素主要包含 4 种：即 B1、用于样品基质中没有干扰，主要适用于 B2、G1、G2，其中 B1 目前被认为是最大多数谷类样品的处理。主要步骤如下：主要的有毒物质，它含有 2 种主要的（1）取 20g 样品加入 100ml 提取毒素代谢产物 M1 和 M2。另外，黄曲液放入匀浆机中，并高速搅拌 5 分钟。霉毒素 B1 在动物饲料、农产品及中药（2）用滤纸过滤上述提取液材等产品中比较常见，动物在食用了（3）取 14ml 过滤后的提取液加入含有黄曲霉毒素 B1 的饲料后，在体内 86ml 的 1mmolPBS 缓冲溶液（pH 7.2）。经羟基化代谢会产生黄曲霉毒素 M1，（4）打开净化柱上密封盖和下面经代谢产生的 M1 一部分会从动物的尿堵头后，柱中的缓冲溶液会排出，直和乳汁排出，另一部分则直接留在动物的肝、肾、血和肌肉等人类食用部分。到缓冲溶液液面达到柱中填料上层处。（5）取 5-50ml 稀释后的提取液 2 黄曲霉毒素对人体的危害（取样体积根据分析方法的灵敏度来黄曲霉毒素是世界上最主要的剧毒确定）上 AflaCLEANTM 柱，在净化过物质之一，其毒性非常大，相当于砒霜程中可对柱子进行抽真空和加压。的 68 倍，氰化钾的 10 倍，若不慎摄入（6）用 10ml 蒸馏水或纯化水清会引起人体急、慢性中毒，甚至危及生洗柱子命。另外，黄曲霉毒素是极强的致癌物（7）用气体吹扫或抽真空除去柱质，若人体长期摄入黄曲霉毒素则会引子中残余的水发肝癌，它的致癌性相当于二甲基亚硝（8）每次用 1ml 甲醇洗脱柱子，胺的 76 倍，是如今公认的致癌最强的可洗 2 次。毒素之一。（9）根据分析的需要对洗脱液进 3 黄曲霉毒素的检测行稀释或浓缩并直接进行 HPLC 分析。国际卫生组织及世界粮农组织所方法二：标准方法加正己烷分层，属的食品法典委员会推荐食品、饲料该样品处理方法针对样品中含有油脂中黄曲霉毒素最大允许量标准为总量比较多，如坚果类，一些香料或无花 (B1+B2+G1+G2) 小于 15μg/kg；牛奶中果酱，脂肪和样品中含有一些需要用 M1 的最大允许量为 0． 5μg/kg。目前“免正己烷去除的杂质。疫亲和柱法”是现在国际公认的比较经（1）称取 20g 样品并加入 2g 的氯济有效的分析方法，因此本文主要对 “免化钠；疫亲和柱法” 的检测步骤进行详细探讨。（2）加入 100ml 提取溶剂和 50ml 3.1 试剂配制正己烷于匀浆机中高速搅拌 5min；（1）样品提取溶剂：甲醇 / 水（3）静止分层，取下层液进行下（4/1，v/v）一步处理；（2）配制 5mmol 磷酸盐缓冲溶液（4）取下层液用滤纸过滤；（pH7.2）母液剩下的步骤同方法一标准方法的（3）配制 1mmol 磷酸盐缓冲溶液步骤（3）至步骤（9）。（pH7.2）工作液方法三：标准方法加正己烷分层（4）配制磷酸盐缓冲溶液 / 吐温

农残黄曲霉重金属品种2015版药典特殊检验方法总结

有机氯农药残留：
（1）有机氯农药残留量照农药残留量测定法(通则2341）有机氯类农药残留量测定一第一法)测定。

六六六（总BHC）不得过0.2mg/kg ；滴滴涕（总DDT）不得过0.2mg/kg；五氯硝基苯（PCNB）不得过0.1mg/kg。

品种：甘草黄芪
（2）含总六六六（α– BHC、β- BHC、γ-BHC、δ-BHC之和）不得过0.2mg /kg ;总滴滴涕（pp' -DDE、pp'- DDD、υp' -DDT、pp'-DDT之和）不得过0.2mg /k g ;五氯硝基苯不得过0.lmg/kg；六氯苯不得过0.lm g/kg; 七氯（七氯、环氧七氯之和）不得过0.05mg/kg;艾氏剂不得过0.05mg /kg;氯丹(顺式氯丹、反式氯丹、氧化氯丹之和）不得过0. lmg/kg。

品种：西洋参人参
2.重金属及有害元素照SOP-TG25-2015铅、镉、砷、汞、铜测定法测定，铅不得过5mg/kg；镉不得过0.3mg/kg；砷不得过2mg/kg；汞不得过0.2mg/kg；铜不得过20mg/kg。

品种：山楂丹参甘草白芍西洋参枸杞子黄芪金银花
2015新增：牡蛎昆布珍珠海螵蛸海藻蛤壳水蛭
3.黄曲霉毒素
品种：胖大海陈皮僵蚕桃仁酸枣仁
2015新增品种：薏苡仁大枣水蛭地龙肉豆蔻莲子槟榔全蝎决明子麦芽远志使君子柏子仁
4.重金属总量（比色法）
品种：石膏芒硝玄明粉地龙
5.砷盐（二乙基二硫代氨基甲酸银）
品种：玄明粉芒硝石膏
6.聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性方法
品种：川贝母蕲蛇乌梢蛇。

微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则).

霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。

二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8. 附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准(2)．目测霉变者以不合格论。

(3)．“无”为标准依据或无相应规定。

准依据或无相应规定。

2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。

生化试剂储存箱。

2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。

2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml 分度0.01，10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。

2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。

用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。

2.3用过的玻璃器皿：2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。