灵芝多糖检测方法
灵芝多糖
灵芝多糖灵芝属真菌具有很高的药用价值从而得到广泛的研究与应用,而多糖类化合物是灵芝属真菌的主要化学成分之一。
灵芝多糖结构如分子量、单糖组成和糖苷键类型等，对其活性影响很大，本文列举了灵芝多糖结构通用的检测方法。
已有实验证实，灵芝多糖的生物保健功能主要体现在降血糖、降血脂、抗肿瘤、提高免疫力和抗氧化方面。
灵芝是担子菌门担子菌纲多孔菌科灵芝属药用真菌，古代就认为其有扶正固本、滋补强壮的功效，对其药性十分推崇。
灵芝类所含化学成分复杂,且因所用菌种培养方法、提取方法等不同而异.研究灵芝类的化学成分的目的,在于了解和比较灵芝属不同品种及同一品种的不同发育阶段(如子实体、菌丝体、孢子体)所含的化学成分,通过药理及临床研究确定其有效成分或有效部分.目前研究较多的灵芝化学成分主要有:三萜类化合物、多糖类、核苷类、甾醇类、生物碱类、呋喃衍生物、氨基酸多肽类、无机元素、脂肪酸等现代科学检测表明，灵芝在免疫系统的调节、通过增强宿主免疫调节功能达到抗肿瘤作用、抗病毒作用、通过提高氧化酶活性而清除体内自由基达到抗衰老的作用、降血脂等方面有着极其重要的医学作用。
随着近年来对灵芝研究的不断深入，发现灵芝多糖是灵芝的主要活性物质之一，其重要性不言而喻。
本文综述了近年来国内外对灵芝多糖的主要研究进展。
灵芝多糖的结构如同其他的生物活性大分子，灵芝多糖的生物活性依赖于化学结构，因此，要研究灵芝多糖生物活性的机理，不可避免的要研究其化学结构。
对灵芝多糖的化学结构的研究，主要集中于其单糖的组成、多糖分子量范围、单糖连接方式等方面。
近年来，随着研究的不断深入，对灵芝多糖的化学结构已经有了一定的了解。
虽然灵芝多糖化学结构由于灵芝种类的不同而有所差异，但其化学结构的某些方面是固定不变的。
灵芝多糖的组成灵芝多糖是由肽多糖、葡萄糖、杂多糖等多糖均一体组成的混合物,是灵芝中的主要有效成分[9].从构成来看,灵芝多糖大多为杂多糖,即除葡萄糖基外,还含有少量D-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖等单糖。
灵芝多糖含量的苯酚硫酸法检测研究
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灵芝多糖是灵芝的主要有效成分， 经研究表 明 ， 灵芝多糖具有显著的拟 "./ 活性，可显著清除机体 产生的自由基， 从而阻止自由基对机体的损伤， 防止 脂质的过氧化， 保护细胞， 延缓细胞衰老； 灵芝多糖 能显著促进细胞核内 /0( 合成能力， 并可增加 细 胞 的分裂代数， 从而起到延缓机体衰老的作用； 具有增 强免疫力的作用， 是扶正 固 本 的 有 效 成 分 1)2#3。 因 此 ， 为了比较、评价以多糖为有效成分的灵芝原料和灵 芝多糖产品的质量，关于多糖含量测定方法的研究
注： 无水乙醇量 .%)*， 离心时间 !%)12 ， 硫酸量 #%)*。
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离心时间的确定
由表 3 中的数据可以看
出， 离心时间的延长显然有利于多糖分子的沉降。当 吸光度值的增加 幅 度 不 大 ， 离心时间在 #.)12 以后，
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分子化合物， 可溶于水而不溶于醇， 醇浓度越大， 所 相同浓度的 沉淀多糖的分子量范围就越广 +,-。因此， 醇溶液， 用量越大， 所沉淀的多糖量越多， 吸光度值 越大。经过方差分析得出， 无水乙醇的四个添加量之 间差异显著， 但以乙醇添加量为 .%)* 时效果最好。 表4 添加量（ )*） 吸光度 9 无水乙醇添加量对吸光度值的影响
HPCE法测定灵芝多糖中单糖的组成
HPCE法测定灵芝多糖中单糖的组成梁加贝，程贝，王菁成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室，成都（610075）摘要: 目的：采用高效毛细管电泳法测定灵芝多糖中单糖的组成。
方法：灵芝多糖水解后，经PMP衍生化，高效毛细管电泳分析。
电泳条件为缓冲液为50mmol·L-1硼砂溶液(pH9.3)；柱温 25℃；电压20kV；检测波长200nm；气压进样0.5psi，进样时间5s。
结果：灵芝多糖主要是葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖4种单糖组成。
结论：该方法具有简单、快速、分离效率高等特点,可用于测定灵芝多糖中单糖的组成。
关键词：灵芝，多糖，毛细管电泳灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝Ganodermasinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体。
灵芝多糖存在于灵芝属真菌的菌丝体和子实体中，是灵芝的主要有效成分之一，是由肽多糖、葡聚糖、杂多糖等组成的混合物[1]。
多糖样品的单糖组成分析常用的方法包括薄层色谱法、气相色谱法和液相色谱法。
薄层色谱法操作简单，但微量成分显色不明显；气相色谱法衍生化操作繁杂、费时；液相色谱法存在柱平衡时间长、色谱柱易污染、试剂消耗大等缺陷。
高效毛细管电泳法是近年发展起来的一种具有高效、灵敏和低耗的分析方法，在糖类物质的检测方面具有独特的优势[2]。
由于单糖缺乏常规紫外生色基团或荧光基团，需要对其进行柱前衍生，采用PMP为衍生试剂能够使其带上可被检测的基团[3～6]。
本实验首次采用高效毛细管电泳法测定了灵芝多糖中的单糖组成，为灵芝多糖的质量控制提供了一种快速、简便的新方法。
1. 材料与方法1.1 仪器与试剂电泳装置为Beckman公司P/ACE TM MDQ型毛细管电泳仪，二极管阵列检测器，用Gold 软件控制仪器操作和数据采集，弹性石英毛细管柱(57cm×50µm，有效长度50cm)（河北永年光导纤维厂）。
蒽酮-硫酸法测定灵芝多糖的含量及其不确定度的评定
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蒽酮 -硫酸法测定灵芝多糖的含量及其不确定 度的评定
钟 岩 初丽伟
(吉林农业大学测试中心 ,农业部参茸产品质量监督检验测试中心 ,长春 130118 )
摘要 采用蒽酮 - 硫酸法测定了灵芝多 糖的含 量 , 并对灵芝 多糖含 量的不 确定进 行了评 定 。分析了 测量不 确 定度分量的主要来源 ,对 各不 确定度分量进行了评 定和计算 。结果表 明 ,灵 芝多糖含 量在 10 ～60 m g/mL 范围内 与 吸光度呈良好的线性关系 ,线 性方 程为 A = 8. 772 1c + 0. 018 7,相 关系 数为 0. 998 1。 当 灵芝 多糖含量为 1. 13%时 , 其 测量结果的扩展不确定度 U = 0. 05% ( k = 2) 。 关键词 灵芝多糖 蒽酮 - 硫酸法 不确定度 评定
- 4 Δ V容 50 = 50 × 2. 1 × 10 × 3 = 0. 032 (mL )
主要有以下几个方面 : ① 样品称量引入的不确定度 ; ② 样品定容体积引入的不确定度 ; ③ 标准溶液稀释 引入的不确定度 ; ④ 重复测量引入的不确定度 ; ⑤ 标 准曲线的非线性引入的不确定度 。 5 测量不确定度的评定 5. 1 样品称量引入的不确定度 u (m ) 样品称量引入的不确定度包括天平校准引入的 不确定度和称量变动性引入的不确定度 。 5. 1. 1 天平校准引入的不确定度 天平检定给出分析天平的误差为 0. 1 mg, 按矩 形分布 ( k = 3 ) , 则由天平校准引入的不确定度为 :
[6 - 8] [4]
。
笔者以紫外分光光度法测定灵芝多糖含量 , 并 对其测定结果的不确定度进行了评定 。该评定为实 验室在该检测过程中进一步提高检测数据的可靠性 和一致性提供参考 。 1 实验部分 1. 1 主要仪器与试剂 紫外分光光度计 : DU - 7500 型 , 美国 Backm an 公司 ; 电子分析天平 : 1712 mp8 型 , 德 国赛多利斯公 司; 灵芝粉 :灵芝购于市场 ,实验室自制粉末 ; 葡萄糖 :分析纯 ,北京化工厂 ; 苯酚 :分析纯 , 北京市笃信精细制剂厂 ; 蒽酮 :分析纯 , 国药集团化学试剂有限公司 ;
野生灵芝与种植灵芝的灵芝多糖含量测定
野生灵芝与种植灵芝的灵芝多糖含量测定摘要】采用紫外分光光度法分别对两类灵芝样品中所含灵芝多糖进行含量测定，结果表明，野生灵芝与种植灵芝中的灵芝多糖含量相近。
【关键词】灵芝；灵芝多糖；含量测定【中图分类号】R284【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2011）04-0053-01《神农本草经》载：灵芝有紫芝、赤芝、青芝、黄芝、白芝、黑芝6种，但据现代文献及所见标本，原植物多见前2种。
灵芝又名三秀或芝，于古代列为上品。
现代药材灵芝为多孔菌科真菌赤芝 Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.) Karst．或紫芝 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体［1］，其分布遍及我国许多省区，生于栎树及其他阔叶树木桩上，多为野生，近年来，许多省区已开始人工栽培。
从《神农本草经》到李时珍的《本草纲目》到今天科学的临床验证：野生灵芝不仅能治疗多种疾病，而且能滋补强壮，扶正固本，具有降血压、降血脂、抗癌、延缓衰老、增强机体活性等多种功能。
其作为一种名贵的中草药，有着特殊的药用价值。
灵芝的药理活性与高分子免疫多糖、有机锗、三萜类化合物等有效成分密切相关,其中灵芝子实体多糖和发酵过程中产生的胞内和胞外多糖都是有效多糖［2］,为灵芝增强机体免疫功能的有效成分。
由于野生资源短缺,目前各地大量进行了灵芝的人工种植,以满足市场的需要。
为了比较人工种植灵芝和野生灵芝的质量,本文以野生灵芝和种植灵芝作为研究对象，采用硫酸-蒽酮法测定灵芝多糖的含量,并进行了对比。
1实验部分1.1 样品采集及预处理采摘野生灵芝(紫芝)和种植灵芝(紫芝)。
分别选取一完整的野生灵芝和种植灵芝，先以自来水洗，再用2次蒸馏水冲洗干净，在50℃烘箱中烘干。
将烘干过的灵芝剪成碎片后，再用粉碎机粉碎，过50目筛制成灵芝粉，分别于干燥器内密封干燥储存供测定使用。
1.2 主要仪器和试剂1.2.1 仪器。
灵芝多糖研究实验报告
灵芝多糖研究实验报告灵芝多糖研究实验报告实验目的：1. 测定灵芝多糖的含量；2. 研究灵芝多糖对人体免疫功能的影响。
实验材料：1. 灵芝提取物；2. 高效液相色谱仪；3. 免疫功能检测试剂盒；4. 实验动物，如小鼠。
实验步骤：1. 提取灵芝多糖：取一定量的灵芝样品，加入适量的水，用超声波浸泡2小时，过滤获得灵芝提取液；2. 测定灵芝多糖含量：用高效液相色谱仪测定灵芝提取液中多糖的含量；3. 灵芝多糖对人体免疫功能的影响：将实验动物分为实验组和对照组，实验组给予灵芝多糖，对照组不给予。
观察两组动物的免疫功能指标，如白细胞计数、淋巴细胞活性等。
实验结果：1. 测定灵芝多糖含量：灵芝提取液中多糖的含量为X g/L（样品浓度）。
2. 灵芝多糖对人体免疫功能的影响：实验组动物的白细胞计数为X（单位），对照组动物的白细胞计数为X（单位）。
实验组动物的淋巴细胞活性为X（单位），对照组动物的淋巴细胞活性为X（单位）。
结论：1. 灵芝中含有一定量的多糖，通过高效液相色谱仪可以测定其含量；2. 灵芝多糖可以提高人体免疫功能，表现为增加白细胞计数和提高淋巴细胞活性。
讨论：本实验结果表明灵芝多糖对人体免疫功能具有一定的影响，但还需要进一步研究来确定具体的机制和效应。
此外，本实验只使用了动物作为实验对象，将来还可以考虑人体试验的进行，以进一步验证实验结果。
此外，对于灵芝样品的提取方法，还可以考虑使用其他技术来进行提取，以提高多糖的得率和提取效果。
感想：通过本次实验，我对灵芝多糖的研究有了更深入的了解。
灵芝多糖作为一种天然产物，具有重要的药用价值。
通过研究其免疫功能，可以为人类的免疫调节和疾病治疗提供有益的启示。
希望未来能有更多的研究报道，以推动灵芝多糖的应用和发展。
灵芝菌生物活性多糖与总糖的测定
从灵芝中提取的 W : ; : 葡萄糖， 杂多糖及糖蛋白 对肿瘤有明显的抑制作用，灵芝提取物能明显增强人 体的免疫能力 X $ : 5 Y 。 因此， 对灵芝菌丝体多糖的研究颇 受关注，文献报道的发酵灵芝菌丝中生物活性多糖含 量的测定方法是采用化学分离，水解后以高效液相色 谱测定 。 但测定结果的精密度和重现性不高 9 相对偏
表! 试样 批号 % # " 多糖 3 %$) # %%) %$) + 化学分析法 相对误差 3 总糖 3 %) # %) " %) % %/) , %/) $ %/) + %
明显偏低。 +,3 ，
参考文献 梁宗岩， 张翼伸 ) 生物化学和生物物理学报， %++" ， #- ： -+)
样品测定结果 ! 多糖 3 !) % !) + !) ! 液相色谱法 %% 相对误差 3 总糖 3 .) , !) / .) %") ! %,) % %,) 相对误差 3 .) # !) . /) %
X-Y
差约 !. Z [. < 、多糖测定值与其他组分含量合并并 与总量对照时，有约有 5( $. Z 5( *. 的物质质量 “ 消 ” 失 ， 故该方法可能存在较大的系统误差， 而灵芝菌丝 粉多糖含量约 $#. Z $$. ， 含量范围适合化学分析。 根据多糖 W : ; : 葡萄糖所组成的特性 X ! Y ， 本文建立的 测定值高出液 化学分析法， 相对标准偏差优于 $( ,. ， 相色谱法测定值约为 5 Z + 个百分点，而与其他组分 含量测定值合并时与 9 蛋白质、 水分、 灰分、 单、 低聚 糖 < 样品总质量基本吻合；可在 , Z ,( +L 完成一个样 品的测定。 $ $( $ 试验 仪器与试剂
分光光度法快速测定灵芝中多糖含量
Key words: phenol-sulferic acid method; polysaccharides from Ganoderma Lucidum; determinate
灵芝在分类学上属于非褶菌目 （Aphyllophorales）灵 芝 菌 科 （Ganodermataceae） 灵 芝 属 （Ganoder－ ma）。古今药理与临床研究均证明，灵芝确有防病治 病延年益寿之功效。灵芝多糖具有显著的拟 ＳＯＤ 活性，可显著清除机体产生的自由基，阻止自由基 对机体损伤，防止脂质过氧化，保护细胞，延缓细胞 衰老［１－２］；具有提高机体免疫抑制肿瘤增强机体耐缺 氧能力、调节血糖血脂、护肝、防辐射及升高白细 胞、抗疱疹病毒、抗突变、抗溃疡等作用 。
2.5 显色温度的选择
取质量浓度为 ０．０５ ｍｇ／ｍｌ 的葡萄糖标准溶液 和蒸馏水 １．０ ｍｌ 于 １０ ｍｌ 具塞试管，加入 ５％的标 准苯酚溶液 １．０ ｍｌ，混匀，迅速滴加浓硫酸 ５．０ ｍｌ， 混匀分别放置温度为 ２５、５０、７５、１００℃水浴中加热 ３０ｍｉｎ 取出后立即冷却至室温，然后于 ４９０ ｎｍ 处测 吸光值。以空白液参照 ２．２ 项，结果分别为 ０．４３４、 ０４６４、０．５３５、０．５５６。由此可知温度越高，多糖溶出越 多，在 １００℃时吸光度最大，说明在沸水中多糖溶 出最多，因此显色温度选择 １００℃。
不同产地灵芝孢子粉中多糖＼总三萜皂苷含量测定
不同产地灵芝孢子粉中多糖＼总三萜皂苷含量测定目的建立灵芝孢子粉中灵芝多糖、总三萜皂苷的含量测定方法。
方法采用紫外分光光度法，苯酚-浓硫酸比色法于波长492nm处测定灵芝多糖吸光度；以香草醛∶高氯酸∶冰乙酸（2∶8∶50）为显色剂，于波长555nm处测定总三萜皂苷的吸光度。
结果多糖、总三萜皂苷的标准曲线的线性范围分别为0.0100~0.0300mg（r=0.9982）；0.025~0.125mg（r=0.9996），多糖、總三萜皂苷的平均加样回收率分别为101.17%、100.74%，RSD分别为1.84%、1.29%。
结论该方法简便、快速、准确，可用于灵芝孢子粉中多糖、总三萜皂苷的含量测定。
Abstract：Objective To establish a method for content determination of total polysaccharides and triterpenoid saponin in the GLS.Methods UV Spectrophotometry,phenol-sulfuric acid;vanillin-glacial acetic acid-sulphuric acid-perchloric acid mixture at the wavelength of 492nm and 555nm absorbance.Results The linear range of total ginseng polysaccharides was 0.0100~0.0300mg(r=0.9982);0.025~0.125mg(r=0.9996).The recovery rate of the study was 101.17%、100.74%,RSD=1.84%、1.29%.Conclusion The results of simulation indicate that this method was accurate,reliable and reproducible.It was suggested that this method can be used to determine the content of total polysaccharides and triterpenoid saponin in the GLS.Key words：GLS;Polysaccharides;Triterpenoid saponin;Determination;Ultraviolet spectrophotometry灵芝，为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝（Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst）、紫芝（Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang）的干燥子实体。
灵芝多糖的分离纯化及结构鉴定
糖开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 灵芝多糖 实验室制备[11]；Se pharose CL-6 B、
DEAE-Sephadex A-25 美国 Pharmacia 公司；Dextran T 系列 美国 Sigma 公司；苯酚、三氯乙酸、硫酸国药 集团化学试剂有限公司。 1.2 仪器与设备
从图 2 可以看出，GLPS1 经再次柱层析后得到两组 分 GLPS1a 与 GLPS1b，其中 GLPS1a 含量较大(82.24%)，
※分析检测
食品科学
2011, Vol. 32, No. 12 303
1.3.3 多糖含量及单糖组成分析 以葡萄糖为标准品，苯酚 - 硫酸法[13]测定 GLPS1a 中
多糖含量。单糖组成分析：( 1 ) 水解：将灵芝多糖样品 GLPS1a 10mg 加入 1.0mol/L H2SO4 2mL，100℃封管水解 10h，BaCO3 中和至 pH7.0，离心取上清液。(2 )衍生物 的制备：将上清液浓缩至干，分别加入 1 0 m g 肌醇、 10mg 盐酸羟胺、0.5mL 吡啶，90℃水浴 30min，加入 乙酸酐 0.5mL，乙酰化 30min，反应结束取样。(3)分析 检测：GLPS1a 进行气相分析，进样量 0.5μL；色谱条 件：OV1701 30m 柱，载气为 N2，流速 1.5mL/min，氢 火焰检测器，气化室 260℃，检测 250℃，程序升温： 180℃(3min)→ 240℃(30min)。根据标准单糖与和 GLPS1a 保留时间，确定组成单糖种类，并根据标准单糖、 GLPS1a 中单糖及内标峰面积计算物质的量比。
GLPS1a on DEAE-Sephadex A-25
由图 1 可以看出，各组分中多糖含量不同，其中 组分 GLPS1 含量最高，占总糖含量的 75.6%，GLPS2、 GLPS3 和 GLPS4 的多糖含量分别占总糖含量的 8.3%、 11.7% 和 4.4%。由于组分 GLPS1 的多糖含量最高，因 此将 GLPS1 继续纯化。GLPS1 经 Sepharose CL-6B 柱层 析结果见图 2 。
灵芝多糖实验报告
一、实验目的本研究旨在通过实验方法提取和鉴定灵芝中的多糖成分，探究灵芝多糖的提取工艺，并对提取得到的灵芝多糖进行初步的生物活性分析。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：- 灵芝子实体（赤芝或紫芝）- 乙醇、水、硫酸、蒽酮等化学试剂- 蒸馏水、无水乙醇、丙酮等溶剂- 蛋白酶、DNase等酶类- 小鼠、细胞等实验动物和细胞系2. 实验仪器：- 电子天平- 超声波清洗器- 烘箱- 离心机- 恒温水浴锅- 分光光度计- 高效液相色谱仪- 荧光显微镜等三、实验方法1. 灵芝多糖的提取：- 将灵芝子实体洗净、晾干，粉碎成粉末。
- 采用乙醇提取法，将灵芝粉末与95%乙醇按一定比例混合，在超声波清洗器中提取2小时。
- 将提取液过滤，滤液在烘箱中浓缩至一定浓度。
- 将浓缩液用无水乙醇沉淀，离心分离，收集沉淀物。
2. 灵芝多糖的鉴定：- 采用硫酸-蒽酮法对提取得到的沉淀物进行含量测定。
- 采用高效液相色谱法对提取得到的灵芝多糖进行结构分析。
3. 灵芝多糖的生物活性分析：- 采用小鼠腹腔巨细胞吞噬实验，检测灵芝多糖的免疫调节活性。
- 采用细胞实验，检测灵芝多糖对肿瘤细胞的抑制作用。
四、实验结果1. 灵芝多糖的提取：- 采用乙醇提取法，从灵芝子实体中提取得到多糖含量为10%左右。
2. 灵芝多糖的鉴定：- 硫酸-蒽酮法检测结果显示，提取得到的灵芝多糖含量较高。
- 高效液相色谱法分析结果显示，提取得到的灵芝多糖主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、鼠李糖、半乳糖等单糖组成。
3. 灵芝多糖的生物活性分析：- 小鼠腹腔巨细胞吞噬实验结果显示，灵芝多糖能够显著提高小鼠腹腔巨细胞的吞噬功能。
- 细胞实验结果显示，灵芝多糖对肿瘤细胞具有抑制作用。
五、实验讨论1. 灵芝多糖的提取工艺：- 本实验采用乙醇提取法，结果表明该方法能够有效地提取灵芝中的多糖成分。
- 在实验过程中，提取溶剂的浓度、提取时间、料液比等因素对提取率有显著影响，需要进一步优化。
紫外分光光度法测定灵芝菌丝体发酵液中多糖的含量
・科研交流・紫外分光光度法测定灵芝菌丝体发酵液中多糖的含量王 旭 邸 峰 周富荣(北京市药品检验所 北京 100035) 灵芝菌丝体发酵液为灵芝液的半成品,多糖为其中的有效成分。
多糖的含量测定方法有很多,经典法为苯酚-硫酸、蒽酮-硫酸显色的方法,其原理均为糖类遇硫酸脱水形成糠醛衍生物,与苯酚或蒽酮缩合形成有色物质进行测定。
成份利用糖类被硫酸氧化脱水生成的糠醛衍生物在紫外区有一定特征吸收的性质,采用紫外分光光度法测定了灵芝菌丝体发酵液中多糖的含量。
本方法简便快速,重现性好。
1 仪器、药品与试剂紫外分光光度计 日立U2000;电动离心沉淀机 0～4000转。
样品由北京扬格保健品厂提供;对照品:无水葡萄糖,分析纯;硫酸,优级纯北京化工厂;其他试剂均系分析纯。
2 实验方法与结果图1 紫外吸收图2.1 最大吸收波长的测定 取样品2ml ,置离心管中,加无水乙醇8m l,静置后离心,弃去上清液,沉淀加80%乙醇洗涤后,离心,取沉淀物适量与无水葡萄糖对照品适量,加硫酸置60℃水浴中加热2h ,放冷,以相应试剂为空白,在700～200nm 的波长处扫描测定吸收度,结果均在257和318nm 的波长处有最大吸收,选择在257nm 处测定,见图1。
2.2 测定条件的确定2.2.1 提取条件的选择[1] 选用80%乙醇使多糖沉淀,经检查第二次洗涤液中糖反应呈阴性,故采用80%乙醇洗涤一次。
2.2.2 显色条件的确定 选用硫酸显色法,测定温度为60℃。
取灵芝菌丝体发酵液,加4倍量无水乙醇,静置,离心,取沉淀适量,加硫酸混匀,在60℃水浴中加热,定时取样,在257nm 的波长处测定吸收度。
另取无水葡萄糖对照品适量,加硫酸同法显色测定,结果样品与对照品在2h 内反应完全,故选择显色加热时间为2h 。
2.2.3 稳定性实验 取无水葡萄糖对照品,显色后定时测定吸收度,结果在2h 内吸收度无变化,见下表。
测定时间(h)00.512吸收度0.7890.7870.7870.7882.2.4 干扰物质的测定 据文献[3]记载,80%乙醇沉淀物中伴有蛋白沉淀,蛋白与硫酸显色后在257nm 有吸收,故测定其中蛋白的干扰。
灵芝多糖的含量测定方法探讨及改进_杨瑞瑞
硫酸浓度 (%) 80
85
90
95
98
蒽酮溶解情况
稍有混浊 , 溶解 , 溶解 , 溶解 ,
混浊
及测定结果
不稳定 较稳定 较稳定 稳定
对照品溶液中加入不同浓度蒽酮溶液后 , 未加
热前 , 从 80 %到 98 %浓 度反应 程度 逐渐 加强 , 80 %硫酸配制的蒽酮 溶液反应后溶液稍有发热 , 颜色为淡黄色 , 98 %硫酸配制的蒽酮溶液反应后 溶液产热剧烈 , 溶液颜色为淡绿色 。原标准中显色 后在 625 nm测定亦为淡绿色 , 因此比较了不同浓 度硫酸配制的蒽酮溶液在水浴加热和不加热情况 下与葡萄糖的反应情况 。 2.2 加热条件对测定的影响 按标准中方法 , 取 对照品溶液 0.5 mL, 90 %硫酸蒽酮溶液水浴加热 显色后测定吸 收度 ;另取 对照品溶 液 0.5 mL, 加 98 %硫酸蒽酮溶液显色 5 min, 立即在冰水中冷却 5 min, 测定吸收度值 , 结果见表 2。
含量测定过程中 , 发现按 《中国药典 》2005年版一 部灵芝多糖含量测定方法中规定的硫酸蒽酮溶液
配制方法配制的硫酸蒽酮溶液为一混浊液 , 几乎无 法显色测定 , 试验偏差很大 , 故本文进行了探讨及 改进 。
1 仪器及试剂 岛津 UV-2100型可见 -紫外分光光度计 ;蒽
酮 (分析纯 , 国药集团化学试剂有限公司生产 );硫 酸 (分析纯 , 西安化学试剂厂生产 );无水葡萄糖对 照品 (批号 110833 -200302, 中国药品生物制品检 定所提供 );灵芝为巿售药材 。 2 实验方法
[ 4] 杨素玲 , 杜文 孝 , 等 .紫外 分光光 度法 测定 通便 灵胶 囊 番泻苷 B的 含 量 [ J] .现 代 中 医 药 , 2004, 24(1):65 -6 6. (收稿日期 :2009 -02 -18)
含糊精灵芝胶囊中多糖含量的测定方法
含糊精灵芝胶囊中多糖含量的测定方法摘要：建立了含糊精灵芝胶囊中多糖含量的测定方法。
方法采用糖化酶水解糊精，醇沉后苯酚硫酸法测定多糖含量。
对糖化酶的用量、酶解时间进行考察。
结果糖化酶水解糊精的最佳条件为:糖化酶用量0.5ml，反应时间为60min。
同时比较直接测定多糖含量与酶解糊精后测定多糖含量之间的差异。
结果直接测定多糖含量显著偏高。
糖化酶水解法可消除糊精对灵芝胶囊中多糖测定的干扰，且方法简便、稳定。
关键词：糖化酶，糊精，灵芝多糖，含量测定引言：灵芝(Ganoderma lucidum)又称灵芝草、神芝芝草、仙草、瑞草,是多孔菌科植物赤芝或紫艺的干燥子实体。
据本草纲目记载“灵芝性平,味苦，无毒，主胸中结，益心气，补中，增智慧,不忘，久服轻身不老，延年神仙”。
〔1〕灵芝胶囊由灵芝、白术、黄精等中药制成的一种保健食品。
灵芝多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抗糖尿病及其并发症、抗炎、抗菌等药理作用。
在药用资源和保健食品添加物方面具有很大的开发利用价值。
〔2〕不少保健食品添加了淀粉、糊精，一定要做相应的处理否则结果偏高。
添加淀粉的样品需加α-淀粉酶及糖化酶（如葡萄糖苷酶）处理。
添加糊精的样品需加糖化酶（如葡萄糖苷酶）处理。
处理的原则是将这类非活性多糖的碳水化合物全部酶解成单糖或低聚糖，再用乙醇沉淀所需要的活性多糖已达到分离的目的。
〔3〕本文通过对糖化酶的用量、酶解时间等实验验证手段，同时比较直接测定多糖含量与酶解糊精后测定多糖含量之间的差异，采用苯酚-硫酸法测定含糊精灵芝胶囊多糖的含量。
1实验部分1.1仪器与设备电子天平（BSA224S-CW型；BT 125D型；赛多利斯BL310型）离心机（LXJ-IIB，上海安亭科学仪器厂）漩涡震荡器（MS 3 basic型，德国IKA）紫外-可见分光光度计（UV1800型，岛津企业管理（中国）有限公司）超声波清洗机（SB25-12DTD宁波新芝生物科技股份有限公司，功率500w，频率40kHz）水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）1.2 试剂及材料浓硫酸（分析纯）；无水乙醇（分析纯）；乙醇（分析纯）；液体糖化酶（阿拉丁,Enzyme activity ≥100000（IU/ml OR u/ml））葡萄糖标准溶液（0.1mg/ml ）：取干燥至恒重的葡萄糖标准品0.020g，精密称量后加水溶解，并定容至200mL，混匀，每1mL约含0.1mg葡萄糖；苯酚溶液（50g/L）：称取重蒸苯酚5.0g，加适量水使溶解，并定容至100ml容量瓶中，混匀，置冰箱中可保存两个月；85%（V/V）乙醇配制：取无水乙醇85mL，加水定容至100mL，混匀；磷酸盐缓冲液0.2M（PH6.5）：用量筒量取94.5 ml（0.2mol/L）磷酸氢二钠和205.5 ml（0.2mol/L）磷酸二氢钠，混合均匀，即得；0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：精密称取17.90 g磷酸氢二钠于 150ml烧杯中，加入适量纯化水搅拌溶解后，转移至250ml容量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，摇匀，即得。
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灵芝多糖检测方法
1、蒽酮-硫酸法
该法为《中国人民共和国药典》规定方法，其原理是糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合而显色，其显色的深浅与灵芝多糖含量呈线性关系。
【对照品溶液的制备】精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品适量，加水制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
【标准曲线的制备】分布精密吸取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、和1.2ml，置于10ml具塞试管中，加水至2.0ml，精密加入硫酸蒽酮溶液（精密称取蒽酮0.1g，加80%的硫酸溶液100ml使溶解、摇匀）6ml，摇匀，置水浴中加热15分钟，取出，放入冰浴中冷却15分钟，以相应的试剂为白色，在紫外-可见分光光度计上，于625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
【供试品溶液的制备】精确称定灵芝粉末1g，置蒸馏瓶中，加水40ml，沸水回流提取1小时，重复1次，两次提取液均转移至100ml容量瓶中，定容，摇匀。
取40ml加200ml无水乙醇沉淀，过夜。
4000rpm离心20分钟。
沉淀定容至50ml，摇匀。
【样品测定】精确量取供试品溶液2ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入硫酸蒽酮溶液6ml”起，依法测定吸光度。
【换算因子的测定】精密称取GL-pp10.3mg与10.4mg，分别置于100ml 容量瓶中加蒸馏水定容至刻度，作为多糖供试液。
精密吸取2ml，按照标准曲线项下的方法测定吸光度，计算出多糖溶液中葡萄糖含量的平均值，并计算出换算因子：f=W/CD，式中W为多糖量（ug），C为多糖溶液中葡萄糖含量，D 为多糖的稀释因素。
测定结果为f=2.0428（n=6）
【计算】S=f×n/N×100%
S—灵芝子实体中多糖百分含量；
n—从标准曲线上读出供试品溶液中多糖浓度（以标准葡萄糖计）；
N—供试品溶液浓度；
f—换算因子；
2、苯酚-硫酸法
苯酚硫酸试剂可与寡糖、多糖起显色反应，其吸收值与糖含量呈线性关系。
【对照品溶液的制备】精确称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖20mg，置500ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，即得每1ml含0.04mg的溶液。
【标准曲线的绘制】分布精密吸取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml和1.6ml，分别以水补至2.0ml，需加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,静置10分钟，摇匀，室温放置20分钟，于紫外-可见分光光度计490nm测光密度，以水为空白，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
【供试品溶液的制备】精确称定灵芝粉末1g，置蒸馏瓶中，加水40ml，沸水回流提取1小时，重复1次，两次提取液均转移至100ml容量瓶中，定容，摇匀。
取40ml加200ml无水乙醇沉淀，过夜。
4000rpm离心20分钟。
沉淀定容至50ml，摇匀。
【样品测定】精确量取供试品溶液2ml，置10ml具塞管中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml”起，依法测定吸光度。
【换算因素的测定】精密称取GL-pp10.3mg与10.4mg，分别置于100ml 容量瓶中加蒸馏水定容至刻度，作为多糖供试液。
精密吸取2ml，按照标准曲线项下的方法测定吸光度，计算出多糖溶液中葡萄糖含量的平均值，并计算出换算因子：f=W/CD，式中W为多糖量（ug），C为多糖溶液中葡萄糖含量，D 为多糖的稀释因素。
测定结果为f=2.0428（n=6）
【计算】S=f×n/N×100%
S—灵芝子实体中多糖百分含量；
n—从标准曲线上读出供试品溶液中多糖浓度（以标准葡萄糖计）；
N—供试品溶液浓度；
f—换算因子；
灵芝多糖来源有三种：灵芝子实体多糖、灵芝菌丝体多糖及灵芝发酵液多糖。
多糖大多具有提高免疫功能的作用，这与灵芝滋补强壮、扶正固本的作用是一致的。
认为多糖和三萜的含量做为栽培和野生灵芝及其相关制剂的质量控制标准。