细胞间粘附分子_1在血管内皮细胞冻融损伤中的作用

3收稿日期:2005203210;修回日期:2005212222
作者简介:刘嘉瀛(19432),男,天津市人,研究员,硕士,从事冻伤发病机制及防治研究。

　△在本研究工作中起同样作用
细胞间粘附分子21在血管内皮细胞冻融损伤中的作用3
刘嘉瀛△,单秋玲△,杨增仁,颜培华,孙方人
(军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津300050)
摘要　目的:探讨血管内皮细胞(V EC )表面细胞间粘附分子21(ICAM 21)在V EC 冻融损伤中的作用,以阐明冻融损伤的发病机制。

方法:以大鼠主动脉V EC 和大鼠外周血嗜中性粒细胞(PMN )为材料,使用WK L 2Ⅴ型速率冷冻仪冷冻V EC 然后在水浴中复温,制备V EC 冻融模型。

采用免疫组化法测定V EC 冻融后4、12和24h 其表面ICAM 21的表达;将冻融V EC 与正常PMN 共同孵育后,以rose bengal 染色法测定冻融V EC 与PMN 粘附,测定培养液中LDL 活性确定V EC 损伤程度。

结果:冻融后4h ,V EC 表面ICAM 21表达阳性率由冻融前的13.2%±3.6%增加至22.3%±4.4%,冻后12h 达高峰(37.9%±2.5%)。

冻融V EC 与PMN 共同孵育后,V EC 2PMN 粘附由对照组的0.204±0.025增加至0.363±0.022(P <0.01),培养液中LDH 活性由对照组的104.64±20.14U/L 增加至162.33±27.88U/L (P <0.01);ICAM 21Mab 可部分阻断冻融V EC 2PMN 粘附(0.270±0.021,P <0.01),且使培养液中LDH 活性降低至125.39±22.26U/L (P <0.05)。

结论:冻融可诱发V EC 表面ICAM 21的表达,进而增强V EC 2PMN 粘附而导致V EC 损伤。

关键词:　细胞间粘附分子21(ICAM 21);　血管内皮细胞(V EC );　嗜中性粒细胞(PMN );　冻融损伤;　缺血/再灌注(I/R )
中图分类号:R363.2;R392.1文献标识码:A 文章编号:100026834(2006)022*******
研究表明,组织冻结及冻结组织融化时引起的冻融损伤类似于缺血/再灌注(ischemia/reperfu 2sion ,I/R )损伤,冻融损伤与I/R 损伤的发病机制非常类似[1～3]。

冷冻首先损伤血管内皮细胞(vascular endothelial cells ,V EC )[4],进而引起血液循环障碍,最终导致组织坏死,因此V EC 损伤在冻伤发病中有重要作用。

研究还表明,I/R 引起的V EC 损伤与V EC 2PMN 粘附有密切关系,细胞间粘附分子21(in 2tercellular adhesion molecule 21,ICAM 21)参与了V EC 2PMN 粘附[5]。

冻融可使PMN 表面L FA 21表
达增多,促进V EC 2PMN 粘附、加重V EC 损伤[6]。

由此推测,冻融所致V EC 损伤可能涉及冻融直接或间接激活V EC 2PMN 粘附,ICAM 21介导的V EC 2PMN 粘附在V EC 冻融损伤中可能起着重要作用。

本文拟通过体外实验,观察冻融后V EC 表面ICAM 21表达、V EC 2PMN 粘附及V EC 损伤的变化,
明确ICAM 21在V EC 冻融损伤中的作用,进而阐明冻融损伤的发病机制。

1　材料与方法
1.1　主要试剂
M199培养基、phorbol 122myristate 2132acetate (PMA )、concanavalin A (Con A )为Sigma 产品,Dex 2tran T500为Pharmacia 产品,Histostain TM 2SP 试剂
盒为ZYM ED 产品。

含小鼠抗大鼠ICAM 21单克隆抗体(anti 2ICAM 21monoclonal antibody ,ICAM 21Mab )的无细胞腹水由第二军医大学长海医院沈茜
教授惠赠。

其余均为国产分析纯试剂。

1.2　ICAM 21Mab 的纯化与活性测定
按辛酸2硫酸铵法分离ICAM 21Mab ,浓度为5.87g/L 。

按T amatani 等[7]方法测定ICAM 21Mab 活性为5mg/L ,即完全阻断PMA 诱导的C onA 激活的脾单个核细胞凝集所需最低ICAM 21Mab 浓度。

1.3　VEC 培养及冻融VEC 模型的建立
按组织贴块法[8]在37℃、5%CO 2培养箱(美国NAPCO 27100)中培养大鼠主动脉原代V EC ,并作传代培养。

形态学观察及V EC 特异性Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定证实培养细胞为V EC 。

本实验使用5～15代V EC 。

按颜培华等法[9],使用W K L 2Ⅴ型速率冷冻仪(军事医学科学院仪器厂)建立V EC 冻融模型,即以2℃/min 速度使V EC 降温至4℃、维持5min ;再以1℃/min 速度降温至-20℃,维持15min ;立即移至37℃水浴中复温10min 。

1.4　PMN 的分离
使用淋巴细胞分离液(1.077g/ml )和5%Dex 2
tran T500,按密度梯度离心法分离Wistar 大鼠外周
血PMN 。

台盼蓝染色表明PMN 存活率大于95%,瑞氏染色证实PMN 纯度大于90%。

以下均使用含
10%胎牛血清的M199培养液,在37℃、5%CO2条件下培养PMN。

1.5　VEC表面ICAM21表达的测定
VEC(1×106cells/2ml)接种入12孔板,孔内放盖玻片,37℃培养24h。

随机分为正常VEC组、TNF2α诱导VEC组和冻融VEC组。

TNF2α诱导VEC系用终浓度5×105U/L TNF2α于37℃培养12h。

VEC 冻融后置37℃培养4h、12h或24h,采用免疫组化SABC法检测ICAM21表达阳性率。

一抗为100mg/ L小鼠抗大鼠ICAM21Mab,二抗为生物素化羊抗小鼠IgG,实验用辣根过氧化物酶标记链霉卵白素, DAB2H2O2显色。

取正常VEC生长盖玻片,分别以0.01mol/L PBS(pH7.4)和100mg/L小鼠抗大鼠LFA21Mab代替ICAM21Mab作为阴性对照组和抗体对照组。

使用图像分析系统处理免疫组化结果。

1.6　冻融VEC与正常PMN粘附的测定
V EC(1×104cells/100μl)接种于96孔板,37℃培养24h。

随机分为正常V EC+PMN组、TNF2α诱导V EC+PMN组和冻融V EC+PMN组,各组设
,各4个复孔。

TNF2α诱导V EC和冻融V EC的处理同“V EC表面ICAM21表达的测定”。

各组加正常PMN(1×105cells/100μl)37℃培养1h;抗体阻断组先加ICAM21Mab10μg(100μl)37℃培养1h封闭V EC表面ICAM21,弃培养液并用生理盐水淋洗后再加正常PMN37℃培养1h。

弃培养液,用生理盐水洗2次去除未粘附细胞。

每孔加0.25%rose bengal100μl室温染色10min。

弃染液后用生理盐水洗2次,再用0.01mol/L PBS2 95%乙醇(V∶V=1∶1)200μl脱色30min。

使用酶联免疫仪检测A570nm,取平均值。

1.7　冻融VEC培养液中乳酸脱氢酶活性的测定
用96孔板培养24h的V EC(1×104cells/ 100μl)随机分为正常V EC组和冻融V EC组,各组再分为-PMN组、+PMN组和抗体阻断组,各3个复孔。

抗体阻断组加ICAM21Mab10μl(11μg)封闭V EC表面的ICAM21,-PMN组和+PMN组各加M199培养液10μl,37℃培养1h。

+PMN组和抗体阻断组再加PMN悬液40μl(1×105cells), -PMN组加M199培养液40μl,再培养5h。

离心后,取50μl培养液用LDH2L试剂盒(北京中生生物工程高技术公司)测定乳酸脱氢酶(lactate dehydro2 genase,LDH)活性。

1.8　数据处理
实验结果以均数±标准差(珔x±s)表示,各组间均数比较采用方差齐性t检验。

2　结果
2.1　冻融对V EC表面ICAM21表达的影响
正常V EC组ICAM21表达阳性率为13.2%±3.6%,TNF2α诱导V EC组ICAM21明显高表达(34.5%±3.0%),表明实验方法可靠。

冻融后4h, V EC表面ICAM21表达阳性率较正常V EC组明显增高(P<0.01);冻融后12h,ICAM21表达阳性率(37.9%±2.5%)达高峰,明显高于正常V EC组和冻融4h组(P<0.01);冻融后12h与24h,ICAM2 1表达阳性率无明显差异,提示冻融后V EC表面ICAM21表达增多(图1)。

2.2　冻融和ICAM21M ab对VE C2PMN粘附的影响
TNF2α诱导V EC+PMN组V EC2PMN粘附较正常V EC+PMN组明显增强(P<0.01),用ICAM21Mab封闭V EC可使TNF2α诱导V EC+ PMN组细胞粘附明显减弱,提示实验结果可信(表1)。

与正常V EC+PMN组相比,冻融V EC+PMN 组V EC2PMN粘附明显增强(P<0.01);预先用ICAM21Mab处理V EC可使冻融V EC2PMN粘附明显减弱(P<0.01),但尚未恢复至正常V EC+ PMN组水平(P<0.01)。

提示V EC冻融后V EC2 PMN粘附增强,冻融V EC表面ICAM21表达增多介导了这一过程,可能还有其他细胞粘附分子参与冻融V EC2PMN粘附。

Fig11　Changes in ICAM21expression on the surface of the V EC at different time after V EC were frozen/thawed(珔x
±s,n=7)
33　P<0.01vs control V EC;##　P<0.01vs V EC at4h after
frozen/thawed
T ab.1　E ffects of V EC frozen/thawed on adhesion of V EC to PMN(珔x±s,n=8) Group
A570nm
Without ICAM21Mab With ICAM21Mab Normal V EC+PMN 0.204±0.025 0.177±0.040
Frozen/Thawed V EC+PMN0.363±0.022330.270±0.021##
TNF2αinduced V EC+PMN0.397±0.02533#0.281±0.012△△
33　P<0.01vs normal V EC+PMN without ICAM21Mab;#P<0.05,##　P<0.01vs frozen/thawed V EC+PMN without ICAM21Mab;
△△
　P<0.01vs TNF2αinduced V EC+PMN without ICAM21Mab
2.3　冻融和ICAM21Mab对VEC损伤的影响
V EC破坏时,细胞内乳酸脱氢酶(LDH)渗漏到细胞外,培养液中LDH活性高低直接反映V EC的损伤程度。

无PMN存在时,冻融V EC培养液中LDH活性明显高于正常V EC组,这是冻结时冰晶形成及渗透压改变直接造成的V EC物理损伤。

加入PMN不影响正常V EC培养液中LDH活性,但可使冻融V EC培养液中LDH活性增高55.1%(P <0.01),提示PMN参与了冻融所致V EC损伤。

预先使用ICAM21Mab封闭冻融V EC,可使冻融V EC+PMN培养液中LDH活性降低22.8%(P< 0.01),与冻融V EC组无明显差异,提示V EC表面的ICAM21介导了PMN所致V EC损伤(表2)。

T ab.2　E ffects of V EC frozen/thawed on LDH activity in nutrient solution(珔x±s,n=8)
Group
LDH activity(U/L)
Without PMN With PMN With PMN and ICAM21Mab
Normal V EC 31.37±4.49 39.17±5.1433 33.82±4.95 Frozen/Thawed V EC104.64±20.1433162.33±27.88##△△125.39±22.26▲ 33P<0.01vs the group of normal V EC without PMN;　##　P<0.01vs the group of frozen/thawed V EC without PMN;
△△P<0.01vs the group of normal V EC with PMN;　▲P<0.05vs the group of frozen/thawed V EC with PMN
3　讨论
冻伤形成包括组织冻结和冻结组织复温融化两个阶段。

组织缓慢冻结过程中形成的冰晶体可造成细胞损伤,而且冰晶体形成造成的细胞脱水、细胞内高渗透压和p H值改变直接影响细胞内酶活性、蛋白质的稳定、细胞代谢和离子交换等,直至导致细胞死亡。

本实验中无PMN存在时,冻融V EC培养液中LDH活性明显增高即冻结造成的V EC直接损伤。

1989年Das等[1]提出冻融损伤类似于I/R损伤,活体微循环观察也证实这一观点。

目前认为,I/ R损伤的起始环节是V EC和PMN表面细胞粘附分子表达增强,使V EC2PMN紧密粘附所致。

介导V EC2PMN紧密粘附的是V EC表面的ICAM21、ICAM22和PMN表面的L FA21、Mac21[5,10]。

在体实验中,用单克隆抗体封闭CD18(L FA21与Mac21共同的糖蛋白亚基)可使兔冻足水肿和坏死明显减轻[11];体外实验中用单克隆抗体封闭PMN表面L FA21可减轻V EC损伤[6],提示L FA21和Mac21参与了V EC冻融损伤。

ICAM21是L FA21和Mac21的相应配体,推测在冻融过程中ICAM21表达上调并参与V EC损伤。

本文证实,冻融后4h V EC表面ICAM21表达明显增强,冻融后12h和24h ICAM21表达进一步增强,提示单独冻融这一物理刺激即可触发V EC表面ICAM21表达上调,ICAM21表达上调的机制尚待进一步研究。

本文观察到:VEC冻融后,冻融VEC与PMN粘附增强;预先用ICAM21Mab处理冻融VEC可明显抑制冻融VEC与PMN粘附,提示冻融VEC表面ICAM21表达增多介导了粘附过程。

单独冻融VEC时PMN未受冻融刺激,可排除冻融导致PMN表面LFA21表达增强的可能。

冻融VEC与PMN粘附增强可能是VEC表面ICAM21表达增强所致,尚不能排除ICAM21表达增强诱导PMN表面LFA21表达上调的可能,即配体和受体之间可能存在相互诱导作用。

许多实验证实PMN参与了冻融损伤。

Eiseman 对经氮芥处理出现白细胞减少症的白兔作冷冻处理,其组织丢失由对照组的71%减少至40%。

本实验证实,PMN不损伤正常V EC,但明显加重冻融V EC损伤,即PMN参与了冻融所致V EC损伤。

预先用ICAM21Mab处理冻融V EC可明显减轻PMN 引起的V EC损伤,表明ICAM21介导了PMN所致
V EC损伤,阻断V EC2PMN粘附即可减轻V EC损伤。

这与秋水仙碱不能阻断PMN2V EC粘附,因而不能减少受冻兔耳组织丢失是一致的。

ICAM21 Mab减轻V EC损伤的机制可能是阻断V EC2PMN 粘附,抑制粘附后V EC内过氧化物水平增高,从而减轻V EC损伤。

综上所述,冻融可上调V EC表面ICAM21表达,进而促进V EC2PMN粘附,导致V EC损伤。

ICAM2 1Mab通过封闭V EC表面的ICAM21,阻断V EC2 PMN粘附,减轻V EC损伤,即ICAM21在V EC冻融损伤中起重要作用。

使用ICAM21Mab干预ICAM21介导的V EC2PMN粘附有可能成为冻融损伤治疗的新靶点。

4　参考文献
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R OLE OF CE LL U LAR AD HESION MOLECU LE ICAM21IN FREEZING/THAWING INJUR Y OF VASCU LAR
EN DOTHE LIAL CE LLS
L IU Jia2ying,SHAN Qiu2ling,YAN G Zeng2ren,YAN Pei2hua,SUN Fang2ren
(Institute of Health and Environmental Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Tianjin300050,China)
ABSTRACT
Aim:To investigate the role of ICMA21on the surface of vascular endothelial cell(V EC)in freezing/thawing injury of V EC,in order to elucidate the pathogenesis of freezing/thawing injury.Methods:V EC separated and cultured from rat aorta and PMN sepa2 rated from rat peripheral blood were selected as experiment materials.The frozen/thawed V EC model was founded by freezing V EC with the type WK L2Ⅴrate cooling instrument and then rewarming them in a water bath.ICAM21expression on the surface of frozen/thawed V EC was detected at4、12and24h after freezing/thawing with immunohistochemical method.After coincubating frozen/thawed V EC with normal PMN,the adhesion of V EC to PMN was monitored with rose bengal staining assay and the injury level of V EC was indicated by measuring LDH activity in nutrient solution.R esults:The ICAM21expression on the surface of V EC increased from13.2%±3.6%before freezing/thawing of V EC to22.3%±4.4%at4hour after freezing/thawing,and reached the peak(37.9%±2.5%)at12hour after freezing/thawing of V EC.After coincubation of frozen/thawed V EC with normal PMN,the adherence of frozen/thawed V EC to PMN increased from group control0.204±0.025to0.363±0.022(P<0.01),LDH activity in nutrient solution increased from group control104.64±20.14U/L to162.33±27.88U/L(P<0.01),monoclonal antibody a2 gainst ICAM21(ICAM21Mab)could partially block the adherence of frozen/thawed V EC to PMN(0.270±0.021,P<0.01),and diminish LDH activity in nutrient solution(125.39±22.26U/L,P<0.05).Conclusion:The freezing/thawing of V EC can elicite an increase in ICAM21expression on the surface of V EC,and then proceed to V EC2PMN adherence and lead to V EC injury.
KEY WOR DS:　intercellular adhesion molecule21(ICAM21);　vascular endothelial cells(V EC);　neutrophil(PMN);　freezing/thawing injury;　ischemia/reperfusion(I/R)
不同性别及性腺功能对梭曼引起大鼠低温的影响3
杨永录1,景志敏3,李雨珊2,杨　镇2
(1.成都医学院病理生理教研室,四川成都610081;2.兰州大学八一学院,兰州730020;
3.西北民族大学医学院,甘肃兰州730030)
摘要　目的:研究不同性别及性腺功能对梭曼引起大鼠低温的影响。

方法:　用数字体温计测量大鼠的结肠温度,观察梭曼引起正常雄性和雌性大鼠低温反应的性别差异以及切除性腺后对其作用的影响。

结果:①雌性大鼠对梭曼引起的低温反应比雄鼠更敏感。

②切除雄性大鼠睾丸后能明显提高对梭曼低温反应的敏感性,而切除卵巢的雌性大鼠对梭曼的低温反应与模拟手术组无明显差异。

结论:雄性和雌性大鼠对梭曼敏感性的性别差异主要取决于睾丸的功能。

关键词:　梭曼;　低温;　性别差异
KEY WOR DS:　soman;　hypothermia;　sexual differences
中文分类号:R364.6文献标识码:A文章编号:100026834(2006)022015722
化学战剂梭曼是一种强烈不可逆的胆碱酯酶(AchE)抑制剂,可导致机体稳态系统明显紊乱,严重时可引起死亡。

近年来研究发现,亚致死剂量梭曼的毒性作用之一,可引起啮齿类动物体温快速的降低[1]。

但有机磷毒剂对动物的毒性效应有性别差异[2],其机理研究的不多。

所以本研究观察了梭曼引起雄性和雌性大鼠低温反应的性别差异以及切除性腺后对其作用的影响。

1　材料与方法
1.1　动物和试剂
实验用成年雄性和雌性Wistar大鼠(兰州军区总医院实验动物中心提供),体重190～240g,分别单笼饲养于22℃环境中,明暗时间各为12h,允许动物自由进食进水。

梭曼的纯度大于98%,用无菌生理盐水溶解。

1.2　动物手术
用5%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉(50mg/kg)动物,按照常规手术方法切除雄性大鼠的睾丸和雌性大鼠的卵巢,对照组动物进行模拟手术,每只动物完成手术后立即肌肉注射青霉素以防感染。

根据文献报道,性腺切除动物应饲养50 d后进行实验[3]。

1.3　体温测量
用WMS2121智能化高精度数字体温仪(分辨率为0. 01℃,准确度为±0.05℃,上海医用仪表厂生产)测量大鼠结肠温度,体温探头插入结肠6cm深,每次测温间隔60min。

给药前3h开始测量体温,取3个数据点作为基线体温,即为给药前的对照值。

给药后1h开始测量体温,至少要测量7次,即观察7h以上。

体温反应指标用平均体温反应曲线和体温反应最大幅度与基线体温之间的差(△T)表示。

1.4　实验分组与步骤
1.4.1　梭曼对正常雄性和雌性大鼠低温效应的观察　雄性和雌性大鼠各分2组,每组7只。

对照组:生理盐水1ml/ kg;梭曼组:梭曼60μg/kg(60μg/ml生理盐水)。

在实验前一天下午将动物移到实验室,分别单个置于鼠笼中,让动物在实验室安静过夜,随意进食进水。

上午8时开始测量结肠温度,11时皮下注射梭曼或生理盐水。

1.4.2　切除性腺对梭曼引起雄性和雌性大鼠降温作用的观察　雄性和雌性大鼠各分4组(每组7只),即模拟手术2生理盐水组、性腺切除2生理盐水组、模拟手术2梭曼组和性腺切除2梭曼组。

性腺切除和模拟手术大鼠给药时间、剂量和测温方法同上。

1.5　数据处理
实验数据用均数±标准差(珔x±s)表示,采用t检验进行统计分析。

2　结果
2.1　
梭曼引起正常雄性和雌性大鼠降温作用的差异
Fig11　Difference of hypothermia induced by soman be2 tween male and female rats(n=7)
3P<0.05,33P<0.01vs control group;#P<0.01υs
male group。